專利名稱：：細胞培養(yǎng)方法、細胞培養(yǎng)裝置、容器內(nèi)的計數(shù)對象物的計數(shù)方法及計數(shù)用裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于培養(yǎng)細胞、組織、微生物等的細胞的細胞培養(yǎng)方法、細胞培養(yǎng)裝置以及容器內(nèi)的計數(shù)對象物的計數(shù)方法、計數(shù)用裝置。
背景技術(shù)：
：近年來，在醫(yī)藥品的生產(chǎn)、基因治療、再生醫(yī)療、免疫療法等領(lǐng)域中，要求在人工的環(huán)境下高效、大量地培養(yǎng)細胞、組織、微生物等。在這種細胞的大量培養(yǎng)中，特別是在培養(yǎng)懸浮細胞時，通常使用具備攪拌翼的培養(yǎng)槽的攪拌培養(yǎng)是較為普遍的。但是，特別是在容易受到外力損傷的細胞或者邊形成凝聚塊邊增殖的細胞的情況下，廣泛應(yīng)用不使用攪拌翼而將細胞封入培養(yǎng)容器中，靜置(細胞沉到底面的狀態(tài)下)，進行培養(yǎng)，隨著細胞的增殖，轉(zhuǎn)移到底面積較大的容器中或者增加容器個數(shù)的方法。但是，在該靜置培養(yǎng)中，存在當細胞凝聚塊隨著細胞的增殖而增大時，對各細胞的氧氣和營養(yǎng)成分的供給逐漸變得不足，增殖效率下降的問題。另外，在轉(zhuǎn)移容器時，雖然會先攪拌培養(yǎng)液而使氧氣和營養(yǎng)成分的不均消除，但是，存在因每次轉(zhuǎn)移操作時對細胞產(chǎn)生的損傷而使增殖效率下降的問題。另一方面，也廣泛進行時常對培養(yǎng)容器進行攪拌的振蕩培養(yǎng)。例如，根據(jù)專利文獻1中所述的細胞培養(yǎng)裝置，能夠以旋轉(zhuǎn)、振蕩等各種模式使裝載培養(yǎng)容器的臺運動，從而能夠?qū)ε囵B(yǎng)容器內(nèi)的培養(yǎng)液進行攪拌。另外，專利文獻2和專利文獻3中所述的細胞培養(yǎng)裝置采用如下機制使培養(yǎng)容器內(nèi)的液體培養(yǎng)基以不產(chǎn)生氣泡的方式進行振蕩，通過波動供給氧以使細胞不產(chǎn)生損傷。通過這些細胞培養(yǎng)裝置的振蕩方法，整個培養(yǎng)基被劇烈地攪拌，因此細胞各自零散地分離，氧氣和營養(yǎng)成分擴散到整體，能夠充分地供給到各細胞。另外，在這樣的細胞培養(yǎng)中，需要配合細胞的增殖將培養(yǎng)液中的細胞的密度維持在適當?shù)姆秶鷥?nèi)。即，培養(yǎng)液中的細胞密度過大時，不能供給各細胞充分的氧氣和營養(yǎng)，細胞增殖效率下降。另外，培養(yǎng)液中的細胞密度過小也得不到充分的增殖效率。因此，在細胞培養(yǎng)時，為了在培養(yǎng)中把握細胞密度，需要適當計測培養(yǎng)容器內(nèi)的培養(yǎng)液中的細胞數(shù)。例如，專利文獻4中公開了能夠配合細胞的增殖適當維持培養(yǎng)液中的細胞密度的細胞培養(yǎng)裝置。在使用這樣的細胞培養(yǎng)裝置進行細胞數(shù)的計測時，以往采用如下方法從與培養(yǎng)容器內(nèi)相連的取樣用口中采集含有培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)液，加入規(guī)定的緩沖液調(diào)節(jié)至適于測定培養(yǎng)液中的細胞的密度后，注入計數(shù)板中，通過人工或機械讀取其數(shù)量，從而計算細胞密度。另外，專利文獻5中公開了具備拍攝單元的培養(yǎng)裝置。根據(jù)該培養(yǎng)裝置，能夠定期獲取細胞圖像并保存。現(xiàn)有技術(shù)文獻專利文獻專利文獻1美國專利第5057429號公報專利文獻2國際公開2000/66706號小冊子專利文獻3日本特表2007-511231號公報專利文獻4國際公開2008/136371號小冊子專利文獻5國際公開2007/052718號小冊子
發(fā)明內(nèi)容但是，根據(jù)細胞種類的不同，細胞的增殖有時在細胞單個分散的狀態(tài)下難以進行，當各個細胞發(fā)生粘附而形成適當尺寸的凝聚塊時，增殖效率提高。具體而言，除了神經(jīng)干細胞、胚胎干細胞、肝細胞、角膜干細胞、胰島細胞等貼壁細胞之外，還可以舉出血細胞等懸浮細胞。在這樣的細胞的情況下，在以往的靜置培養(yǎng)中，每次轉(zhuǎn)移時會劇烈地攪拌培養(yǎng)容器，因此，此時細胞單個分散，存在所謂細胞的增殖效率下降的問題。另外，在利用專利文獻13中所述的細胞培養(yǎng)裝置等進行振蕩培養(yǎng)的情況下，也同樣對培養(yǎng)基整體進行劇烈的攪拌，成為細胞在培養(yǎng)基中分散懸浮的狀態(tài)，因此，細胞難以形成適當尺寸的凝聚塊，存在難以使細胞的增殖效率最佳化的問題。另外，在使用專利文獻4中所述的細胞培養(yǎng)裝置來計數(shù)培養(yǎng)液中的細胞的情況下，需要從培養(yǎng)容器內(nèi)采集培養(yǎng)液，從而使培養(yǎng)體系開放，因此，存在混入雜菌等污染的風險。另外，根據(jù)專利文獻5中所述的培養(yǎng)裝置，雖然可以獲取細胞圖像，但是難以根據(jù)該圖像準確地計測細胞數(shù)并得到細胞密度。S卩，利用專利文獻5中所述的拍攝單元對培養(yǎng)容器內(nèi)的細胞進行拍攝時，通過計測細胞圖像的細胞數(shù)并用該細胞數(shù)除以該拍攝單元的視野內(nèi)的培養(yǎng)液的容積，可以計算細胞密度。但是，在這樣直接觀察細胞容器內(nèi)的細胞的情況下，如圖M所示，當細胞的密度大而細胞重疊時，不能準確地計測細胞數(shù)。另外，當細胞的密度過小時，難以預測整體的密度，存在計算出的細胞密度的精度降低的問題。在像這樣使用拍攝單元直接計測培養(yǎng)容器內(nèi)的細胞的情況下，與使用現(xiàn)有的計數(shù)板進行實際測量的情況相比，計數(shù)板的厚度通常為0.Imm左右，與此相對培養(yǎng)容器的厚度為12cm左右，其厚度達到100200倍。因此，自拍攝單元觀察到的細胞數(shù)，即使是相同的體積密度也達到使用計數(shù)板實際測量時的100200倍。因此，培養(yǎng)容器內(nèi)的細胞多相互重疊，通過直接觀測培養(yǎng)容器內(nèi)的細胞來計測細胞數(shù)是很困難的。因此，本發(fā)明人等進行了深入研究，結(jié)果，調(diào)節(jié)培養(yǎng)容器的厚度，使自拍攝單元觀察到的細胞數(shù)達到可計測的數(shù)量后，通過直接觀測來計測培養(yǎng)容器內(nèi)的細胞數(shù)，由此成功地得到了與實測值接近的細胞密度。本發(fā)明是鑒于上述情況而完成的發(fā)明，其目的在于，提供通過進行培養(yǎng)容器內(nèi)的細胞凝聚塊的形成控制、凝聚塊的分解控制而將凝聚塊調(diào)節(jié)為適當?shù)某叽?，從而能夠提高細胞的增殖效率的細胞培養(yǎng)裝置及細胞培養(yǎng)方法。另外，本發(fā)明的目的在于，提供能夠在無需開放培養(yǎng)體系且不受增殖的細胞密度的限制的情況下在培養(yǎng)環(huán)境下的任何密度范圍內(nèi)計測細胞數(shù)的容器內(nèi)的計數(shù)對象物的計數(shù)方法及計數(shù)用裝置。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種細胞培養(yǎng)方法，使用培養(yǎng)容器進行，其特征在于，通過對培養(yǎng)容器施加外力，進行培養(yǎng)容器內(nèi)的細胞凝聚塊的形成控制和凝聚塊的分解控制的至少一方的控制，由此進行細胞的培養(yǎng)。另外，本發(fā)明的細胞培養(yǎng)裝置，為使用培養(yǎng)容器培養(yǎng)細胞的細胞培養(yǎng)裝置，其具有載置培養(yǎng)容器的裝載臺和以規(guī)定的壓入量按壓培養(yǎng)容器并能夠以規(guī)定的速度沿水平方向移動的攪拌構(gòu)件，使攪拌構(gòu)件移動而對培養(yǎng)容器施加外力，由此對培養(yǎng)容器內(nèi)的細胞凝聚塊的形成和分解的至少一方進行控制。