專利名稱：用于生產(chǎn)脂解酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于在里氏木霉(Trichoderma reesei)中生產(chǎn)脂解酶的方法以及可從該方法獲得的脂解酶。此外，本發(fā)明涉及木霉屬(Trichoderma)用于表達(dá)脂解酶的用途。
背景技術(shù)：
脂肪酶(EC 3. 1. 1. 3)(可定義為催化?；视退獾聂人狨ッ?是在生理上十分重要的酶，是與淀粉酶和蛋白酶一起的三種主要消化酶之一。它們將脂質(zhì)水解為甘油和脂肪酸，但也可在酯化反應(yīng)或轉(zhuǎn)酯反應(yīng)中起作用。脂肪酶在若干工業(yè)加工如油脂和脂肪的加工、去污劑生產(chǎn)、紙加工中以及在乳酪制備和烘焙工業(yè)中有應(yīng)用。WO 98/4M53公開了源于絲狀真菌塔賓曲霉(Aspergillus tubingensis)的脂解酶(及其變體)。該酶有時候稱為“脂肪酶3” WO 98/45453表征了酯酶3的若干物理化學(xué)特性。還描述了該脂解酶用于改善面包的性質(zhì)的用途，特別是，用于改善面包的性質(zhì)。WO 98/4M53還描述了酯酶3及其變體在塔賓曲霉中的克隆和表達(dá)。據(jù)發(fā)現(xiàn)，該脂解酶可在塔賓曲霉中過表達(dá)，然而該酶在塔賓曲霉中被過糖基化，這在某些情況中可降低其活性。存在對用于在商業(yè)規(guī)模上生產(chǎn)酯酶3及其變體和其他脂解酶以及利用可提供高的蛋白質(zhì)表達(dá)水平和產(chǎn)量的表達(dá)宿主的方法的需要。此外，還需要克服由于脂解酶的過糖基化而引起的酶活性降低的問題，脂解酶的過糖基化例如在其于塔賓曲霉中過表達(dá)時發(fā)生。

發(fā)明內(nèi)容
出乎意料的是，發(fā)現(xiàn)里氏木霉是脂解酶-特別是脂肪酶3及其變體以及其他脂解酶的高效表達(dá)宿主。因此，在本發(fā)明的第一個方面，提供了生產(chǎn)脂解酶的方法，該方法包括如下步驟(i)提供里氏木霉細(xì)胞，該細(xì)胞包含a)至少一條編碼脂解酶的異源核苷酸序列，所述脂解酶包含SEQ ID NO 1或SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列或與SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2具有至少40%序列同一性的氨基酸序列；和/或b)至少一條編碼脂解酶的異源核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含SEQ ID NO 3 或SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4具有至少40%序列同一性的核苷酸序列；和/或c)至少一條編碼脂解酶的異源核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含在嚴(yán)格條件下與如下序列雜交的核苷酸序列SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4或與SEQ ID NO :3或SEQ ID NO 4具有至少40%序列同一性的核苷酸序列或它們中任一者的互補(bǔ)序列；以及(ii)在允許編碼所述脂解酶的所述異源核苷酸序列表達(dá)的條件下培養(yǎng)該細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)脂解酶的方法，該方法包括如下步驟(i)用如下序列轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化里氏木霉細(xì)胞a)至少一條編碼脂解酶的異源核苷酸序列，所述脂解酶包含SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列或與SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2具有至少40%序列同一性的氨基酸序列；和/或b)至少一條編碼脂解酶的異源核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含SEQ ID NO 3 或SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4具有至少40%序列同一性的核苷酸序列；和/或c)至少一條編碼脂解酶的異源核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含在嚴(yán)格條件下與如下序列雜交的核苷酸序列SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4或與SEQ ID NO :3或SEQ ID NO 4具有至少40%序列同一性的核苷酸序列或它們中任一者的互補(bǔ)序列；(ii)在允許編碼所述脂解酶的所述異源核苷酸序列表達(dá)的條件下培養(yǎng)該細(xì)胞。