專利名稱：作為癌癥標記的chk2多態(tài)型的制作方法
作為癌癥標記的CHK2多態(tài)型本發(fā)明涉及確定治療癌癥的合適療法的診斷方法。癌癥治療的必要方面是首先實現(xiàn)明確診斷。診斷提供關于疾病實際階段的信息， 這對于隨后要使用的治療類型也是決定性因素，所述治療類型為例如手術去除腫瘤和可任選的輻射和藥物治療，也可能使用物理方法(例如高熱療法)。經(jīng)典的診斷方法包括所謂的“分期(staging)”和“分級(grading)”。分期描述了腫瘤大小和其侵襲，并檢測淋巴結是否受到影響和是否存在遠處轉移灶(例如TNM分期系統(tǒng))。分級是組織學檢測腫瘤細胞， 其中較低的惡性潛能歸于高分化的腫瘤細胞而不是分化較差或去分化細胞。該分類在預測單獨個體方面受到限制，臨床經(jīng)驗顯示具有相同腫瘤階段的病人表現(xiàn)出明顯不同的疾病進程和對治療的不同反應，這在極端變化的存活階段最清楚。由于此原因，臨床實踐需要提供額外和更確切的、能改善癌癥個體預斷的標記。在乳癌病例中，其可通過將組織化學標記用于雌激素受體表達分析來實現(xiàn)。另一種方法是搜索基因缺陷，例如腫瘤抑制基因中的體細胞突變。新方法嘗試通過基因表達譜方法來預測疾病進程。癌癥治療的另一個問題是預測癌癥藥物的有效性、各最優(yōu)劑量或治療持續(xù)時間，以及預測嚴重和危險副作用的出現(xiàn)。例如，一些用伊立替康進行治療的病人受到嚴重副作用折磨的情況可歸咎于UGTlAl基因的遺傳多態(tài)性。預先基因分析能在治療開始前鑒定這類病人，并調(diào)整劑量。此外，使用以生物技術方法生產(chǎn)的藥物的療法費用較貴，未來這些療法將會限于病人，治療效能可能取決于他們各自的狀況。惡性腫瘤的基本性質癌細胞的特征是失去接觸抑制和細胞生長不受控。這種改變自發(fā)或通過有害物 (noxaeM破壞基因組的所謂致癌物質)引起。該有害物質包括許多化學物質、吸煙以及UV 光。此外，遺傳因素在癌癥發(fā)展中起到重要作用。除了不受限制的生長，在其它器官中形成 “后代腫瘤”(轉移灶)的趨勢是癌細胞的特征。轉移灶通常經(jīng)血液或淋巴管傳播。在大部分病例中，癌癥不可治愈且是致命的。治療方法旨在通過手術去除原發(fā)腫瘤和轉移灶。另外，可以用輻射治療腫瘤?？蓢L試用所謂的細胞生長抑制劑、針對特定蛋白或表面標記的抗體或免疫調(diào)節(jié)物質(細胞因子、干擾素)殺死迅速增殖的細胞或誘導調(diào)亡。確定癌癥進程的預斷因素具有很強相關性，其提供對特定治療形式的反應的信息或能用于總體預測轉移灶發(fā)生、腫瘤進展和存活。顯然，有多種單獨、未發(fā)現(xiàn)的生物變量，其確定具有獨立分期和分級的腫瘤疾病進程。這些因素包括遺傳的宿主因素。還需要發(fā)展能預測腫瘤發(fā)生的遺傳標記。此類標記用于將進一步的篩選方法(血清學、放射顯影、超聲波檢查、MRT等)關注的人適時納入。這允許在早期階段診斷和治療癌癥，早期腫瘤的恢復和存活機會顯著高于晚期腫瘤。DNA修復機制的意義由于DNA修復機制，細胞能去除DNA結構的缺陷性改變。這種DNA中的損傷可在 DNA復制中自發(fā)產(chǎn)生，或由于致突變物質、極端高溫或電離輻射的影響而產(chǎn)生。DNA損傷可導致有絲分裂的DNA復制以錯誤方式進行、蛋白質不再合成或錯誤合成或導致必要的染色體區(qū)域在雙鍵打開后被切割。