另外，本發(fā)明的容器內(nèi)的計數(shù)對象物的計數(shù)方法，用于計測密封容器內(nèi)的液體中的計數(shù)對象物的個數(shù)，其中，調(diào)節(jié)容器的至少一部分的厚度，以被調(diào)節(jié)的范圍的至少一部分作為測定對象范圍，計測該測定對象范圍內(nèi)的計數(shù)對象物的個數(shù)。另外，本發(fā)明的容器內(nèi)的計數(shù)對象物的計數(shù)方法中，攪拌容器的液體，使液體中的計數(shù)對象物均等化后，對容器的至少一部分的厚度進行調(diào)節(jié)。另外，本發(fā)明的計數(shù)用裝置，為用于對密封容器內(nèi)的液體中的計數(shù)對象物的個數(shù)進行計測的計數(shù)用裝置，其具有裝載容器的裝載臺和將容器的包含測定對象范圍的至少一部分調(diào)節(jié)至規(guī)定厚度的調(diào)節(jié)構(gòu)件。另外，本發(fā)明的計數(shù)用裝置還可以進一步具有如下構(gòu)成具備在利用調(diào)節(jié)構(gòu)件調(diào)節(jié)容器的厚度之前對容器內(nèi)的液體進行攪拌的攪拌構(gòu)件。另外，本發(fā)明的計數(shù)用裝置還可以進一步具有如下構(gòu)成具備拍攝單元，其對容器內(nèi)的計數(shù)對象物進行拍攝；計數(shù)單元，其對拍攝到的圖像內(nèi)的計數(shù)對象物的個數(shù)進行計測；和驅(qū)動裝置，其當計數(shù)單元的計測結(jié)果為計數(shù)對象物的個數(shù)不在規(guī)定的范圍內(nèi)時，驅(qū)動調(diào)節(jié)構(gòu)件，將容器的至少一部分調(diào)節(jié)至規(guī)定的厚度，以使圖像內(nèi)的計數(shù)對象物的個數(shù)達到規(guī)定的范圍內(nèi)。發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明，在進行細胞、組織、微生物等的細胞培養(yǎng)時，能夠?qū)⒛蹓K調(diào)節(jié)至適當?shù)某叽纾瑥亩軌蛱岣呒毎脑鲋承?。另外，根?jù)本發(fā)明，能夠在不開放培養(yǎng)體系且不受增殖的細胞密度的限制的情況下計測細胞數(shù)。圖1是表示本發(fā)明的第一實施方式的細胞培養(yǎng)裝置的構(gòu)成的圖。圖2是表示本發(fā)明的第一實施方式的細胞培養(yǎng)裝置中的驅(qū)動裝置的構(gòu)成的圖。圖3是本發(fā)明的第一實施方式的細胞培養(yǎng)裝置的概略側(cè)視圖。圖4是表示本發(fā)明中的細胞凝聚塊的形成和細胞凝聚塊的分解的圖。6圖5是表示本發(fā)明的第二實施方式的細胞培養(yǎng)裝置的構(gòu)成的圖。圖6是表示本發(fā)明的第三實施方式的細胞培養(yǎng)裝置的構(gòu)成的圖。圖7是表示本發(fā)明的容器內(nèi)的計數(shù)對象物的計數(shù)方法的原理的圖。圖8是表示本發(fā)明的第四實施方式的計數(shù)用裝置的構(gòu)成的圖。圖9是表示利用本發(fā)明的第四實施方式的計數(shù)用裝置的容器的厚度調(diào)節(jié)方法(減小厚度的情況下)的圖。圖10是表示利用本發(fā)明的第四實施方式的計數(shù)用裝置的容器的厚度調(diào)節(jié)方法(增加厚度的情況下)的圖。圖11是表示本發(fā)明的第五實施方式的計數(shù)用裝置的構(gòu)成的圖。圖12是表示本發(fā)明的第六實施方式的計數(shù)用裝置的基本位置的圖。圖13是表示本發(fā)明的第六實施方式的計數(shù)用裝置的攪拌狀態(tài)的圖。圖14是表示本發(fā)明的第六實施方式的計數(shù)用裝置的厚度調(diào)節(jié)和等待沉淀的狀態(tài)(減小厚度的情況下)的圖。圖15是表示本發(fā)明的第六實施方式的計數(shù)用裝置的顯微鏡觀察狀態(tài)的圖。圖16是表示本發(fā)明的第六實施方式的計數(shù)用裝置的厚度調(diào)節(jié)和等待沉淀的狀態(tài)(增加厚度的情況下)的圖。圖17是表示使用本發(fā)明的第一實施方式的細胞培養(yǎng)裝置進行的攪拌條件的種類的圖。圖18是使用本發(fā)明的第一實施方式的細胞培養(yǎng)裝置進行的各攪拌條件下的細胞狀態(tài)的結(jié)果的歸納圖。圖19是表示本發(fā)明的實施例1-5和比較例1中使用的培養(yǎng)容器的圖。圖20是表示本發(fā)明的實施例1和比較例1中的細胞的圖像的圖。圖21是表示本發(fā)明的實施例1和比較例1的結(jié)果的圖。圖22是表示本發(fā)明的實施例25中的細胞的圖像的圖。圖23是表示本發(fā)明的實施例25的結(jié)果的圖。圖M是表示現(xiàn)有的容器內(nèi)的計數(shù)對象物的計數(shù)方法的圖。具體實施例方式以下，參考附圖對本發(fā)明的細胞培養(yǎng)方法和細胞培養(yǎng)裝置的優(yōu)選實施方式進行說明。[第一實施方式]首先，參考圖1圖4對本發(fā)明的第一實施方式進行說明。圖1是表示本實施方式的細胞培養(yǎng)裝置的構(gòu)成的圖。圖2是表示本實施方式的細胞培養(yǎng)裝置中的驅(qū)動裝置的構(gòu)成的圖。圖3是本實施方式的細胞培養(yǎng)裝置的概略側(cè)視圖。圖4是表示本發(fā)明中的細胞凝聚塊的形成和細胞凝聚塊的分解的圖。[細胞培養(yǎng)裝置10]如圖1所示，本實施方式的細胞培養(yǎng)裝置10具有培養(yǎng)容器11、裝載臺13、攪拌構(gòu)件14，培養(yǎng)容器11的收容部11-1中封入有培養(yǎng)液(培養(yǎng)基)和細胞，并連接有管12。培養(yǎng)容器11是以軟包裝材料作為材料而形成為袋狀的容器。這樣，通過使用軟包CN102348794A說明書5/16頁裝材料作為培養(yǎng)容器11的材料，可以對培養(yǎng)容器11賦予撓性、柔軟性。作為軟包裝材料，例如，可以使用日本特開2002-255277號公報(使用軟包裝材料薄膜片材的食品包裝體和食品的取出方法)、日本特開2004-323077號公報(加壓提取型的袋狀容器)中記載的軟包裝材料等。另外，培養(yǎng)容器11具有細胞培養(yǎng)所需的透氣性，并且為了能夠確認內(nèi)容物，一部分或全部具有透明性。作為滿足這樣的條件的培養(yǎng)容器的材料，可以列舉例如聚烯烴、乙烯-醋酸乙烯酯共聚物、苯乙烯類彈性體、聚酯類熱塑性彈性體、硅酮類熱塑性彈性體、硅酮橡膠等。管12用于將培養(yǎng)容器11內(nèi)的培養(yǎng)液和細胞從外部注入或者回收到外部，培養(yǎng)容器11四面的各邊進行了密封，但連接有至少2根以上的管12。其中1根用于從外部向培養(yǎng)容器11內(nèi)注入培養(yǎng)細胞、培養(yǎng)基的注入用途，另外1根用于從培養(yǎng)容器U中回收培養(yǎng)細胞、培養(yǎng)基的回收用途。另外，如圖1所示，安裝有3根管12時，第3根可以用于從培養(yǎng)容器11中將培養(yǎng)細胞、培養(yǎng)基作為樣品取出的取樣用途。作為該管12的材質(zhì)，根據(jù)使用環(huán)境適當選擇即可。例如可以使用硅酮橡膠、軟質(zhì)氯乙烯樹脂、聚丁二烯樹脂、乙烯-醋酸乙烯酯共聚物、聚氯乙烯樹脂、聚氨酯類熱塑性彈性體、聚酯類熱塑性彈性體、硅酮類熱塑性彈性體、苯乙烯類彈性體、例如SBS(苯乙烯-丁二烯-苯乙烯)、SIS(苯乙烯-異戊二烯-苯乙烯)、SEBS(苯乙烯-乙烯-丁烯-苯乙烯)、SEPS(苯乙烯-乙烯-丙烯-苯乙烯)、聚烯烴樹脂、含氟樹脂等。裝載臺13是用于在其上面載置培養(yǎng)容器11、再在該培養(yǎng)容器11的上面配設(shè)攪拌構(gòu)件14的平面的臺。在該裝載臺13的上面中，在載置培養(yǎng)容器11的部分的四角處豎立設(shè)置有固定構(gòu)件13-1。另一方面，在培養(yǎng)容器11的四角，穿設(shè)有嵌入(係入)固定構(gòu)件13-1的孔11-2。通過使各固定構(gòu)件13-1在培養(yǎng)容器11的各孔11-2中通過，可以將培養(yǎng)容器11固定設(shè)置在裝載臺13的上面。另外，可以防止培養(yǎng)容器11隨著攪拌構(gòu)件14的移動而偏移。