在本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)脂解酶的方法，該方法包括如下步驟(i)用如下序列轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化里氏木霉細(xì)胞a)至少一條編碼脂解酶的異源核苷酸序列，所述脂解酶包含SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列或與SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2具有至少40%序列同一性的氨基酸序列；和/或b)至少一條編碼脂解酶的異源核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含SEQ ID NO 3 或SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4具有至少40%序列同一性的核苷酸序列；和/或c)至少一條編碼脂解酶的異源核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含在嚴(yán)格條件下與如下序列雜交的核苷酸序列SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4或與SEQ ID NO :3或SEQ ID NO 4具有至少40%序列同一性的核苷酸序列或它們中任一者的互補(bǔ)序列；(ii)在該細(xì)胞上重復(fù)步驟⑴以依序用至少一條⑴(a)、⑴(b)或⑴(C)中所定義的額外異源核苷酸序列(例如，如編碼脂解酶的異源核苷酸序列，該脂解酶包含SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列或與SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2具有至少40% 序列同一性的氨基酸序列)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化所述細(xì)胞；以及(iii)在允許編碼所述脂解酶的所述異源核苷酸序列表達(dá)的條件下培養(yǎng)該細(xì)胞。本發(fā)明還進(jìn)一步提供了可通過本發(fā)明方法獲得的脂解酶。本發(fā)明還提供了用于人消費的食品，該食品包含可通過本發(fā)明獲得的所述脂解酶。本發(fā)明還進(jìn)一步提供了轉(zhuǎn)化的或轉(zhuǎn)染的里氏木霉細(xì)胞，該細(xì)胞包含a)至少一條編碼脂解酶蛋白的異源核苷酸序列，該脂解酶蛋白與SEQ ID NO 1或 SEQ ID NO 2具有至少40%的序列同一性；和/或b)至少一條編碼脂解酶的異源核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含SEQ ID NO 3 或SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4具有至少40%序列同一性的核苷酸序列；和/或
c)至少一條編碼脂解酶的異源核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含在嚴(yán)格條件下與如下序列雜交的核苷酸序列SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4或與SEQ ID NO :3或SEQ ID NO 4具有至少40%序列同一性的核苷酸序列或它們中任一者的互補(bǔ)序列。在另一個方面本發(fā)明提供了表達(dá)載體，該表達(dá)載體包含i)至少一條核苷酸序列，該核苷酸序列a)編碼與SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2具有至少40%序列同一性的脂解酶蛋白； 和/或b)編碼脂解酶并且包含SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4具有至少40%序列同一性的核苷酸序列；和/或c)編碼脂解酶，其中該核苷酸序列包含在嚴(yán)格條件下與如下序列雜交的核苷酸序列SEQ ID NO :3 或 SEQ ID NO :4 或與 SEQ ID NO :3 或 SEQ ID NO :4 具有至少 40%序列同一性的核苷酸序列或它們中任一者的互補(bǔ)序列；和ii)至少一個纖維二糖水解酶啟動子，其中所述至少一條核苷酸序列處于所述至少一個纖維二糖水解酶啟動子的控制下。在本發(fā)明的另一個方面，提供了里氏木霉細(xì)胞在如下序列的表達(dá)中的用途a)至少一條編碼脂解酶的異源核苷酸序列，所述脂解酶包含SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列或與SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2具有至少40%序列同一性的氨基酸序列；和/或b)至少一條編碼脂解酶的異源核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含SEQ ID NO 3 或SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4具有至少40%序列同一性的核苷酸序列；和/或c)至少一條編碼脂解酶的異源核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含在嚴(yán)格條件下與如下序列雜交的核苷酸序列SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4或與SEQ ID NO :3或SEQ ID NO 4具有至少40%序列同一性的核苷酸序列或它們中任一者的互補(bǔ)序列；用于改善如下情況中的一種或多種脂解酶的表達(dá)、脂解酶的糖基化、酶活性或產(chǎn)量。出乎意料的是，我們已發(fā)現(xiàn)里氏木霉能夠以顯著高的產(chǎn)量產(chǎn)生脂解酶。此外，我們已發(fā)現(xiàn)，通過本發(fā)明方法生產(chǎn)的脂解酶出乎意料地沒有被過糖基化并因而具有良好的酶活性。Bradner 等人(Current Genetics,44 :224-230, (2OO3))在他們尋找此前未知的脂解酶時將里氏木霉用作表達(dá)宿主生物體。在里氏木霉中克隆并表達(dá)了來自蒜青霉 (Penicillium allii)的南極分離株的脂肪酶。Bradner等人推斷，所描述的方法將可用于尋找潛在新的脂肪酶基因，但沒有提出里氏木霉可用于蛋白質(zhì)的過表達(dá)。在另一個方面本發(fā)明提供了產(chǎn)生脂解酶的方法，該方法包括如下步驟(i)提供轉(zhuǎn)化的或轉(zhuǎn)染的里氏木霉細(xì)胞，該細(xì)胞包含至少一條編碼脂解酶的異源核苷酸序列；(ii)在允許編碼所述脂解酶的所述異源核苷酸序列表達(dá)的條件下于pH 4至pH 5. 5下培養(yǎng)該細(xì)胞；(iii)在pH 5. 5至pH 6. 5下分離、純化或濃縮培養(yǎng)基中的該酶。