如果細胞的復雜修復機制不成功，增殖和休眠的體細胞中積累的缺陷數(shù)量大幅增加，使得正常細胞功能缺損。在生殖細胞中，子代細胞不再能存活，導致細胞系失活細胞或第二或第三連續(xù)世代分別失去細胞分裂能力并死亡。在細胞周期控制中，控制蛋白能識別缺陷細胞或其DNA，并引起細胞周期停止或程序性細胞死亡(調(diào)亡)。細胞周期檢測點激酶2的意義細胞最重要的功能是維持基因組完整性。出于此原因，有許多控制機制來確保細胞周期內(nèi)所有過程被正確終止。這些控制機制稱為“檢測點m”。如該術語所示，這些是未精確定義的點，而是通過可在特定條件下起始的級聯(lián)反應。迄今已鑒定了一些細胞周期檢測點。哺乳動物中研究最充分的檢測點示于

圖1。 一方面，存在由不同細胞周期階段中的DNA損傷激活的DNA損傷檢測點。外源因素如輻射， 以及內(nèi)源性事件如自發(fā)突變均會引起該損傷。另一方面，復制檢測點通過不完整或缺陷性 DNA復制激活。紡錘體檢測點控制兩極紡錘體的形成、著絲粒的附著和著絲點結構的形成。只要這些過程未完全終止或損傷未修復，細胞向細胞周期下個階段的轉變就會受到抑制以確保維持細胞的基因組完整性。細胞周期檢測點激酶2參與細胞周期中的必要控制機制，所述機制確保傳遞到子代細胞的錯誤最少。在不同檢測點激活的相關CHK2級聯(lián)反應示于圖2。由于DNA損傷， ATM(共濟失調(diào)性毛細血管擴張，突變的)是磷酸化的，并因而被激活。ATM隨之通過在氨基酸位置68上的蘇氨酸(Thr)的磷酸化激活CHK2。此磷酸化是二聚體形成的前提條件，通過它CHK2能自身磷酸化。只有通過該方法，CHK2能以充分激活的形式存在并激活其效應物， 并通過效應物引起缺陷細胞中的細胞周期停止于Gl、S或G2/M期、DNA修復系統(tǒng)激活或調(diào)亡。CHK2的效應物包括p53 (腫瘤蛋白5 ，其通過CHK2在絲氨酸(kr) 20磷酸化并從而穩(wěn)定。然后，P53正調(diào)節(jié)參與DNA損傷修復、調(diào)亡、控制細胞周期的因子。BRCAl (乳腺癌1基因)也屬于CHK2底物。它通過CHK2在kr988磷酸化，并因而從與CHK2的復合體中釋放，隨之引起細胞周期終止以修復損傷的DNA。⑶C25C(細胞分裂周期25C)也通過CHK2 在磷酸化，而其自身磷酸酶活性被抑制且以細胞質方式降解。在此情況中，Cdkl (細胞周期蛋白依賴性激酶1)不能被激活，因而避免了具有受損DNA的細胞進入有絲分裂。此外，⑶C25A通過CHK2在磷酸化，之后其被泛素化并以蛋白酶體依賴性方式降解。該蛋白對細胞周期中的細胞進程起到重要作用，然而其受到降解抑制。CHK2在DNA損傷起始的信號轉導中發(fā)揮重要作用。通過產(chǎn)生敲除小鼠分析CHK2 的生理學重要性。Chk2_A以及Chk2+小鼠可存活。然而，用亞致死劑量(8Gy)輻射后，它們表現(xiàn)出不同長度的存活期野生型和Chk2_/+小鼠的平均存活期顯著低于Chk2+小鼠。因此，Chk2+小鼠顯示由輻射誘導的調(diào)亡率降低引起的抗輻射性。雖然Chk2+小鼠中的G2/M 檢測點不受影響，G1/S檢測點盡管能夠誘導但不能維持。這使得p53的轉錄活性減小。此外，腫瘤僅在Chk2+小鼠中發(fā)展，與具有至少一個功能性Chk2等位基因的小鼠相反。因此，本發(fā)明所要解決的問題是提供一種能改進對癌癥自然史和對任何治療形式反應的預斷的方法。具體而言，此方法還應能用于鑒別其DNA修復機制增強使得癌癥治療變難的病人。