需要說明的是，固定構(gòu)件不必限定于上述構(gòu)件，只要具有可防止培養(yǎng)容器11偏移的機構(gòu)則可以使用各種構(gòu)件。攪拌構(gòu)件14通過對培養(yǎng)容器11施加外力來控制培養(yǎng)容器11內(nèi)的細胞凝聚塊的形成和細胞凝聚塊的分解。本實施方式的細胞培養(yǎng)方法中，如圖3所示，在利用攪拌構(gòu)件14以規(guī)定的壓入量按壓培養(yǎng)容器11的同時，使該攪拌構(gòu)件14以規(guī)定的速度與裝載臺13平行地移動。該移動以規(guī)定的循環(huán)重復實行。作為該攪拌構(gòu)件14，例如可以使用輥。這樣，根據(jù)本實施方式，通過使用攪拌構(gòu)件14對培養(yǎng)容器施加外力，可以對培養(yǎng)容器11內(nèi)的攪拌進行微調(diào)節(jié)，從而能夠進行適于細胞凝聚塊形成的攪拌和適于細胞凝聚塊分解的攪拌。如圖1所示，支承臺15由軸承部和連結(jié)這些軸承部的連結(jié)部形成，所述軸承部在裝載臺13兩側(cè)的各一個部位朝向上方豎直設(shè)置，以可自由旋轉(zhuǎn)的方式對攪拌構(gòu)件14的兩端進行支承。如圖2所示，該支承臺15通過安裝于連接部下方的桿型電動氣缸17(垂直方向運動作用致動器)可上下移動，能夠以0.1毫米級精細地調(diào)節(jié)在支承臺15上安裝的攪拌構(gòu)件814對培養(yǎng)容器11的壓入量。另外，桿型電動氣缸17安裝在滑動型電動氣缸21(水平方向運動作用致動器)上的移動臺16上，相對于裝載臺13沿水平方向移動。另外，通過控制移動臺16的沿水平方向的移動速度來調(diào)節(jié)在支承臺15上安裝的攪拌構(gòu)件14的移動速度。本實施方式的細胞培養(yǎng)裝置10中的驅(qū)動裝置，具有支承臺15、移動臺16、桿型電動氣缸17、滑動型電動氣缸21等。這樣，根據(jù)本實施方式的細胞培養(yǎng)裝置10，通過使用桿型電動氣缸17和滑動型電動氣缸21來調(diào)節(jié)攪拌構(gòu)件14對培養(yǎng)容器11的壓入量、攪拌構(gòu)件14的移動速度，由此可以控制培養(yǎng)容器11內(nèi)的培養(yǎng)液的攪拌，從而能夠?qū)⒓毎蹓K的尺寸調(diào)節(jié)至最佳尺寸。需要說明的是，對于攪拌構(gòu)件的操作控制，除了使用桿型電動氣缸17、滑動型電動氣缸21這樣的電動致動器外，還可以使用利用空氣壓、油壓、電磁力的致動器或者采用使用電動機、凸輪的構(gòu)成。<細胞凝聚塊的形成>這里，如圖4所示，細胞培養(yǎng)時，根據(jù)細胞種類的不同，存在適于培養(yǎng)的細胞凝聚塊的尺寸。S卩，培養(yǎng)細胞具有如下性質(zhì)單個細胞的分裂速度低，相互粘附形成一定的凝聚塊后才開始充分的分裂。通常的靜置培養(yǎng)中，在培養(yǎng)初期的細胞密度低的狀態(tài)下，細胞通過擴散而粘附逐漸形成凝聚塊，但其速度比較慢。因此，以往在培養(yǎng)初期，例如使用微孔板強制性地使細胞在一個部位高密度地聚集而使細胞易于粘附，或者使用小容量的容器并隨著細胞的增殖而使用更大的容器，由此在防止細胞密度下降的同時進行培養(yǎng)。與此相對，在本實施方式中，通過攪拌使漂浮于培養(yǎng)容器11內(nèi)的底面的細胞積極地移動，由此提高細胞之間發(fā)生粘附的概率，從而能夠更快地形成適當尺寸的凝聚塊。由此，根據(jù)使用本實施方式的細胞培養(yǎng)裝置10的細胞培養(yǎng)方法，能夠在細胞培養(yǎng)開始時，在細胞單個分散的狀態(tài)時，使細胞接觸而促進適當尺寸的凝聚塊的形成，從而能夠提高細胞增殖效率。另外，這樣的細胞凝聚塊的形成控制并不限于培養(yǎng)的初期(接種時)，例如在細胞的培養(yǎng)中對培養(yǎng)容器11施加過度的外力、結(jié)果導致凝聚塊崩解、細胞單個分散的情況下等也適合進行，能夠提高細胞增殖效率。<細胞凝聚塊的分解>另一方面，當細胞凝聚塊過大時，凝聚塊內(nèi)部的氧氣和營養(yǎng)不足，增殖效率下降。因此，當凝聚塊巨大化時，優(yōu)選在培養(yǎng)液中產(chǎn)生強流動(湍流)以使凝聚塊分解。根據(jù)使用本實施方式的細胞培養(yǎng)裝置10的培養(yǎng)方法，當凝聚塊巨大化時，通過調(diào)節(jié)攪拌構(gòu)件14的壓入量和移動速度，以使培養(yǎng)液中產(chǎn)生強流動的方式控制攪拌，能夠使凝聚塊分解為適當?shù)某叽?。如以上所說明，根據(jù)本實施方式的細胞培養(yǎng)裝置10和使用了該裝置的細胞培養(yǎng)方法，能夠在利用攪拌構(gòu)件14以規(guī)定的壓入量按壓培養(yǎng)容器11的同時，使該攪拌構(gòu)件14以規(guī)定的速度與裝載臺13平行地移動，從而能夠適當?shù)乜刂剖┘釉谂囵B(yǎng)容器上的外力的強度。因此，能夠?qū)ε囵B(yǎng)容器11內(nèi)的攪拌進行微調(diào)節(jié)從而進行適于細胞凝聚塊形成的攪拌，并且也能夠以不使細胞單個分散的方式使凝聚塊分解，從而能夠?qū)⒓毎蹓K調(diào)節(jié)至適于增殖的尺寸。[第二實施方式]下面，參考圖5對本發(fā)明的第二實施方式進行說明。該圖5是表示本實施方式的細胞培養(yǎng)裝置的構(gòu)成的圖。本實施方式在以下方面與第一實施方式不同在使用分隔構(gòu)件將培養(yǎng)容器11分割為培養(yǎng)部和可擴張部且可根據(jù)細胞的增殖將培養(yǎng)基容積調(diào)節(jié)至適當大小的細胞培養(yǎng)裝置10中，利用攪拌構(gòu)件(攪拌輥)14可對培養(yǎng)部進行攪拌。另外，本實施方式中，培養(yǎng)容器11的兩端用夾子構(gòu)件23固定。其他方面與第一實施方式相同。S卩，如圖5所示，本實施方式的細胞培養(yǎng)裝置10，使用分隔輥(分隔構(gòu)件)22對培養(yǎng)容器11進行分割，設(shè)有封入培養(yǎng)液和細胞的培養(yǎng)部以及用于使分隔輥22移動以擴張培養(yǎng)部的容積的可擴張部。該分隔輥22與攪拌構(gòu)件(攪拌輥)14平行地設(shè)置，并能夠與裝載臺13平行地移動。通過使用這樣的分隔輥22，可以使培養(yǎng)部的容積連續(xù)地變化，通過使分隔輥22隨著細胞增殖而移動使培養(yǎng)部的容積增加，可以將細胞密度維持在適當?shù)姆秶鷥?nèi)。在該圖5的例中，采用了使用兩個分隔輥22從上下方向夾住培養(yǎng)容器11而進行分隔的構(gòu)成，但并不限定于此，也可以采用通過一個分隔輥22從上方相對于裝載臺13按壓培養(yǎng)容器11而將培養(yǎng)容器11分隔為培養(yǎng)部和可擴張部的構(gòu)成。需要說明的是，使用這樣的分隔構(gòu)件控制培養(yǎng)容積以提高培養(yǎng)效率的技術(shù)，詳細地記載在由本申請人申請的國際公開2008/136371號小冊子和國際公開2008/136339號小冊子中。根據(jù)本實施方式的細胞培養(yǎng)裝置10和使用了該裝置的細胞培養(yǎng)方法，可以使用分隔輥22控制培養(yǎng)容積的大小以獲得高細胞增殖效率，并且可以調(diào)節(jié)培養(yǎng)部中的細胞凝聚塊的尺寸以獲得高細胞增殖效率。因此，能夠進一步提高細胞的增殖效率。[第三實施方式]下面，參考圖6對本發(fā)明的第三實施方式進行說明。該圖6是表示本實施方式的細胞培養(yǎng)裝置10的構(gòu)成的圖。本實施方式在以下方面與第一實施方式不同拍攝培養(yǎng)容器11內(nèi)的細胞并自動判定凝聚塊的尺寸是否在規(guī)定的范圍內(nèi)，基于該判定結(jié)果將凝聚塊調(diào)節(jié)為適當?shù)某叽?。其他方面與第一實施方式相同。S卩，本實施方式的細胞培養(yǎng)裝置10，如圖6所示，除第一實施方式的構(gòu)成以外，還具有拍攝裝置30和控制裝置40。拍攝裝置30從控制裝置40接收到拍攝的指示信息時，對培養(yǎng)容器11內(nèi)的細胞進行拍攝，并將所得的圖像發(fā)送到控制裝置40?；谂臄z裝置30的拍攝的指示信息可以在規(guī)定的時機由控制裝置40自動發(fā)送。