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在該方面，優(yōu)選脂解酶a)包含SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列或包含與SEQ ID NO 1 或SEQ ID NO 2具有至少40%序列同一性的氨基酸序列；和/或b)由包含SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4所示序列或包含與SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4具有至少40%序列同一性的核苷酸序列的核苷酸編碼；和/或c)由包含在嚴(yán)格條件下與如下序列雜交的核苷酸序列的核苷酸序列編碼SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4或與SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4具有至少40%序列同一性的核苷酸序列或它們中任一者的互補(bǔ)序列。
具體實施例方式優(yōu)選地，異源核苷酸序列可操作地連接(直接或間接連接)至啟動子序列，使得該異源核苷酸序列處于啟動子序列的控制下。啟動子序列可以是任何合適的啟動子-例如天然與編碼脂解酶的核苷酸序列相關(guān)聯(lián)的啟動子和/或異源啟動子，例如纖維二糖水解酶1啟動子序列或Tef啟動子或葡萄糖淀粉酶啟動子?？蓪⒀苌詓tp (系列號為12/193,614的美國專利)、cbh2、egll、egl2、 gpdl基因的其他木霉啟動子序列連接至脂解酶的核苷酸序列。對于一些實施方案，編碼脂解酶的核苷酸序列可包括一個或多個內(nèi)含子。對于一些實施方案，編碼脂解酶的核苷酸序列是基因組序列。對于一些實施方案，編碼脂解酶的核苷酸序列是cDNA序列。本發(fā)明的方法可包括分離和/或純化和/或回收脂解酶的額外步驟。對于一些實施方案，所表達(dá)的脂解酶的水平足夠高而使得可利用該酶已分泌進(jìn)其中的液體培養(yǎng)基(優(yōu)選移除細(xì)胞后)或濃縮形式的液體培養(yǎng)基(優(yōu)選移除細(xì)胞后)。因而，在一個優(yōu)選的方面，本發(fā)明的方法包括后面的分離和/或純化和/或回收脂解酶的額外步驟。在一個更優(yōu)選的方面，本發(fā)明的方法包括后面的從該酶已分泌進(jìn)其中的培養(yǎng)基 (例如發(fā)酵液)移除細(xì)胞的額外步驟。在一個更優(yōu)選的方面，本發(fā)明的方法包括后面的從該酶已分泌進(jìn)其中的培養(yǎng)基 (例如發(fā)酵液)移除細(xì)胞；然后濃縮該培養(yǎng)基的額外步驟?？赏ㄟ^合適的分離技術(shù)-例如合適的過濾技術(shù)和/或離心技術(shù)，從培養(yǎng)基移除細(xì)胞。一個具體的實例是利用超濾來制備UFC (超濾濃縮物)。在一個實施方案中，用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基的pH為約pH 4至約5. 5，優(yōu)選約pH 4。在一個實施方案中，用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基的pH為約pH 4。在一個優(yōu)選的實施方案中，在該酶的分離和/或純化和/或濃縮之前，當(dāng)分泌的可溶性酶達(dá)到足夠水平時在發(fā)酵操作結(jié)束時提高培養(yǎng)基的PH。在一個實施方案中，用于分離和/或純化和/或濃縮該酶的培養(yǎng)基的PH高于pH 5. 5 至約 pH 6. 5。因而，在一個實施方案中，用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基的pH為約4，然后提高培養(yǎng)基的pH使得用于分離和/或純化和/或濃縮該酶的培養(yǎng)基的PH高于pH 5. 5至約pH 6. 5。 因而，在一個實施方案中，用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基的pH為約4，然后提高培養(yǎng)基的pH使得用于分離和/或純化和/或濃縮該酶的培養(yǎng)基的PH高于pH 6至約pH 6. 5。在一個優(yōu)選的實施方案中，用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基的pH為約4. 5，然后提高培養(yǎng)基的 PH使得用于分離和/或純化和/或濃縮該酶的培養(yǎng)基的PH為約pH 6。優(yōu)選地，里氏木霉細(xì)胞通過利用電穿孔，例如通過WO 2008/153712 A2中描述的電穿孔方法，用所述核苷酸序列對其進(jìn)行轉(zhuǎn)化而提供，或轉(zhuǎn)化有所述核苷酸序列。