通過用于預測發(fā)生癌癥的風險、疾病進程、在癌癥治療中的藥物效果和藥物相關風險的體外方法解決此問題，其中搜索病人樣品中人染色體22ql2. 1上CHK2基因啟動子區(qū)域中的一個或多個基因修飾，所述基因修飾選自多態(tài)型(polymorphism， 德文 polymorphismus)-7161G > Α、多態(tài)型-72;35C > G、多態(tài)型-10532G > A 和多態(tài)型-10649-(-10621)del29ο用于上述目標的上述多態(tài)型的應用也是本發(fā)明的主題。因此，本發(fā)明旨在a.提供基因CHK2啟動子中改變功能的基因組多態(tài)性，其引起蛋白表達改變或引起剪接變體表達改變，或b.適合在基因CHK2中分別發(fā)現(xiàn)和/或確認更多的多態(tài)型或單體型，c.提供適合預測疾病總體風險和進程的多態(tài)型，d.提供適合預測對藥物和癌癥治療總體反應和副作用的多態(tài)型，特別是對CHK2 抑制劑，e.提供適合預測其它治療形式(如輻射、高溫、低溫)總體效果的多態(tài)型。由于CHK2對于維持基因組完整性的基礎性意義，此類多態(tài)型適合預測癌癥情況中總體疾病風險和/或疾病進程和/或預測所有藥物或非藥理療法的治療反應/治療失敗或不利的副作用。基因CHK2啟動子中多態(tài)型的檢測已知基因CHK2啟動子區(qū)域中的3種多態(tài)型，它們可在通常能進入的數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)。通過系統(tǒng)測序人的DNA樣品，檢測和確認了這3種多態(tài)型-7161G > A(rs2236141)、-7235C > G(rs2236142)和-10532G > A(rs5762767)(圖 5)。出于此目的， CHK2啟動子區(qū)域的基因序列通過PCR反應擴增并用桑格(Sanger)的方法測序。本領域技術人員熟知為此目的必需的方法，例如獲得PCR反應所需的引物對和選擇測序引物。在本文中，發(fā)現(xiàn)缺失四個堿基對(-10649-(-10621) del29，無dbSNP ID)的新多態(tài)型(圖5)。對這些SNP進行編號，從而數(shù)字+1分配給起始密碼子ATG的核苷酸A。由于理解了數(shù)字0不存在，數(shù)字-1分配給起始密碼子ATG的A之前的核苷酸。根據(jù)本發(fā)明中多態(tài)型的用途來檢測這些多態(tài)型，可通過本領域技術人員已知的任何方法進行，例如直接測序、PCR和之后的限制性分析、反向雜交、斑點印跡或槽印跡法、質譜、Taqmantg^ LightCycler 技術、Pyrosequencing 、Invader· 技術、液態(tài)芯片(Luminex)
方法。此外，這些基因多態(tài)型可通過多路雜交和雜交于DNA芯片在同時檢測。原則上，人體所有細胞均可以惡性形式產(chǎn)生并引起癌癥。此處和下文的解釋描述了腫瘤進展、轉移和治療反應的總體機制。在此方面，本文所述機制和權利要求涉及所有人腫瘤。以下僅作為例子列出。泌尿生殖道腫瘤，如腎細胞癌、前列腺癌和精原細胞瘤；女性生殖系統(tǒng)腫瘤，如乳癌、子宮體癌、卵巢癌、宮頸癌；胃腸道腫瘤，如口腔、食管癌、胃癌、肝癌、膽管癌、胰腺癌、結腸癌、直腸癌；呼吸道腫瘤，如喉癌、支氣管癌；皮膚瘤，如惡性黑色素瘤、基底細胞癌和T細胞淋巴瘤；造血系統(tǒng)腫瘤疾病，如霍奇金和非霍奇金淋巴瘤、急性和慢性白血病、漿細胞瘤； 大腦和神經(jīng)組織各自的腫瘤疾病，如成膠質細胞瘤、神經(jīng)母細胞瘤、髓母細胞瘤、腦膜肉瘤、 星形細胞瘤以及軟組織腫瘤，如肉瘤和頭頸部腫瘤?；駽HK2