作為該拍攝裝置30，例如可以在相位差顯微鏡的鏡筒上安裝CXD攝像頭來使用。控制裝置40是對細胞培養(yǎng)裝置10中用于使攪拌構(gòu)件14移動的驅(qū)動裝置和拍攝裝置30進行控制的信息處理裝置。如圖6所示，控制裝置40具有拍攝裝置控制部41、凝聚塊尺寸判定部42和驅(qū)動裝置控制部43。拍攝裝置控制部41在規(guī)定的時機對拍攝裝置30發(fā)送用于進行拍攝的指示信息，并從拍攝裝置30接收拍攝到的圖像。凝聚塊尺寸判定部42在拍攝裝置控制部41接收到圖像時，判定該圖像信息中的細胞凝聚塊的尺寸是否在規(guī)定的范圍內(nèi)。作為該規(guī)定的范圍，例如可以設(shè)定為ΙΟΟμπι600μm。作為該凝聚塊的尺寸，可以使用拍攝到的凝聚塊的平均值等。然后，判定的結(jié)果是，在細胞凝聚塊的尺寸小于或大于規(guī)定范圍的情況下，將該判定結(jié)果輸出到驅(qū)動裝置控制部43。驅(qū)動裝置控制部43基于從凝聚塊尺寸判定部42輸入的判定結(jié)果，決定攪拌構(gòu)件14的壓入量、移動速度和移動的循環(huán)，根據(jù)這些驅(qū)動條件對桿型電動氣缸17和滑動型電動氣缸21進行控制。由此，在細胞凝聚塊的尺寸小于規(guī)定范圍的情況下，使培養(yǎng)容器11內(nèi)的細胞凝聚塊形成至適當?shù)某叽?，在細胞凝聚塊的尺寸大于規(guī)定范圍的情況下，使細胞凝聚塊分解至適當?shù)某叽?，由此可以調(diào)節(jié)至最適于增殖的尺寸。需要說明的是，為了進行這樣的處理，優(yōu)選控制裝置40或驅(qū)動裝置控制部43具有對應(yīng)地存儲各種凝聚塊的尺寸和適于各情況的攪拌構(gòu)件14的壓入量、移動速度和移動的循環(huán)的表格(table)等。如以上所說明的那樣，根據(jù)本實施方式的細胞培養(yǎng)裝置10和使用了該裝置的細胞培養(yǎng)方法，能夠自動地調(diào)節(jié)培養(yǎng)容器11的凝聚塊的尺寸，從而能夠穩(wěn)定地提高細胞增殖效率。下面，參考圖7對本發(fā)明的容器內(nèi)的計數(shù)對象物的計數(shù)方法的原理進行說明。該圖7是表示使用顯微鏡直接觀察培養(yǎng)容器內(nèi)的細胞并計測其數(shù)量的狀態(tài)的圖，圖7(A)表示以往那樣不調(diào)節(jié)容器的厚度而進行觀測的情況。需要說明的是，通過使用比重小于細胞比重的培養(yǎng)液，能夠使細胞沉到容器的底部而適于顯微鏡觀察。另外，相反地，也可以使用比重大的培養(yǎng)液使細胞聚集于容器的上部來進行觀察。在圖7(A)的情況下，隨著容器內(nèi)的細胞數(shù)的增加，當懸浮后靜置時，會逐漸發(fā)生重疊。因此，用該方法大量培養(yǎng)細胞時，難以準確地計測細胞數(shù)。因此，本發(fā)明中，在細胞數(shù)過多而無法準確計測的情況下，如圖7(B)所示，通過減小容器的厚度，使觀測范圍(測定對象范圍)內(nèi)的細胞數(shù)減少，從而調(diào)節(jié)至適于計測的細胞數(shù)。由此，即使在利用培養(yǎng)容器大量培養(yǎng)細胞的情況下，也可以通過直接觀察培養(yǎng)容器內(nèi)的細胞而無需開放培養(yǎng)體系來計測細胞數(shù)。另外，在培養(yǎng)容器內(nèi)的細胞數(shù)少、難以預測培養(yǎng)容器整體的密度的情況下，也可以通過增大容器的厚度，使觀測范圍內(nèi)的細胞數(shù)增加，從而調(diào)節(jié)至適于計測的細胞數(shù)。[第四實施方式]下面，參考圖8對本發(fā)明的第四實施方式的容器內(nèi)的計數(shù)對象物的計數(shù)方法和計數(shù)用裝置進行說明。該圖8是表示本實施方式的計數(shù)用裝置的構(gòu)成的圖。本實施方式的計數(shù)用裝置50，如該圖8所示，具有厚度調(diào)節(jié)構(gòu)件51、裝載臺13、拍攝單元52、驅(qū)動裝置53、驅(qū)動裝置M和照明55，將培養(yǎng)容器11配置在裝載臺13上，對培養(yǎng)容器11內(nèi)的培養(yǎng)細胞數(shù)進行計測。厚度調(diào)節(jié)構(gòu)件51用于調(diào)節(jié)裝載臺13上的培養(yǎng)容器11的厚度。在該圖8的例中，厚度調(diào)節(jié)構(gòu)件51由具有用于按壓培養(yǎng)容器11的平面部分的按壓板構(gòu)成，通過從上方按壓由軟包裝材料制成的培養(yǎng)容器11的一部分，可以減小其厚度。另外，厚度調(diào)節(jié)構(gòu)件51中至少培養(yǎng)容器11的測定對象范圍的上方部分由透明的材料形成，通過照明陽從上方照亮該部分，并通過由顯微鏡和CCD攝像頭構(gòu)成的拍攝單元52從下方進行觀察。需要說明的是，厚度調(diào)節(jié)構(gòu)件51并不限于圖8所示的通過平面部分對培養(yǎng)容器11進行按壓的按壓板，也可以使用輥、牽拉構(gòu)件而構(gòu)成。例如，利用輥從上下兩方或一方夾住培養(yǎng)容器11并移動，使培養(yǎng)容器11的水平面積減少，由此可以增加培養(yǎng)容器11的厚度。相反地，通過增加培養(yǎng)容器11的水平面積也可以減小培養(yǎng)容器11的厚度。另外，通過使用牽拉構(gòu)件沿水平方向拉伸培養(yǎng)容器11，也可以減小培養(yǎng)容器11的厚度。裝載臺13是用于載置培養(yǎng)容器11的平面的臺，與厚度調(diào)節(jié)構(gòu)件51—起構(gòu)成計數(shù)用的裝載裝置。該裝載臺13的測定對象范圍的下方部分由玻璃板56等透明的構(gòu)件構(gòu)成，通過拍攝單元52可以從下方觀測培養(yǎng)容器11。驅(qū)動裝置53如圖8所示，通過球頭螺釘使厚度調(diào)節(jié)構(gòu)件51上下移動。由此，將厚度調(diào)節(jié)構(gòu)件51向裝載臺13上的培養(yǎng)容器11按壓，從而能夠調(diào)節(jié)培養(yǎng)容器11的厚度。該驅(qū)動裝置53例如可以使用桿型電動氣缸(垂直方向運動作用致動器)，由此，能夠以0.01毫米級精細地調(diào)節(jié)培養(yǎng)容器11的厚度。另外，驅(qū)動裝置M如圖8所示，通過球頭螺釘使拍攝單元52相對于裝載臺13沿水平方向移動。通過該驅(qū)動裝置M，在對培養(yǎng)容器11內(nèi)的細胞進行拍攝時以外，使拍攝單元52配置于裝載臺13的外側(cè)，在拍攝時可以使拍攝單元52移動到培養(yǎng)容器11的測定對象范圍的下方。需要說明的是，驅(qū)動裝置53、驅(qū)動裝置M除電動致動器以外，可以使用利用空氣壓、油壓、電磁力的致動器而構(gòu)成，或者也可以使用電動機、凸輪而構(gòu)成。照明55透過厚度調(diào)節(jié)構(gòu)件51照亮培養(yǎng)容器11中的測定對象范圍，提供拍攝單元52拍攝細胞所需的亮度。另外，此時光的透射量根據(jù)調(diào)節(jié)后的培養(yǎng)液的厚度而不同，拍攝的圖像會產(chǎn)生明暗差，因此，優(yōu)選根據(jù)培養(yǎng)液的厚度進行光量的調(diào)節(jié)。培養(yǎng)容器11可以使用與第一實施方式同樣的培養(yǎng)容器。下面，參考圖9和圖10對利用本實施方式的計數(shù)用裝置調(diào)節(jié)培養(yǎng)容器11的厚度的例子進行說明。圖9表示減小容器厚度的情況，圖10表示增加容器厚度的情況。在減小培養(yǎng)容器11的厚度的情況下，容器的厚度調(diào)節(jié)除圖8所示的方式以外，例如，如圖9(a)所示，可以通過從培養(yǎng)容器11的下方按壓厚度調(diào)節(jié)構(gòu)件51來進行。需要說明的是，雖未進行圖示，此時優(yōu)選用玻璃板等將培養(yǎng)容器11的上面的位置固定。另外，在培養(yǎng)容器11由可水平拉伸的材料制成的情況下，如圖9(b)所示，也可以使用可覆蓋培養(yǎng)容器11的整個面的厚度調(diào)節(jié)構(gòu)件51按壓培養(yǎng)容器11來減小培養(yǎng)容器11的厚度。另外，如圖9(c)所示，也可以利用厚度調(diào)節(jié)構(gòu)件51拉伸培養(yǎng)容器11來減小其厚度。