在另一個實施方案中，里氏木霉細(xì)胞可通過利用基因槍轉(zhuǎn)化用所述核苷酸對其進(jìn)行轉(zhuǎn)化而提供，或可轉(zhuǎn)化有所述核苷酸序列。合適地，在里氏木霉細(xì)胞中可存在至少一條編碼脂解酶的異源核苷酸序列。在一些實施方案中，在里氏木霉細(xì)胞中可存在兩個或更多個拷貝(即多拷貝)的所述或每一種編碼根據(jù)本發(fā)明的脂解酶的異源核苷酸序列。例如，在一個實施方案中，在里氏木霉中可存在至少兩條編碼脂解酶的核苷酸序列。在其它實施方案中，可存在至少三條，例如四條，例如至少五條，或例如至少六條編碼所述脂解酶的異源核苷酸序列。合適地，在里氏木霉細(xì)胞中可以有最多約六條，優(yōu)選最多約七條，優(yōu)選最多約八條，優(yōu)選最多約十條編碼所述脂解酶的異源核苷酸序列。在一些實施方案中，每一條異源核苷酸序列與啟動子相關(guān)聯(lián)或處于啟動子的控制下。合適地，每一條異源核苷酸序列可具有與之相關(guān)聯(lián)的獨立啟動子或可處于該啟動子的控制下。所述啟動子可以相同或者不同。因而，在一個實施方案中，里氏木霉細(xì)胞可包含或轉(zhuǎn)染有或轉(zhuǎn)化有至少2條編碼脂解酶的異源核苷酸序列。在另一個實施方案中，里氏木霉細(xì)胞可包含或轉(zhuǎn)染有或轉(zhuǎn)化有至少3條，或至少4條，或至少5條或至少6條編碼脂解酶的異源核苷酸序列。在一個實施方案中，有最多約6條編碼根據(jù)本發(fā)明的脂解酶的異源核苷酸序列。在一些實施方案中，可有最多約10條編碼根據(jù)本發(fā)明的脂解酶的異源核苷酸序列。在一些實施方案中，每一條異源核苷酸序列與啟動子相關(guān)聯(lián)或處于啟動子的控制下。合適地，每一條異源核苷酸序列可具有與之相關(guān)聯(lián)的獨立啟動子或可處于該啟動子的控制下。合適地，所述(或每一條)異源核苷酸序列可包含編碼信號肽的核苷酸序列，該編碼所述信號肽的核苷酸序列可操作地連接至編碼所述脂解酶的所述核苷酸序列。如果有多條異源核苷酸序列并且其中不止一條具有與之關(guān)聯(lián)的信號序列，則該信號序列可以相同或不同。合適地，脂解酶可包含內(nèi)源或外源信號肽。當(dāng)信號肽是內(nèi)源的時，其意指該信號肽是當(dāng)天然產(chǎn)生時與該脂解酶天然連接的信號肽。例如，信號肽可以是塔賓曲霉中的信號肽， 該信號肽在存在于塔賓曲霉中時與脂解酶天然連接。本文所用的術(shù)語“異源”意指在天然情況下其不會出現(xiàn)在里氏木霉細(xì)胞中。換句話講，其對里氏木霉細(xì)胞而言是外來的。例如，本文所用的術(shù)語“異源核苷酸序列，，意指在天然情況下該核苷酸序列不會出現(xiàn)在里氏木霉細(xì)胞中。換句話講，該核苷酸序列對里氏木霉細(xì)胞而言是外來的。該術(shù)語還包括多個拷貝的天然存在的序列，照此而言額外的多拷貝將會是異源的。在一個實施方案中，優(yōu)選地，異源核苷酸序列獲自或可獲自微生物，特別是真菌。
在一個實施方案中，優(yōu)選地，異源核苷酸序列獲自或可獲自曲霉屬，特別是塔賓曲
毒ο 在本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)脂解酶的方法，該方法包括如下步
1驟(i)提供里氏木霉細(xì)胞，該細(xì)胞包含a)至少一條編碼脂解酶的異源核苷酸序列，所述脂解酶包含SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列或與SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2具有至少40%序列同一性的氨基酸序列；和/或b)至少一條編碼脂解酶的異源核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含SEQ ID NO 3 或SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4具有至少40%序列同一性的核苷酸序列；和/或c)至少一條編碼脂解酶的異源核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含在嚴(yán)格條件下與如下序列雜交的核苷酸序列SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4或與SEQ ID NO :3或SEQ ID NO 4具有至少40%序列同一性的核苷酸序列或它們中任一者的互補(bǔ)序列；以及(ii)在允許編碼所述脂解酶的所述異源核苷酸序列表達(dá)的條件下培養(yǎng)該細(xì)胞； 并且其中所述里氏木霉細(xì)胞有至少兩個編碼非脂解酶的基因受抑制。在本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)脂解酶的方法，該方法包括如下步驟(i)用如下序列轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化里氏木霉細(xì)胞a)至少一條編碼脂解酶的異源核苷酸序列，所述脂解酶包含SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列或與SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2具有至少40%序列同一性的氨基酸序列；和/或b)至少一條編碼脂解酶的異源核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含SEQ ID NO 3 或SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4具有至少40%序列同一性的核苷酸序列；和/或c)至少一條編碼脂解酶的異源核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含在嚴(yán)格條件下與如下序列雜交的核苷酸序列SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4或與SEQ ID NO :3或SEQ ID NO 4具有至少40%序列同一性的核苷酸序列或它們中任一者的互補(bǔ)序列；(ii)在允許編碼所述脂解酶的所述異源核苷酸序列表達(dá)的條件下培養(yǎng)該細(xì)胞； 并且其中所述里氏木霉細(xì)胞有至少兩個編碼非脂解酶的基因受抑制。