專利名稱：一種花藥發(fā)育控制基因及其在擬南芥雄性不育中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬植物生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種調(diào)控植物花藥發(fā)育從而調(diào)節(jié)育性的 基因、編碼蛋白及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物的有性生殖不僅是植物繁殖的主要途徑，也是植物進(jìn)化及對(duì)環(huán)境適應(yīng)的基礎(chǔ) 之一?；ㄋ幨侵参锏男坌陨称鞴?，是花粉發(fā)育的場(chǎng)所?；ㄋ幖盎ǚ鄣陌l(fā)育是植物基因功 能研究的一個(gè)重要研究方向?；ㄋ幖盎ǚ郯l(fā)育異常會(huì)引起花藥不能產(chǎn)生正常功能的雄配子 從而導(dǎo)致雄性不育，雄性不育是生產(chǎn)上雜交制種的基礎(chǔ)。因此對(duì)花藥及花粉發(fā)育的深入研 究既有理論研究意義，又有實(shí)際應(yīng)用的價(jià)值。絨氈層位于花藥壁四層孢子體細(xì)胞的最內(nèi)層，與配子體直接相連。因此，它在花粉 發(fā)育過程中起著重要的作用。雄性不育的發(fā)生與絨氈層正常的發(fā)育途徑受干擾有關(guān)。在擬 南芥中，絨氈層從花藥原基的L2細(xì)胞層發(fā)育而來，到花藥發(fā)育第5期形成明顯的絨氈層結(jié) 構(gòu)。在減數(shù)分裂期間，絨氈層細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)則變得濃密，進(jìn)行核內(nèi)有絲分裂，形成雙核的、缺 少初生壁的極性分泌細(xì)胞，其中充滿了核糖體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等等，顯示其代謝 高度活躍。在小孢子從四分體釋放后，絨氈層進(jìn)一步特化為海綿狀的細(xì)胞，且在原生質(zhì)膜的 向藥室面上分布著一些分泌小泡，通過細(xì)胞內(nèi)切面釋放小孢子發(fā)育所需要的蛋白質(zhì)、脂類 及其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。最后，絨氈層細(xì)胞降解，細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞殘余與脂體釋放到花粉表面成 為對(duì)花粉粘著和信號(hào)識(shí)別很重要的花粉包被。在大多數(shù)植物中，成熟的花粉粒有兩層細(xì)胞壁花粉內(nèi)壁和花粉外壁；花粉外壁 在保護(hù)花粉抵抗環(huán)境壓迫，細(xì)菌侵染以及細(xì)胞間識(shí)別中有重要作用。外壁的主要成分是孢 粉素類物質(zhì)(sporopollenin)，有較強(qiáng)的抗腐蝕及抗酸堿性能?；ǚ弁獗诒绕渌参锛?xì)胞壁 都要復(fù)雜，分為兩層有蜂窩狀的外壁外層(sexine)以及平坦的外壁內(nèi)層(nexine)，分別 有不同的組成模式。花粉外壁的成分主要由絨氈層細(xì)胞合成并分泌在藥室中，沉著在小孢 子表面后形成高度復(fù)雜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)?；ǚ弁獗诘某煞种饕山q氈層細(xì)胞合成并分泌在藥室 中，沉著在小孢子表面后形成高度復(fù)雜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。而花粉內(nèi)壁則是由小孢子自身纖維素 果膠類物質(zhì)合成，并含有多種蛋白，在花粉萌發(fā)，花粉管營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，及柱頭滲透等過程。但關(guān) 于其形成機(jī)理的研究還不夠深入。