在該情況下，可以采用將培養(yǎng)容器11的邊緣的一端固定同時利用由牽拉構(gòu)件構(gòu)成的厚度調(diào)節(jié)構(gòu)件51牽拉水平方向相反側(cè)的邊緣的構(gòu)成，或者也可以采用通過使用兩個厚度調(diào)節(jié)構(gòu)件51牽拉培養(yǎng)容器11的水平方向的兩端來拉伸培養(yǎng)容器11的構(gòu)成。作為這樣的柔軟的培養(yǎng)容器11的材料，例如可以使用硅酮橡膠等。另外，如圖9(d)所示，也可以使用輥等作為厚度調(diào)節(jié)構(gòu)件51，通過使其移動，使培養(yǎng)容器11的水平面積增加，從而減小培養(yǎng)容器11的厚度。另一方面，在增加培養(yǎng)容器11的厚度的情況下，例如，如圖10(e)所示，可以利用厚度調(diào)節(jié)構(gòu)件51按壓培養(yǎng)容器11的上面的一部分，使培養(yǎng)容器11的被按壓部分以外的部分的厚度增加。另外，如圖10(f)所示，也可以使用輥等作為厚度調(diào)節(jié)構(gòu)件51，通過使其移動，使培養(yǎng)容器11的水平面積減小，從而增加培養(yǎng)容器11的厚度。下面，參考圖8更詳細地說明本實施方式的容器內(nèi)的計數(shù)對象物的計數(shù)方法。首先，在計測培養(yǎng)容器11內(nèi)的細胞數(shù)的步驟之前，優(yōu)選對培養(yǎng)容器11內(nèi)的培養(yǎng)液進行攪拌。需要說明的是，關(guān)于培養(yǎng)液的攪拌單元，在第五實施方式中詳細說明。然后，使用驅(qū)動裝置54，使拍攝單元52移動到培養(yǎng)容器11的測定對象范圍的下方。然后，使用驅(qū)動裝置53，使厚度調(diào)節(jié)構(gòu)件51下降，將培養(yǎng)容器11的厚度調(diào)節(jié)至規(guī)定的厚度。此時，規(guī)定的厚度可以通過細胞的種類、培養(yǎng)容器的尺寸、測定對象范圍的面積和培養(yǎng)時間等獲得各種值。然后，利用照明55照亮測定對象范圍，并利用拍攝單元52進行拍攝。然后，計數(shù)拍攝到的圖像上的細胞。此時，從拍攝單元52向計數(shù)單元發(fā)送拍攝到的圖像，由該計數(shù)單元可以自動計測細胞數(shù)。作為這樣的計數(shù)單元，可以使用公知的細胞計數(shù)分析裝置、細胞數(shù)計測裝置等。這里，本實施方式中，通過使用比重小于培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)液，使培養(yǎng)細胞沉淀到培養(yǎng)容器11的底部，通過使拍攝單元的焦點對準沉淀的細胞可以對它們進行拍攝。但是，在細胞密度大、測定對象范圍內(nèi)的細胞重疊的情況下，無法準確地計數(shù)細胞數(shù)。因此，本實施方式的容器內(nèi)的計數(shù)對象物的計數(shù)方法中，在像這樣測定對象范圍內(nèi)的細胞重疊的情況下，通過使厚度調(diào)節(jié)構(gòu)件51移動而減小培養(yǎng)容器11的厚度，從而減少計測對象的細胞數(shù)，可以計測細胞。需要說明的是，可以認為測定對象范圍中不重疊而能夠觀測的最大細胞數(shù)約為小于用測定對象范圍的面積除以培養(yǎng)細胞的平均水平面積而得到的數(shù)。因此，在細胞計數(shù)的結(jié)果是細胞數(shù)計算為該最大細胞數(shù)以上的情況下，優(yōu)選進一步減小培養(yǎng)容器11的厚度再次進行計數(shù)。另外，也可以更準確地推斷出細胞在測定對象范圍內(nèi)緊密排列時的數(shù)量，使用該推定值作為最大細胞數(shù)等，將其他值用于判斷是否進行培養(yǎng)容器11的厚度調(diào)節(jié)。另外，在細胞計數(shù)的結(jié)果為細胞數(shù)小于一定值的情況下，由于所得的細胞密度的精度降低，因此，優(yōu)選增加培養(yǎng)容器11的厚度后再次進行計數(shù)。關(guān)于這樣的使培養(yǎng)容器11的厚度增加的計測用裝置，在第六實施方式中詳細說明。如此計測測定對象范圍內(nèi)的細胞數(shù)時，通過用該細胞數(shù)除以測定對象范圍的容積，可以計算細胞密度。進而，通過用所得的細胞密度乘以培養(yǎng)容器11的容積，可以計算培養(yǎng)容器11整體的細胞數(shù)。這樣的細胞密度和培養(yǎng)容器11整體的細胞數(shù)也可以由計數(shù)單元自動地計算。這樣，根據(jù)本實施方式，即使在培養(yǎng)容器11內(nèi)的細胞數(shù)多、直接觀測培養(yǎng)容器11時無法準確地計測細胞數(shù)的情況下，也可以通過減小培養(yǎng)容器的厚度來計測細胞數(shù)，從而能夠計算培養(yǎng)容器11內(nèi)的細胞密度。[第五實施方式]下面，參考圖11和圖2對本發(fā)明的第五實施方式的容器內(nèi)的計數(shù)對象物的計數(shù)方法和計數(shù)用裝置進行說明。圖11是表示本實施方式的計數(shù)用裝置的構(gòu)成的圖。圖2是表示第一實施方式的細胞培養(yǎng)裝置中的驅(qū)動裝置(攪拌構(gòu)件用)的構(gòu)成的圖，本實施方式中也可以使用同樣的驅(qū)動裝置。本實施方式的計數(shù)用裝置，除了第四實施方式的計數(shù)用裝置的構(gòu)成以外，還具備攪拌構(gòu)件。本實施方式中，通過使用該攪拌構(gòu)件攪拌培養(yǎng)容器11內(nèi)的培養(yǎng)液，可以使細胞以易于觀測的方式分散。其他方面可以與第四實施方式同樣。攪拌構(gòu)件14通過在向培養(yǎng)容器11按壓的同時進行移動，對培養(yǎng)容器11內(nèi)的培養(yǎng)液進行攪拌，從而使培養(yǎng)液中的培養(yǎng)細胞分散。作為該攪拌構(gòu)件14，例如如圖11所示可以使用輥。在該圖11的例中，采用以下構(gòu)成通過利用攪拌構(gòu)件14以規(guī)定的壓入量按壓培養(yǎng)容器11，同時使該攪拌構(gòu)件14以規(guī)定的速度和規(guī)定的循環(huán)與裝載臺13平行地反復移動，對培養(yǎng)液進行攪拌。如圖11所示，支承臺15由在裝載臺13兩側(cè)的各一個部位朝向上方豎直設(shè)置的、可自由旋轉(zhuǎn)地支承攪拌構(gòu)件14的兩端的軸承部和連結(jié)這些軸承部的連結(jié)部形成。另外，如圖2所示，該支承臺15通過安裝于連接部下方的桿型電動氣缸17(垂直方向運動作用致動器)可上下移動，能夠以0.1毫米級精細地調(diào)節(jié)安裝于支承臺15上的攪拌構(gòu)件14對培養(yǎng)容器11的壓入量。另外，桿型電動氣缸17安裝在滑動型電動氣缸21(水平方向運動作用致動器)上的移動臺16上，相對于裝載臺13沿水平方向移動。另外，通過控制移動臺16的沿水平方向的移動速度來調(diào)節(jié)安裝于支承臺15上的攪拌構(gòu)件14的移動速度。需要說明的是，對于攪拌構(gòu)件14的操作控制，除了使用桿型電動氣缸17、滑動型電動氣缸21這樣的電動致動器外，還可以使用利用空氣壓、油壓、電磁力的致動器或者采用使用電動機、凸輪的構(gòu)成。根據(jù)本實施方式的容器內(nèi)的計數(shù)對象物的計數(shù)方法和計數(shù)用裝置，可以在計測培養(yǎng)容器11內(nèi)的細胞數(shù)之前，在以規(guī)定的壓入量向培養(yǎng)容器11按壓攪拌構(gòu)件14的狀態(tài)下，使攪拌構(gòu)件14沿水平方向進行一定時間的往返運動。由此，可以對培養(yǎng)容器11內(nèi)的培養(yǎng)液進行攪拌，從而能夠使培養(yǎng)容器11內(nèi)的培養(yǎng)細胞以易于計數(shù)的方式分散。[第六實施方式]下面，參考圖12圖16對本發(fā)明的第六實施方式的容器內(nèi)的計數(shù)對象物的計數(shù)方法和計數(shù)用裝置進行說明。