在本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)脂解酶的方法，該方法包括如下步驟(i)用如下序列轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化里氏木霉細(xì)胞a)至少一條編碼脂解酶的異源核苷酸序列，所述脂解酶包含SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列或與SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2具有至少30%序列同一性的氨基酸序列；和/或b)至少一條編碼脂解酶的異源核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含SEQ ID NO 3 或SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4具有至少40%序列同一性的核苷酸序列；和/或C)至少一條編碼脂解酶的異源核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含在嚴(yán)格條件下與如下序列雜交的核苷酸序列SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4或與SEQ ID NO :3或SEQ ID NO 4具有至少40%序列同一性的核苷酸序列或它們中任一者的互補(bǔ)序列；(ii)在該細(xì)胞上重復(fù)步驟⑴以依序用至少一條⑴(a)、⑴(b)或⑴(C)中所定義的額外異源核苷酸序列(例如，如編碼脂解酶的異源核苷酸序列，該脂解酶包含SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列或與SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2具有至少40% 序列同一性的氨基酸序列)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化所述細(xì)胞；以及(iii)在允許編碼所述脂解酶的所述異源核苷酸序列表達(dá)的條件下培養(yǎng)該細(xì)胞； 并且其中所述里氏木霉細(xì)胞有至少兩個編碼非脂解酶的基因受抑制。本發(fā)明還進(jìn)一步提供了可通過本發(fā)明方法獲得的脂解酶。本發(fā)明還提供了用于人消費的食品，該食品包含可通過本發(fā)明獲得的所述脂解酶。本發(fā)明還進(jìn)一步提供了轉(zhuǎn)化的或轉(zhuǎn)染的里氏木霉細(xì)胞，該細(xì)胞包含a)至少一條編碼脂解酶蛋白的異源核苷酸序列，該脂解酶蛋白與SEQ ID NO :1或 SEQ ID NO 2具有至少40%的序列同一性；和/或b)至少一條編碼脂解酶的異源核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含SEQ ID NO 3 或SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4具有至少40%序列同一性的核苷酸序列；和/或c)至少一條編碼脂解酶的異源核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含在嚴(yán)格條件下與如下序列雜交的核苷酸序列SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4或與SEQ ID NO :3或SEQ ID NO 4具有至少40%序列同一性的核苷酸序列或它們中任一者的互補(bǔ)序列；以及其中所述里氏木霉細(xì)胞有至少兩個編碼非脂解酶的基因受抑制。優(yōu)選地，至少三個編碼非脂解酶的基因受抑制。優(yōu)選地，至少四個編碼非脂解酶的基因受抑制。“受抑制”意指細(xì)胞表達(dá)的相關(guān)非脂解酶的水平與非轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染細(xì)胞的水平不相同。在一些實施方案中，“受抑制”意指細(xì)胞不表達(dá)相關(guān)的非脂解酶。該抑制可通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)(例如通過缺失)引起。優(yōu)選地，受抑制的編碼非脂解酶的基因中的至少一種是纖維素酶基因。優(yōu)選地，受抑制的編碼非脂解酶的基因中的至少兩種是纖維素酶基因。受抑制的編碼非脂解酶的基因中的至少一種的實例是編碼纖維二糖水解酶的基因(例如CBHI或CBHII)。受抑制的編碼非脂解酶的基因中的至少一種的另一個實例是編碼內(nèi)葡聚糖酶的基因(例如EGI和EGII)。在一些實施方案中，本發(fā)明的里氏木霉細(xì)胞是其中編碼一種或兩種纖維二糖水解酶的內(nèi)源基因(CBHI和CBHII)和/或編碼內(nèi)葡聚糖酶的內(nèi)源基因(EGI和EGII)中的一種或二者缺失或被破壞的細(xì)胞。