人基因GHK2位于染色體22ql2. 1 (Genebank登錄號NM_007194)且編碼在核中表達的65kD大小的蛋白質。在本文中，應指出該基因稱作“CHK2”和“CHEK2”。在下文中，使用命名“CHK2”。圖3顯示該基因結構的示意圖。已鑒定CHK2的活性啟動子區(qū)域。該啟動子區(qū)域包含許多轉錄因子SPl的結合位點，其結合加強轉錄活性。當NF-Y結合CCAAT盒時也觀察到CHK2的正調(diào)節(jié)。CHK2中的體細胞突變據(jù)認為CHK2是潛在的腫瘤抑制基因，因為它在DNA損傷后的檢測點阻滯中發(fā)揮重要作用且因為不同的腫瘤抑制基因是CHK2的底物。迄今，可以在一些患散發(fā)性腫瘤 (sporadic tumour)(例如結直腸腫瘤、肺癌、前列腺癌，乳癌)的病人以及多腫瘤表型李法美尼綜合癥(Li-Fraumeni syndrome)的病人中檢測到該基因的體細胞突變。與單核苷酸多態(tài)性(SNP)相反，這些突變例如未在相關病人的外周血細胞中發(fā)現(xiàn)。CHK2修飾引起的腫瘤疾病風險迄今，已可在一些病例中檢測到不同腫瘤疾病的CHK2中的基因修飾并將其與疾病發(fā)展的風險相關聯(lián)。這些不是常見的基因變體而是稀有突變(頻率< )，相比健康的對照組，其在病人大集合群中更常檢測到。至今，僅有一個發(fā)表的研究不僅分析這些稀有突變，也分析了經(jīng)常產(chǎn)生的SNP。在本文中，還分析了啟動子多態(tài)型_7161G>A(rs223641)與乳癌發(fā)展風險的相關性。然而，不能檢測到關聯(lián)性(Baynes等.ATM、BRCAU BRCA2、CHEK2 和TP53癌敏感性基因的常見變體不可能增加乳腺癌風險(Common variants in the ATM, BRCAl,BRCA2,CHEK2 and TP53 cancer susceptibility genes are unlikely to increase breast cancer risk). 2007Breast Cancer Res 9 :R27)。作為化學治療劑的CHK2抑制劑由于檢測點參與許多調(diào)控級聯(lián)，它們是癌癥藥物的合適靶標。檢測點蛋白的特定性質說明(1)檢測點的復雜信號轉導系統(tǒng)提供了多種攻擊靶標，⑵在健康細胞中，一些檢測點似乎僅具有很小意義，這大幅降低了抑制劑的毒性，(3)恢復缺陷檢測點可能導致細胞生長變慢，(4)對作為轉導信號的檢測點進行調(diào)整，其可能受干擾和( 恢復受損的檢測點可能增加癌細胞凋亡率，并因而提高它們對特定底物的敏感性。與這些通過基因治療方法最容易實現(xiàn)的目標相反，檢測點的2種其它性質是更易識別的靶標。具有缺陷檢測點的細胞表現(xiàn)出對輻射和細胞毒性物質的敏感性增加或抗性增加。抑制CHK2似乎在p53缺陷細胞中引起對DNA損傷劑的敏感，與此同時，它保護正常組織不受損傷并因而防止副作用。出于此原因，抑制CHK2是開發(fā)新抗癌藥物可行方法的一部分。