花粉外壁的形成可以追述到減數(shù)分裂期間，此時(shí)小孢子母細(xì)胞會(huì)在細(xì)胞膜外分泌 由β-1，3-葡聚糖組成的胼胝質(zhì)層以取代原有的細(xì)胞壁。胼胝質(zhì)具有將小孢子與花藥孢子 體細(xì)胞隔離、防止細(xì)胞融合以及防止小孢子過早發(fā)育等作用。此外，胼胝質(zhì)層作為初生外壁 形成的模板在隨后的花粉壁發(fā)育中有極其關(guān)鍵的作用。初生外壁(primexine)由單倍體小 孢子在細(xì)胞膜表面形成由多糖類物質(zhì)組成。其結(jié)構(gòu)決定了隨后花粉外壁的結(jié)構(gòu)圖案，相當(dāng) 于花粉外壁建設(shè)的藍(lán)圖。當(dāng)胼胝質(zhì)或者初生外壁的合成出現(xiàn)缺陷時(shí)，隨后的花粉壁形成就 會(huì)受到影響，從而導(dǎo)致花粉發(fā)育缺陷乃至降解?；谠S多已知基因的功能分析表明，正?；?粉壁的形成需要小孢子及其母細(xì)胞負(fù)責(zé)胼胝質(zhì)、初生外壁與內(nèi)壁物質(zhì)的合成，而絨氈層則負(fù)責(zé)合成分泌外壁原料和花粉包被。因此這個(gè)復(fù)雜而有序的過程依賴于小孢子自身與絨氈 層功能的協(xié)同作用。擬南芥基因組中，只含有1 個(gè) AT-HOOK 和 PPC(plants and prokaryotes conserved)元件的共四個(gè)高度同源基因被命名為AHL(AT-hook motif nuclear localized protein)家族。其中ΑΤ-Η00Κ元件具有與染色體核基質(zhì)附著區(qū)相結(jié)合的能力，而PPC元 件中的疏水區(qū)域是必要的核定位信號(hào)。目前家族中一些基因功能已被報(bào)道。例如AH L15 與AHL25能夠通過直接結(jié)合赤霉素調(diào)節(jié)基因AtGA3oxl的啟動(dòng)子中AAAT序列，從而調(diào)控赤 霉素在的體內(nèi)平衡。AHL27的過量表達(dá)植株出現(xiàn)下胚軸縮短、葉片的晚衰及延長(zhǎng)種子的儲(chǔ) 存時(shí)間，而AHU9的過量表達(dá)植株表現(xiàn)出相較于野生型更短的下胚軸和更大的花器官及葉 片，同樣也延長(zhǎng)了葉片衰老。暗示了這2個(gè)高度同源的基因都參與了光抑制下胚軸生長(zhǎng)機(jī) 制中，可能存在了基因功能冗余現(xiàn)象。同樣，AHL22，AHL18，AHL27，AHL29基因四突變體能夠 導(dǎo)致提前開花的表型。AHL21基因功能更是被證實(shí)是能夠直接結(jié)合染色體的蛋白，并且直接 受控于AG基因。AHL21能夠直接影響下游多個(gè)重要轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)子區(qū)域中MAR區(qū)域的組蛋 白修飾，調(diào)控其表達(dá)水平，從而影響花器官的形成與分化。從已報(bào)道的家族成員功能來看， 此家族成員的功能分布于擬南芥許多生命活動(dòng)中，并且可能直接調(diào)控下游許多基因的時(shí)空 表達(dá)，但大部分的家族成員功能仍未被報(bào)道。擬南芥AHL16基因也同樣含有1個(gè)ΑΤ-Η00Κ和PPC元件。其在擬南芥各個(gè)組織中都 有不同程度的表達(dá)，但在花器官中花藥發(fā)育第七期的絨氈層細(xì)胞中特異表達(dá)。許多AHL家 族單基因突變都未有十分明顯的生理缺陷，但AHL16基因的單基因缺失突變體能夠?qū)е禄?粉完全敗育，突變體中小孢子從四分體中釋放后逐漸破裂降解，使得自花授粉功能完全喪 失，百株結(jié)實(shí)率為零。該突變體是單基因隱性突變，符合孟德爾方式遺傳規(guī)律。因此，AHL16 在植物生命周期中，從雙倍孢子體向單倍雄配子體轉(zhuǎn)換過程中起關(guān)鍵作用，通過生物技術(shù) 手段實(shí)現(xiàn)對(duì)擬南芥育性的調(diào)控將有助于在模式植物上創(chuàng)建一個(gè)全新的雄性不育育種應(yīng)用 途徑。

發(fā)明內(nèi)容