合適地，里氏木霉細(xì)胞可以是非GMM細(xì)胞或其衍生物，例如RL-P37株的衍生物。合適地，里氏木霉細(xì)胞可以是使用實施例10中列出的方法產(chǎn)生的 RL-P37株的衍生物。在一些實施方案中，異源核苷酸序列可編碼脂解酶，該脂解酶包含與如下序列具有至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、 至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %或至少98 %的序列同一性的氨基酸序列SEQ ID NO :1或SEQ ID No. 2或與SEQ ID NO :1或SEQ ID No. 2相比包含
一個或數(shù)個氨基酸添加、缺失或置換的序列。在一些實施方案中，異源核苷酸序列可編碼脂解酶并且包含與如下序列具有至少 30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少 70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %或至少98 %序列同一性的核苷酸序列SEQ ID NO :3或SEQ ID No. 4或與SEQ ID NO :3或SEQ ID No. 4相比包含一個或數(shù)個核苷酸添加、缺失或置換的序列。優(yōu)選地，異源核苷酸序列可編碼脂解酶，該脂解酶包含與如下序列具有至少40%、 至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%的序列同一性的氨基酸序列SEQ ID N0:1或SEQ ID No. 2或與SEQ ID NO :1或SEQ ID No. 2相比包含一個或數(shù)個氨基酸添加、缺失或置換的序列。優(yōu)選地，異源核苷酸序列可編碼脂解酶，該脂解酶包含與如下序列具有至少40%、 至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%的序列同一性的核苷酸序列SEQ ID NO :3或SEQ ID No. 4或與SEQ ID NO :3或SEQ ID No. 4相比包含一個或數(shù)個核苷酸添加、缺失或置換的序列。多種脂解酶與具有SEQ ID NO :3中所示序列的來自塔賓曲霉的脂肪酶(在本文中也稱為脂肪酶幻的氨基酸序列同一性在下表1中示出。表1-與來自塔賓曲霉的脂解酶(脂肪酶3)具有序列同一件的脂解酶。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生脂解酶的方法，所述方法包括如下步驟(i)提供轉(zhuǎn)化的或轉(zhuǎn)染的里氏木霉細(xì)胞，所述細(xì)胞包含a)至少一條編碼脂解酶的異源核苷酸序列，所述脂解酶包含SEQID NO :1或SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列或與SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2具有至少40%序列同一性的氨基酸序列；和/或b)至少一條編碼脂解酶的異源核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含SEQID N0:3或 SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4具有至少40%序列同一性的核苷酸序列；和/或c)至少一條編碼脂解酶的異源核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含在嚴(yán)格條件下與如下序列雜交的核苷酸序列SEQ ID NO :3或SEQ ID NO 4或與SEQ ID NO :3或SEQ ID NO 4具有至少40%序列同一性的核苷酸序列或它們中任一者的互補(bǔ)序列；以及( )在允許編碼所述脂解酶的所述異源核苷酸序列表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞。
2.—種產(chǎn)生脂解酶的方法，所述方法包括如下步驟(i)用如下序列轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化里氏木霉細(xì)胞a)至少一條編碼脂解酶的異源核苷酸序列，所述脂解酶包含SEQID NO :1或SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列或與SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2具有至少40%序列同一性的氨基酸序列；和/或b)至少一條編碼脂解酶的異源核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含SEQID N0:3或 SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4具有至少40%序列同一性的核苷酸序列；和/或c)至少一條編碼脂解酶的異源核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含在嚴(yán)格條件下與如下序列雜交的核苷酸序列SEQ ID NO :3或SEQ ID NO 4或與SEQ ID NO :3或SEQ ID NO 4具有至少40%序列同一性的核苷酸序列或它們中任一者的互補(bǔ)序列；( )任選在所述細(xì)胞上重復(fù)步驟⑴以依序用至少一條⑴(a)、(i) (b)或(i) (c)中所定義的額外異源核苷酸序列轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化所述細(xì)胞；以及(iii)在允許編碼所述脂解酶的所述異源核苷酸序列表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的方法，其中所述異源核苷酸序列還包含啟動子序列，所述啟動子序列是纖維二糖水解酶啟動子序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的方法，其中所述脂解酶以至少20g/升培養(yǎng)物上清液的量產(chǎn)生。