這些圖是分別表示本實施方式的容器內(nèi)的計數(shù)對象物的計數(shù)方法中的計數(shù)用裝置的基本位置(圖12)、攪拌狀態(tài)(圖13)、厚度調(diào)節(jié)和等待沉淀的狀態(tài)(要減少所計數(shù)的細胞的情況下、圖14)、顯微鏡觀察狀態(tài)(圖15)、厚度調(diào)節(jié)和等待沉淀的狀態(tài)(要增加所計數(shù)的細胞的情況下、圖16)的示意圖。本實施方式的計數(shù)用裝置，除了第五實施方式的計數(shù)用裝置的構(gòu)成以外。還具備用于使培養(yǎng)容器11的厚度增加的厚度調(diào)節(jié)構(gòu)件。其他方面可以與第五實施方式同樣。以下，對于本實施方式的容器內(nèi)的計數(shù)對象物的計數(shù)方法中的計數(shù)用裝置的操作順序，將使培養(yǎng)容器11的厚度增加的操作和使培養(yǎng)容器11的厚度減少的操作包括在內(nèi)進行說明。(1)基本位置首先，參考圖12對本實施方式的計數(shù)用裝置的構(gòu)成要素的基本位置進行說明。該圖12中，在裝載臺13上設(shè)有顯微鏡觀察用的觀測孔，該觀測孔的上部鑲嵌有構(gòu)成裝載臺13的上面的一部分的玻璃板56。培養(yǎng)容器11配置在裝載臺13上，該裝載臺13的觀測孔的上方配置有厚度調(diào)節(jié)構(gòu)件51-1(按壓板)。該厚度調(diào)節(jié)構(gòu)件51-1向下方移動，按壓培養(yǎng)容器11，使其厚度減小。另外，培養(yǎng)容器11的邊緣的一端配置有厚度調(diào)節(jié)構(gòu)件51-2(輥)，通過使其移動，能夠減小培養(yǎng)容器11的水平面積，從而增加厚度。另外，培養(yǎng)容器11的上方配置有攪拌構(gòu)件14(輥)，通過使該攪拌構(gòu)件14在向下方移動而按壓到培養(yǎng)容器11上的狀態(tài)下沿水平方向移動，可以對培養(yǎng)容器11內(nèi)的培養(yǎng)液進行攪拌。另外，在基本位置時，裝載臺13的外側(cè)配置有構(gòu)成用于拍攝細胞的拍攝單元52的顯微鏡52-1和CXD攝像頭52-2以及照明55。(2)攪拌狀態(tài)下面，參考圖13對于在進行容器內(nèi)的計數(shù)對象物的個數(shù)的計數(shù)之前對培養(yǎng)容器11內(nèi)的培養(yǎng)液進行攪拌的順序進行說明。首先，使攪拌構(gòu)件14從圖12的基本位置向下方移動，以規(guī)定的壓入量按壓培養(yǎng)容器11。然后，使該攪拌構(gòu)件14以規(guī)定的速度和規(guī)定的循環(huán)與裝載臺13平行地反復移動。由此，能夠?qū)ε囵B(yǎng)容器11內(nèi)的培養(yǎng)液進行攪拌，從而使培養(yǎng)液中的細胞均等化。(3)厚度調(diào)節(jié)和等待沉淀的狀態(tài)(在減小厚度的情況下)下面，參考圖14對于使培養(yǎng)容器11的厚度減小從而使計數(shù)的細胞減少的順序進行說明。首先，使攪拌構(gòu)件14向上方移動而返回到圖12的基本位置，并使厚度調(diào)節(jié)構(gòu)件51-1向下方移動，使培養(yǎng)容器的厚度減小。此時，通過厚度調(diào)節(jié)構(gòu)件51-1對包含裝載臺13的觀測孔上的區(qū)域的培養(yǎng)容器11的一部分進行按壓，將培養(yǎng)容器11的測定對象范圍的厚度調(diào)節(jié)至規(guī)定的尺寸。此時，在培養(yǎng)環(huán)境下，培養(yǎng)容器11的厚度越小，越能夠減少計數(shù)的細胞。使培養(yǎng)容器11的厚度減小后，靜置至培養(yǎng)容器11內(nèi)的細胞進行沉淀。(4)顯微鏡觀察狀態(tài)下面，參考圖15對進行細胞計數(shù)的順序進行說明。在使培養(yǎng)容器11的厚度減小的狀態(tài)下培養(yǎng)容器11內(nèi)的細胞進行了沉淀后，如圖15所示，使由顯微鏡52-1和CXD攝像頭52-2構(gòu)成的拍攝單元52以及照明55從圖12的基本位置沿水平方向移動，使拍攝單元52配置于觀測孔的正下方，使照明55配置于觀測孔的上方。然后，通過CXD攝像頭52-2對培養(yǎng)容器11內(nèi)沉淀的細胞進行拍攝。將這樣得到的圖像輸入到未圖示的計數(shù)裝置中，通過該計數(shù)裝置測定圖像內(nèi)的細胞數(shù)，用所得的細胞數(shù)除以測定對象范圍(由CCD攝像頭52-2觀測到的培養(yǎng)容器11的區(qū)域)的容積，由此可以計算培養(yǎng)容器11內(nèi)的細胞密度。由此，即使在培養(yǎng)容器11內(nèi)的細胞增殖，在原來的厚度下沉淀時，發(fā)生重疊而無法準確地計數(shù)的情況下，也能夠通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)容器11的厚度來進行計數(shù)，從而能夠在無需開放培養(yǎng)體系的情況下計算培養(yǎng)容器11內(nèi)的細胞密度。(5)厚度調(diào)節(jié)和等待沉淀的狀態(tài)(在增加厚度的情況下)另一方面，在培養(yǎng)的初期階段等中，由于細胞數(shù)少，因此雖然可以計數(shù)，但有時所得的細胞密度的精度降低。因此，在觀測到的細胞數(shù)少的情況下，如圖16所示，使培養(yǎng)容器11的厚度增加，使測定對象范圍內(nèi)的細胞數(shù)增加后，進行中說明的顯微鏡觀察。S卩，在O)的攪拌后，使攪拌構(gòu)件14向上方移動而返回到圖12的基本位置，使由輥構(gòu)成的厚度調(diào)節(jié)構(gòu)件51-2沿測定對象范圍方向移動而對培養(yǎng)容器11進行按壓，使培養(yǎng)容器11的厚度增加。此時，為了使培養(yǎng)容器11中的測定對象范圍的厚度保持一定，使厚度調(diào)節(jié)構(gòu)件51-1移動至測定對象范圍上與培養(yǎng)容器11的上面接觸的位置。然后，靜置至培養(yǎng)容器11內(nèi)的細胞進行沉淀。由此，能夠使測定對象范圍內(nèi)的細胞數(shù)增加，在培養(yǎng)容器11內(nèi)的細胞數(shù)少的情況下，能夠更準確地計算細胞密度。培養(yǎng)容器11內(nèi)的細胞數(shù)少時的具體的細胞數(shù)，根據(jù)細胞的種類、測定對象范圍的面積等適當決定，例如可以設(shè)定為0或小于10等數(shù)。需要說明的是，按照上述(1)(5)的順序調(diào)節(jié)了培養(yǎng)容器11的厚度后，在測定對象范圍內(nèi)觀察到細胞的重疊、或者未觀察到細胞或幾乎觀察不到細胞的情況下，再次按照(1)(5)的順序調(diào)節(jié)培養(yǎng)容器11的厚度，再進行細胞數(shù)的計數(shù)。由此，根據(jù)本實施方式，在培養(yǎng)容器11內(nèi)的細胞數(shù)少、直接觀測培養(yǎng)容器11時可能得不到準確的細胞密度的情況下，通過使培養(yǎng)容器的厚度增加，能夠更準確地計算培養(yǎng)容器11內(nèi)的細胞密度。實施例下面，對使用第一實施方式的細胞培養(yǎng)裝置10進行細胞培養(yǎng)的實施例進行說明。首先，參考圖17和圖18對各種培養(yǎng)條件和各情況下的攪拌的程度進行說明。圖17是表示使用本實施方式的細胞培養(yǎng)裝置10進行的攪拌條件的種類的圖，圖18是各攪拌條件下的細胞狀態(tài)的結(jié)果的歸納圖。本發(fā)明的培養(yǎng)方法中，如圖17所示，使用攪拌構(gòu)件14從上方按壓培養(yǎng)容器11，使該攪拌構(gòu)件14相對于裝載臺13平行地移動，由此對培養(yǎng)容器11內(nèi)的培養(yǎng)基進行攪拌。將該攪拌構(gòu)件14向培養(yǎng)容器11按壓時的壓入量，可以取各種值，但例如如該圖17所示，在培養(yǎng)容器11的厚度為10.5mm的情況下，可以取2mm、4mm、6mm、8mm等值。然后，根據(jù)各壓入量分別調(diào)節(jié)攪拌構(gòu)件14的移動速度，由此將培養(yǎng)容器11內(nèi)的培養(yǎng)液的攪拌控制為適于細胞凝聚塊的形成的攪拌或適于細胞凝聚塊的分解的攪拌。作為攪拌構(gòu)件14的移動速度，例如如該圖17所示，可以取2.5mm/秒、12.5mm/秒、50mm/秒等值。