所要解決的技術(shù)問題本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種花藥發(fā)育控制基因，以補(bǔ)充現(xiàn)有雄性不育 基因序列的特異性的分子標(biāo)記的不足，而此標(biāo)記具備鑒定擬南芥或其他植物的雄性不育植 物的基因型的潛力；在此基因的應(yīng)用方面，提供一種新的雄不育植株獲得方法，即利用本發(fā) 明克隆的基因進(jìn)行分子水平的轉(zhuǎn)基因育種，以克服常規(guī)的雜交和回交育種方法育種的時(shí)間 長(zhǎng)、育種效果不確定的缺陷。技術(shù)方案本發(fā)明的技術(shù)方案之一是提供一種分離的花藥發(fā)育控制蛋白多肽，所述的多肽選 自下組a) SEQ ID No. 2氨基酸序列的多肽；或b)在SEQ ID No. 2的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或插入1_10個(gè)氨基酸所衍生 的，且具有花藥發(fā)育控制功能的蛋白。上述的花藥發(fā)育控制蛋白多肽的一種優(yōu)選方式為具有SEQ ID No. 2氨基酸序列的多肽。本發(fā)明的技術(shù)方案之二是提供一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸的核苷酸序列 選自下組a)編碼權(quán)利要求1所述多肽的多核苷酸；或b)SEQ ID No. 1 所示的序列。在一種優(yōu)選方式中，所述的多核苷酸編碼如SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列的多 肽。在另一種優(yōu)選方式中，所述的多核苷酸的序列如SEQ ID No. 1所示。本發(fā)明的技術(shù)方案之三是提供一種載體，該載體含有上述的技術(shù)方案之二所述的 多核苷酸。本發(fā)明的技術(shù)方案之四是提供一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞含有 上述的技術(shù)方案之三所述的載體。本發(fā)明的技術(shù)方案之五是提供一種花藥發(fā)育控制蛋白的制備方法，包含以下步 驟a)在適合表達(dá)花藥發(fā)育控制蛋白的條件下，培養(yǎng)上述的技術(shù)方案之四所述的宿主 細(xì)胞；和b)從培養(yǎng)物中分離出所述的花藥發(fā)育控制蛋白。本發(fā)明的技術(shù)方案之六是提供一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟a)將上述的技術(shù)方案之二所述的多核苷酸轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞；和b)將步驟a)中的植物細(xì)胞再生植株。本發(fā)明的技術(shù)方案之七是提供一種上述的技術(shù)方案之一所述的花藥發(fā)育控制蛋 白多肽、以及上述的技術(shù)方案之二所述的多核苷酸的用途，其特征在于，用于控制植物花藥 的發(fā)育。本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易 見的。


下面結(jié)合附圖對(duì)理解本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)描述，但并非對(duì)本發(fā)明做限定。圖1顯示了突變體背景下AHL16基因的突變位點(diǎn)。黑色長(zhǎng)方形代表外顯子，基因 內(nèi)黑線代表內(nèi)含子。圖2.顯示了擬南芥雄性不育突變體ahll6的不育表型。WT.野生型植株果莢飽 滿，可育；ahll6.突變體植株果莢短小，完全不育；C-ahll6.轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)植株恢復(fù)育性。圖3顯示了野生型與突變體的花藥發(fā)育組織學(xué)觀察。