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述方法包括濃縮和/或分離和/或回收所述脂解酶的額外步驟。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述里氏木霉細(xì)胞通過用所述核苷酸序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染里氏木霉細(xì)胞制備。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述里氏木霉細(xì)胞通過利用基因槍轉(zhuǎn)化用所述核苷酸序列對其進(jìn)行轉(zhuǎn)化而提供或所述里氏木霉細(xì)胞利用基因槍轉(zhuǎn)化而轉(zhuǎn)化有所述核苷酸序列。
8.一種脂解酶，所述脂解酶可通過前述權(quán)利要求中任一項所述的方法獲得。
9.一種食品，所述食品包含根據(jù)權(quán)利要求8的所述脂解酶。
10.一種里氏木霉細(xì)胞，所述細(xì)胞包含a)至少一條編碼脂解酶蛋白的異源核苷酸序列，所述脂解酶蛋白與SEQID N0:1或 SEQ ID NO 2具有至少40%的序列同一性；和/或b)至少一條編碼脂解酶的異源核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含SEQID N0:3或 SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4具有至少40%序列同一性的核苷酸序列；和/或c)至少一條編碼脂解酶的異源核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含在嚴(yán)格條件下與如下序列雜交的核苷酸序列SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4或與SEQ ID NO :3或SEQ ID NO 4具有至少40%序列同一性的核苷酸序列或它們中任一者的互補(bǔ)序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的里氏木霉細(xì)胞，其中所述細(xì)胞包含至少兩條(如至少三條， 如至少四條，如至少五條或如至少六條)編碼所述脂解酶的異源核苷酸序列。
12.—種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含i)至少一條核苷酸序列，所述核苷酸序列a)編碼與SEQID NO :1或SEQ ID NO :2具有至少40%序列同一性的脂解酶蛋白；和/或b)編碼脂解酶并且包含SEQID NO :3或SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4具有至少40%序列同一性的核苷酸序列；和/或c)編碼脂解酶，其中所述核苷酸序列包含在嚴(yán)格條件下與如下序列雜交的核苷酸序列SEQ ID NO :3 或 SEQ ID NO :4 或與 SEQ ID NO :3 或 SEQ ID NO :4 具有至少 40%序列同一性的核苷酸序列或它們中任一者的互補(bǔ)序列；和 )至少一個纖維二糖水解酶啟動子，其中所述至少一條核苷酸序列處于所述至少一個纖維二糖水解酶啟動子的控制下。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的表達(dá)載體，其中所述載體還包含編碼信號肽的核苷酸序列，所述編碼所述信號肽的核苷酸序列可操作地連接至編碼所述脂解酶的所述核苷酸序列。
14.里氏木霉細(xì)胞在表達(dá)如下序列中的用途a)至少一條編碼脂解酶的異源核苷酸序列，所述脂解酶包含SEQID NO :1或SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列或與SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2具有至少40%序列同一性的氨基酸序列；和/或b)至少一條編碼脂解酶的異源核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含SEQID N0:3或 SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4具有至少40%序列同一性的核苷酸序列；和/或c)至少一條編碼脂解酶的異源核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含在嚴(yán)格條件下與如下序列雜交的核苷酸序列SEQ ID NO :3或SEQ ID NO 4或與SEQ ID NO :3或SEQ ID NO 4具有至少40%序列同一性的核苷酸序列或它們中任一者的互補(bǔ)序列；用于改善如下情況中的一種或多種脂解酶的表達(dá)、脂解酶的糖基化、酶活性或產(chǎn)量。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項所述的發(fā)明，其中所述里氏木霉細(xì)胞包含一種或多種受抑制的編碼非脂解酶的基因，優(yōu)選兩種或更多種受抑制的編碼非脂解酶的基因，優(yōu)選三種或更多種受抑制的編碼非脂解酶的基因，優(yōu)選四種或更多種受抑制的編碼非脂解酶的基因。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的發(fā)明，其中所述受抑制的編碼非脂解酶的基因中的至少一種或每一種為受抑制的編碼纖維素酶的基因。