需要說明的是，對攪拌構(gòu)件14的直徑?jīng)]有特別限定，但為了準確地控制攪拌，優(yōu)選相對于培養(yǎng)容器11的厚度設(shè)定為0.5倍3.0倍。圖18表示在上述的攪拌條件下進行攪拌時，培養(yǎng)容器11內(nèi)的培養(yǎng)液分別被攪拌至何種程度。如該圖18所示，壓入量為2mm且移動速度為2.5mm/秒、12.5mm/秒時和壓入量為4mm且移動速度為2.5mm/秒時，培養(yǎng)容器11內(nèi)的細胞全部為沉淀狀態(tài)。本說明書中，將這樣的攪拌稱為“弱攪拌”。通過進行這樣的“弱攪拌，，的攪拌，可以促進細胞凝聚塊的形成。另外，圖18中，當壓入量為2mm且移動速度為50mm/秒時、壓入量為4mm且移動速度為12.5mm/秒、50mm/秒時、壓入量為6mm且移動速度為2.5mm/秒、12.5mm/秒時以及壓入量為8mm且移動速度為2.5mm/秒時，培養(yǎng)容器11內(nèi)的培養(yǎng)液被攪拌至一定程度，但細胞幾乎為沉淀狀態(tài)。另外，當壓入量為6mm且移動速度為50mm/秒時和壓入量為8mm且移動速度為12.5mm/秒時，培養(yǎng)容器11內(nèi)的培養(yǎng)液被攪拌至一定程度，但細胞基本都上浮。本說明書中，將這樣的細胞為基本沉淀的狀態(tài)和基本上浮的狀態(tài)的邊界附近的攪拌條件下的攪拌稱為“中攪拌”。通過進行這樣的“中攪拌”的攪拌，可以使細胞凝聚塊不過度分解而調(diào)節(jié)為適當?shù)某叽?。另一方面，在圖18中，當壓入量為8mm且移動速度為50mm/秒時，培養(yǎng)容器11內(nèi)的培養(yǎng)液被劇烈地攪拌，細胞全部上浮。本說明書中，將這樣的細胞全部上浮的攪拌稱為“強攪拌”。這樣的“強攪拌”時，細胞凝聚塊分散地分解為單個的細胞，通過反復進行“強攪拌”，細胞成為懸浮狀態(tài)，但細胞成為單個分散的狀態(tài)時增殖效率反而下降。以往的細胞培養(yǎng)中的攪拌，通常是對培養(yǎng)容器進行劇烈的攪拌，結(jié)果相當于進行了“強攪拌”，存在導致增殖效率下降的問題，但通過本發(fā)明可以消除這樣的問題。下面，對通過本發(fā)明的容器內(nèi)的計數(shù)對象物的計數(shù)方法和計數(shù)用裝置調(diào)節(jié)培養(yǎng)容器11的厚度后計測細胞數(shù)的實施例、和不調(diào)節(jié)培養(yǎng)容器11的厚度而計測細胞數(shù)的比較例進行說明。(實施例1)作為培養(yǎng)容器11，使用了LDPE(線性低密度聚乙烯)制、膜厚0.15mm的袋。培養(yǎng)容器11如圖19所示，通過用分隔構(gòu)件(橡膠輥)進行分隔，使進行培養(yǎng)的區(qū)域即培養(yǎng)部的長邊為250mm、短邊為210mm，在該培養(yǎng)部中加入培養(yǎng)液640ml進行使用。需要說明的是，此時的培養(yǎng)容器11平置時，盡管容器上面不是完全的水平面，但容器厚度約為16mm。觀察范圍(測定對象范圍)的水平面的尺寸為邊長0.5mm的正方形。使用細胞科學研究所的AlyS505N-0培養(yǎng)基作為培養(yǎng)液，并且使用在細胞培養(yǎng)用皿(dish)中增殖為所需量的人白血病T淋巴瘤的JurkatE6.1株作為培養(yǎng)細胞。使用直徑12mm的輥作為攪拌構(gòu)件14，在壓入量13mm、速度50mm/秒、往返次數(shù)10次的攪拌條件下進行攪拌。攪拌后，立即使由寬度50mm、厚度3mm、長度大于培養(yǎng)容器11的長邊的丙烯酸樹脂板構(gòu)成的厚度調(diào)節(jié)構(gòu)件下降，將袋的厚度調(diào)節(jié)為3.1mm。然后，靜置12分鐘后，對觀測范圍進行拍攝，進行細胞數(shù)的計數(shù)。另外，根據(jù)該細胞數(shù)和觀測范圍的容積計算細胞密度。拍攝的照片示于圖20，觀測范圍內(nèi)細胞數(shù)、細胞密度、實測密度和實測值比示于圖21。需要說明的是，實測密度通過利用現(xiàn)有方法，使用計數(shù)板(OneCellCounter(OneCell公司制))計測從袋中回收的培養(yǎng)液中的細胞數(shù)，用該細胞數(shù)除以觀測范圍的容積而得到。(比較例1)使用與實施例1相同的培養(yǎng)容器11和培養(yǎng)液，在相同的攪拌條件下進行了攪拌。然后，不調(diào)節(jié)袋的厚度，靜置60分鐘后，對觀測范圍進行拍攝。由于未對袋的上面進行按壓，因此產(chǎn)生波狀的凹凸，袋的厚度約為16mm。在該情況下，可觀察到細胞的重疊，無法進行細胞數(shù)的計數(shù)，也無法進行密度的計算。其結(jié)果示于圖20、圖21。(實施例2)使用細胞密度與實施例1不同的培養(yǎng)液，并且計測細胞數(shù)時將袋的厚度設(shè)定為11.0mm、將之后的靜置時間設(shè)定為45分鐘，除此以外，與實施例1同樣地進行實驗。培養(yǎng)液和培養(yǎng)細胞的種類與實施例1相同，但在本實施例中使用培養(yǎng)細胞數(shù)比實施例1少的培養(yǎng)液。其結(jié)果示于圖22和圖23。(實施例3)除了在計測細胞數(shù)時將袋的厚度設(shè)定為7.0mm、將之后的靜置時間設(shè)定為30分鐘以外，與實施例2同樣地進行實驗。其結(jié)果示于圖22和圖23。(實施例4)除了在計測細胞數(shù)時將袋的厚度設(shè)定為4.0mm、將之后的靜置時間設(shè)定為12分鐘以外，與實施例2同樣地進行實驗。其結(jié)果示于圖22和圖23。(實施例5)除了在計測細胞數(shù)時將袋的厚度設(shè)定為3.1mm、將之后的靜置時間設(shè)定為12分鐘以外，與實施例2同樣地進行實驗。其結(jié)果示于圖22和圖23。如圖20和圖21所示，在未調(diào)節(jié)袋厚度的比較例1中，細胞發(fā)生重疊，無法準確地計數(shù)。需要說明的是，不能計數(shù)可以是實際上無法計算的情況以及計數(shù)結(jié)果為規(guī)定值(在觀測范圍內(nèi)能辨認的最大細胞數(shù))以上的情況。與此相對，在實施例1中，通過減小袋的厚度，可以計測細胞數(shù)，從而可以計算培養(yǎng)容器11內(nèi)的細胞密度。另外，如圖22和圖23所示，在實施例25中，可知隨著袋厚度的減小，所計測的細胞數(shù)減少。另外，計算得到的細胞的密度均為與實測密度相比無顯著差異的密度。因此可知，在細胞數(shù)多、無法計數(shù)的情況下，細胞密度越大時，則越多地減少袋的厚度，由此能夠?qū)毎M行計測。由這些實驗結(jié)果可知，根據(jù)使用本發(fā)明的計數(shù)用裝置的容器內(nèi)的計數(shù)對象物的計數(shù)方法，可以在無需開放培養(yǎng)體系且不受細胞密度的限制的情況下計測培養(yǎng)容器內(nèi)的細胞數(shù)，可以計算細胞密度。本發(fā)明不限于以上的實施方式，可以在本發(fā)明的范圍內(nèi)進行各種變形實施是不言而喻的。例如，可以進行以下適當變更將培養(yǎng)容器11構(gòu)成為以不產(chǎn)生角部分的方式使角變圓的形狀、或者使攪拌構(gòu)件14不為圓柱狀而使圖17所示的截面為星形等各種形狀，以獲得各種攪拌效果等。另外，在上述實施方式和實施例中，以培養(yǎng)細胞作為計測對象，但不限于此，例如也可以以浮游生物等其他有機體或無機物作為計測對象。培養(yǎng)容器內(nèi)的“液體”除培養(yǎng)液等液體外，也包括半流體。另外，可以使用比培養(yǎng)細胞的比重大的培養(yǎng)液作為培養(yǎng)容器11內(nèi)的培養(yǎng)液，由此能夠使培養(yǎng)細胞位于培養(yǎng)容器11內(nèi)的上部，從而對其進行計數(shù)。另外，在上述實施方式和實施例中，不僅可以計數(shù)細胞，也可以觀察細胞的生育狀態(tài)等。產(chǎn)業(yè)實用性本發(fā)明能夠適用于需要培養(yǎng)大量細胞的生物醫(yī)藥、再生醫(yī)療、免疫療法等領(lǐng)域。權(quán)利要求1.一種細胞培養(yǎng)方法，使用培養(yǎng)容器進行，其特征在于，通過對所述培養(yǎng)容器施加外力，進行所述培養(yǎng)容器內(nèi)的培養(yǎng)液中存在的細胞凝聚塊的形成控制和凝聚塊的分解控制的至少一方的控制，由此進行細胞的培養(yǎng)。