分別已知或已開發(fā)了不同的CHK2抑制劑。目前，除了相對非特異性的抑制劑UCN-01和DBH(脫溴己炔二醇)(debromohymenialdisine)之外，也可獲得特異性有效CHK”抑制劑。它們包括CHK2抑制劑2(2-0-(4-氯苯氧基)苯基)-1Η_苯并[d]咪唑-5-羧酰胺、VRX0466617 (5- (4- G溴苯基氨基)苯基-氨基)-3-羥基-N- (1-羥基丙-2-基)異噻唑-4-甲脈(carboximidamide))和 NSC 109555 ((2E, 2' E) -2,2-(1, 1'- ，4，-羰基-二(亞氮烷基)二 G，l-亞苯基))二(乙烷-1-基-1-亞基))二(胼甲脈)((2E,2' Ε) -2,2-(1,1' -(4,4' -carbonyl-bis (azanediyl)bis (4,1-phenylene)) bis (ethane-l-yl-l-ylidene)) bis (hydrazinecarboximidamide),它們有助于減少放身寸療法中的副作用(圖4)。作為化學治療劑的CHK2激活劑然而，CHK2激活劑可以是癌癥治療中的另一個選擇。CHK2在抑制癌發(fā)生中起到作用，如果沒有DNA損傷劑存在，其激活可誘導腫瘤細胞離開增殖狀態(tài)并死亡。另外，這引起強G2阻滯。激活策略可能彌補抑制劑的劣勢腫瘤是異源的，由于此原因，僅失活單個級聯(lián)并不總是足夠的。通過過度激活維持的細胞周期機制(在許多腫瘤細胞類型中普遍)，可抵消異源性。-7161G > A, -7235C > GT,-10532G > A 和-10649- (-10621) del-29 多態(tài)型分布、 單體型的檢測和使用這些基因型以發(fā)現(xiàn)更多的相關多態(tài)型和單體型為了此目的，檢測不同白種人DNA樣品的基因型。結果示于下表
權利要求
1.一種預測癌癥風險、疾病進展、在癌癥治療中使用藥物組合物的風險和藥物組合物益處的體外方法，其特征在于，在病人樣品的人染色體22ql2. 1上的基因CHK2的啟動子區(qū)域中搜索一種或多種基因修飾，所述基因修飾選自多態(tài)型-7161G > A、多態(tài)型-7235C > G、 多態(tài)型-10532G > 八和多態(tài)型-10649-(-10621) del29ο
2.如權利要求1所述方法，其特征在于，在病人樣品中搜索所述多態(tài)型-7161G> A、-7235C > G、-10532G > A 禾口 -10649-(-10621) del29 中的 1 種、2 種、3 種或 4 種。
全文摘要
本發(fā)明涉及編碼細胞周期檢測點激酶2的人基因CHK2(CHEK2)的基因修飾用途，其用于預測癌癥風險和進展，用于預測對治療癌癥的藥理學或非藥理學治療措施的反應，用于預測藥物的不良作用。本發(fā)明還涉及提供單獨基因變體，它們有助于檢測和確認用于上述目的的更多基因修飾。這種基因修飾可包括在CHK2啟動子的位置-7161用腺嘌呤取代鳥嘌呤，在位置-7235用鳥嘌呤取代胞嘧啶，在位置-10532用腺嘌呤取代鳥嘌呤，或在位置-10621到-10649缺失29個堿基對。
文檔編號C12Q1/68GK102341507SQ201080011412
公開日2012年2月1日 申請日期2010年3月8日 優(yōu)先權日2009年3月6日
發(fā)明者K·里曼, W·西費爾 申請人:杜伊斯堡-艾森大學