17.根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項所述的發(fā)明，其中在所述核苷酸序列表達(dá)后將所述里氏木霉細(xì)胞從所述酶已分泌進(jìn)其中的培養(yǎng)基移除。
18.根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項所述的發(fā)明，其中在所述核苷酸序列表達(dá)后將所述里氏木霉細(xì)胞從所述酶已分泌進(jìn)其中的培養(yǎng)基移除；然后濃縮所述無細(xì)胞的培養(yǎng)基。
19.根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項所述的發(fā)明，其中在一段時間以產(chǎn)生足夠水平的所述分泌的酶之后且在分離和/或純化和/或濃縮所述酶之前升高所述酶分泌進(jìn)其中的培養(yǎng)基的pH。
20.根據(jù)權(quán)利要求1至19中任一項所述的發(fā)明，其中針對在培養(yǎng)所述細(xì)胞后本發(fā)明的酶已分泌進(jìn)其中的培養(yǎng)基進(jìn)行如下步驟調(diào)節(jié)所述培養(yǎng)基的PH，用水稀釋所述培養(yǎng)基；從所述培養(yǎng)基分離出所述細(xì)胞；濃縮所述培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基是無細(xì)胞的；以及任選對所述培養(yǎng)基進(jìn)行制粒，其中所述培養(yǎng)基是無細(xì)胞的。
21.根據(jù)權(quán)利要求1至20中任一項所述的發(fā)明，其中所述酶在一種方法中使用以制備旨在用于人消費的食物或食品，所述方法包括將所述酶與合適的食物或食品成分混合。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的發(fā)明，其中所述酶處于在培養(yǎng)所述細(xì)胞后本發(fā)明的酶已分泌進(jìn)其中的培養(yǎng)基中。
23.根據(jù)權(quán)利要求21或權(quán)利要求22所述的發(fā)明，其中所述培養(yǎng)基是無細(xì)胞的。
24.根據(jù)權(quán)利要求21至23中任一項所述的發(fā)明，其中將所述培養(yǎng)基進(jìn)行濃縮。
25.根據(jù)權(quán)利要求21至M中任一項所述的發(fā)明，其中將所述培養(yǎng)基進(jìn)行制粒。
26.一種方法，所述方法是如本文結(jié)合實施例和附圖
總體描述的。
27.一種里氏木霉細(xì)胞，所述細(xì)胞是如本文結(jié)合實施例和附圖總體描述的。
28.—種表達(dá)載體，所述載體是如本文結(jié)合實施例和附圖總體描述的。
29.一種用途，所述用途是如本文結(jié)合實施例和附圖總體描述的。
30.一種產(chǎn)生脂解酶的方法，所述方法包括如下步驟(i)提供轉(zhuǎn)化的或轉(zhuǎn)染的里氏木霉細(xì)胞，所述細(xì)胞包含至少一條編碼脂解酶的異源核苷酸序列；( )在允許編碼所述脂解酶的所述異源核苷酸序列表達(dá)的條件下于PH 4至pH 5. 5下培養(yǎng)所述細(xì)胞；(iii)在pH 5. 5至pH 6. 5下分離、純化或濃縮培養(yǎng)基中的所述酶。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述脂解酶a)包含SEQID N0:1或SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列或包含與SEQ ID N0:1或SEQ ID NO 2具有至少40%序列同一性的氨基酸序列；和/或b)由包含SEQID NO 3或SEQ ID NO 4所示序列或包含與SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4具有至少40%序列同一性的核苷酸序列的核苷酸編碼；和/或c)由包含在嚴(yán)格條件下與如下序列雜交的核苷酸序列的核苷酸序列編碼SEQID NO 3或SEQ ID NO :4或與SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4具有至少40%序列同一性的核苷酸序列或它們中任一者的互補(bǔ)序列。
32. 一種方法，所述方法基本上是如本文并結(jié)合附圖描述的。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于在里氏木霉中產(chǎn)生脂解酶的方法以及可從所述方法獲得的所述脂解酶。此外，本發(fā)明涉及木霉屬用于表達(dá)脂解酶的用途。
文檔編號A23L1/305GK102439143SQ201080018179
公開日2012年5月2日 申請日期2010年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月24日
發(fā)明者C·林, M·F·伊薩克森, M·R·扎爾加希, M·沃德, R·H·羅倫特森, S·M·馬德里 申請人:丹尼斯科有限公司