2.如權(quán)利要求1所述的細胞培養(yǎng)方法，其特征在于，對所述培養(yǎng)容器施加外力是通過從平置的培養(yǎng)容器的上面以規(guī)定的壓入量按壓攪拌構(gòu)件、并使其以規(guī)定的速度沿水平方向移動來進行，并且，通過對所述培養(yǎng)容器施加外力，將所述培養(yǎng)容器內(nèi)的培養(yǎng)液進行攪拌，由此對所述培養(yǎng)容器內(nèi)的細胞凝聚塊的形成和分解的至少一方進行控制。3.如權(quán)利要求1或2所述的細胞培養(yǎng)方法，其特征在于，在培養(yǎng)開始時對所述培養(yǎng)容器內(nèi)接種的細胞進行所述細胞凝聚塊的形成。4.如權(quán)利要求1或2所述的細胞培養(yǎng)方法，其特征在于，通過所述細胞凝聚塊的分解，控制所述細胞凝聚塊的尺寸使其達到規(guī)定范圍內(nèi)的大5.一種細胞培養(yǎng)裝置，其特征在于，具備裝載臺，其用于載置封入有包含培養(yǎng)基和細胞的培養(yǎng)液的培養(yǎng)容器，和攪拌構(gòu)件，其以規(guī)定的壓入量按壓在所述培養(yǎng)容器上，并能夠以規(guī)定的速度沿水平方向移動；通過使所述攪拌構(gòu)件移動來攪拌所述培養(yǎng)容器內(nèi)的培養(yǎng)液，對所述培養(yǎng)容器內(nèi)的細胞凝聚塊的形成和分解的至少一方進行控制。6.如權(quán)利要求5所述的細胞培養(yǎng)裝置，其特征在于，所述攪拌構(gòu)件為輥狀。7.如權(quán)利要求5或6所述的細胞培養(yǎng)裝置，其特征在于，具備拍攝裝置，其對所述培養(yǎng)容器內(nèi)的細胞進行拍攝，判定單元，其輸入由所述拍攝裝置拍攝的圖像，并判定所述細胞凝聚塊的尺寸是否為規(guī)定范圍內(nèi)的大小，和驅(qū)動裝置，其當所述判定單元的判定結(jié)果為所述細胞凝聚塊的尺寸小于規(guī)定范圍時，使所述攪拌構(gòu)件以規(guī)定的壓入量且以規(guī)定的速度沿水平方向移動從而使所述細胞凝聚塊形成，另外，當所述判定單元的判定結(jié)果為所述細胞凝聚塊的尺寸大于規(guī)定范圍時，使所述攪拌構(gòu)件以規(guī)定的壓入量且以規(guī)定的速度沿水平方向移動從而使所述細胞凝聚塊分解。8.如權(quán)利要求57中任一項所述的細胞培養(yǎng)裝置，其特征在于，具備分隔構(gòu)件，所述分隔構(gòu)件將所述培養(yǎng)容器分隔為包括培養(yǎng)部和可擴張部的兩室以上，并與所述培養(yǎng)部中的細胞數(shù)的增加相應(yīng)地使所述培養(yǎng)部的容積擴張，利用所述攪拌構(gòu)件對所述培養(yǎng)部內(nèi)的培養(yǎng)基進行攪拌。9.一種容器內(nèi)的計數(shù)對象物的計數(shù)方法，用于計測密封容器內(nèi)的液體中的計數(shù)對象物的個數(shù)，其特征在于，調(diào)節(jié)所述容器的至少一部分的厚度，以被調(diào)節(jié)的范圍的至少一部分作為測定對象范圍，計測該測定對象范圍內(nèi)的計數(shù)對象物的個數(shù)。10.如權(quán)利要求9所述的容器內(nèi)的計數(shù)對象物的計數(shù)方法，其特征在于，將所述容器內(nèi)的液體進行攪拌，使所述液體中的所述計數(shù)對象物均等化后，對所述容器的至少一部分的厚度進行調(diào)節(jié)。11.如權(quán)利要求9或10所述的容器內(nèi)的計數(shù)對象物的計數(shù)方法，其特征在于，使用計測得到的所述計數(shù)對象物的個數(shù)，計算所述液體中的計數(shù)對象物的密度，和/或計算所述液體整體的計數(shù)對象物的個數(shù)。12.如權(quán)利要求911中任一項所述的容器內(nèi)的計數(shù)對象物的計數(shù)方法，其特征在于，所述計數(shù)對象物的個數(shù)的計測通過計測拍攝所述測定對象范圍而得到的圖像中的所述計數(shù)對象物的個數(shù)來進行。13.如權(quán)利要求912中任一項所述的容器內(nèi)的計數(shù)對象物的計數(shù)方法，其特征在于，當所述測定對象范圍內(nèi)的所述計數(shù)對象物的個數(shù)為規(guī)定值以上時，使所述容器的至少一部分的厚度減少后，計測所述計數(shù)對象物的個數(shù)。14.如權(quán)利要求13所述的容器內(nèi)的計數(shù)對象物的計數(shù)方法，其特征在于，使用厚度調(diào)節(jié)構(gòu)件，按壓所述容器，或者拉伸所述容器，使所述容器的至少一部分的厚度減少。15.如權(quán)利要求912中任一項所述的容器內(nèi)的計數(shù)對象物的計數(shù)方法，其特征在于，當所述測定對象范圍內(nèi)的所述計數(shù)對象物的個數(shù)不足規(guī)定值時，使所述容器的至少一部分的厚度增加后，計測所述計數(shù)對象物的個數(shù)。16.如權(quán)利要求15所述的容器內(nèi)的計數(shù)對象物的計數(shù)方法，其特征在于，使用厚度調(diào)節(jié)構(gòu)件，按壓所述容器，使所述容器的至少一部分的厚度增加。17.如權(quán)利要求916中任一項所述的容器內(nèi)的計數(shù)對象物的計數(shù)方法，其中，所述容器為培養(yǎng)容器，所述計數(shù)對象物為細胞。18.—種計數(shù)用裝置，用于計測密封容器內(nèi)的液體中的計數(shù)對象物的個數(shù)，其特征在于，具備裝載所述容器的裝載臺和將所述容器中包含測定對象范圍的至少一部分調(diào)節(jié)至規(guī)定厚度的調(diào)節(jié)構(gòu)件。19.如權(quán)利要求18所述的計數(shù)用裝置，其特征在于，具備在利用所述調(diào)節(jié)構(gòu)件調(diào)節(jié)所述容器的厚度之前對所述容器內(nèi)的液體進行攪拌的攪拌構(gòu)件。20.如權(quán)利要求18或19所述的計數(shù)用裝置，其特征在于，具備拍攝單元，其對所述容器內(nèi)的所述計數(shù)對象物進行拍攝，計數(shù)單元，其對拍攝到的圖像內(nèi)的所述計數(shù)對象物的個數(shù)進行計測，和驅(qū)動裝置，其當所述計數(shù)單元的計測結(jié)果為所述計數(shù)對象物的個數(shù)不在規(guī)定的范圍內(nèi)時，驅(qū)動所述調(diào)節(jié)構(gòu)件，將所述容器的至少一部分調(diào)節(jié)至規(guī)定的厚度，以使所述圖像內(nèi)的計數(shù)對象物的個數(shù)達到規(guī)定的范圍內(nèi)。全文摘要通過進行培養(yǎng)容器內(nèi)的細胞凝聚塊的形成控制、凝聚塊的分解控制，使細胞的增殖效率進一步提高。另外，可以在無需開放培養(yǎng)體系且不受細胞密度的限制的情況下計測培養(yǎng)容器內(nèi)的細胞數(shù)。通過對培養(yǎng)容器施加外力，對培養(yǎng)容器內(nèi)的細胞凝聚塊的形成控制和凝聚塊的分解控制的至少一方進行控制，由此進行細胞的培養(yǎng)。對培養(yǎng)容器施加外力通過從平置的培養(yǎng)容器的上面以規(guī)定的壓入量按壓攪拌構(gòu)件、并使其以規(guī)定的速度沿水平方向移動來進行，由此對培養(yǎng)容器內(nèi)的細胞凝聚塊的形成和分解的至少一方進行控制。另外，提供一種計測密封容器內(nèi)的液體中的計數(shù)對象物的個數(shù)的方法，其中，調(diào)節(jié)容器的至少一部分的厚度，以被調(diào)節(jié)的范圍的至少一部分為測定對象范圍，計測該測定對象范圍內(nèi)的計數(shù)對象物的個數(shù)。文檔編號C12N5/00GK102348794SQ20108001102公開日2012年2月8日申請日期2010年3月2日優(yōu)先權(quán)日2009年3月9日發(fā)明者太田恭平,戶谷貴彥,末永亮,田中鄉(xiāng)史,石崎庸一申請人:東洋制罐株式會社