(A)，(B)，(C)，(D)，(E)，(F)， (G)，(H)為野生型花藥；(I)，(J)，(K)，(L)，(M)，(N)，(0)，(P)為 ahll6 花藥。(A，I)花藥 發(fā)育第五期(B，J)花藥第六期(C)野生型第七期內(nèi)為四分體(K)第七期ahll6花藥中絨氈 層空泡化，四分體形態(tài)較為異常(D)第八期早期的野生型花藥，小孢子已從四分體中分離。 (L)第8期ahll6突變體的小孢子也能從四分體中分離。(E)野生型第九期花藥。小孢子 進(jìn)入空泡化過程，外壁已形成。(M)第九期突變體。小孢子開始降解，外壁形成正常。(N-P) 第十期以后突變體中小孢子已經(jīng)降解。dPG，降解的小孢子；E，花藥外壁；En，花藥內(nèi)壁；MI，中層細(xì)胞；Ms，小孢子母細(xì)胞；Mp，小孢子；Pg，花粉；Sp，孢粉素；T，絨氈層；Tds，四分體.標(biāo) 尺=10 μ m.圖4顯示了野生型與ahll6突變體小孢子發(fā)育的掃描和透射電鏡(A)野生型成熟花粉(B)突變體敗育花粉(C)第七期野生型小孢子初生外壁(D) 第八期野生型小孢子外壁內(nèi)層形成(E)第九期野生型小孢子外壁形成與內(nèi)壁開始沉積(F) 第十期野生型小孢子(G)第十一期野生型小孢子內(nèi)壁積累完成(黑色箭頭)(H)突變體小 孢子初生外壁正常.(I)突變體小孢子外壁內(nèi)層缺失(J)第九期突變體小孢子(K)第十期 突變體小孢子質(zhì)壁分離，顯示外壁外層結(jié)構(gòu)正常但外壁內(nèi)層與內(nèi)壁缺失(L)突變體小孢子 降解。dPG，降解的花粉；ft~e，初生外壁；Ne，外壁內(nèi)層；Se，外壁外層；Rn，小孢子質(zhì)膜； In，花粉內(nèi)壁.標(biāo)尺=4μπι。圖5顯示了 AHL16基因的表達(dá)模式(A). AHL16在不同組織中的半定量RT-PCR結(jié)果。(B)以AHL16為探針的原位雜交 結(jié)果。AHL16在花藥發(fā)育四分體時(shí)期的絨氈層中特異表達(dá)。MMC:小孢子母細(xì)胞；MC，性母細(xì) 胞；Msp 小孢子；T 絨氈層；Tds 四分體；Pg 花粉。圖6顯示了 AHL16在絨氈層轉(zhuǎn)錄因子突變體中的原位檢測(cè)。上排AHL16基因在 ams突變體中的表達(dá)完全沒有檢測(cè)到。下排AHL16基因在msl88突變體中的表達(dá)譜與野生 型相似。發(fā)明人實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的具體技術(shù)步驟如下步驟一，擬南芥雄性不育突變體ahll6的分離和遺傳分析通過外源T-DNA插入誘 變野生型擬南芥Col生態(tài)型植株，通過大量篩選得到表型穩(wěn)定的突變體ahll6。該突變體的 營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)于野生型相比沒有明顯區(qū)別，但果莢短小，內(nèi)不含有種子，屬于完全不育。將野生 型作為父本與突變體進(jìn)行雜交，表明其雌蕊發(fā)育并沒有受到影響。通過對(duì)雜交F2代表型分 離比分析，本發(fā)明確定ahll6是一個(gè)符合單基因控制遺傳規(guī)律的隱型突變體。如圖2所示。步驟二，分離控制擬南芥育性的AHL16基因?yàn)榱朔蛛x造成該突變體不育表型的 基因，本發(fā)明采用TAIL-PCR的方法，通過對(duì)側(cè)翼序列的測(cè)序表明，突變體中T-DNA插入在 AHL (AT-hook motif nuclear localized protein) MMl^m AHL16 (At2g42940)白勺口佳—— 個(gè)外顯子上(圖1)。進(jìn)一步的連鎖分析發(fā)現(xiàn)，所有不育植株在該位點(diǎn)上都是純合插入。步驟三，AHL16基因的功能分析為證明突變體雄性不育的表型是AHL16的缺失所 導(dǎo)致的，本發(fā)明進(jìn)行了互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。首先從野生型植株中克隆出At2g4^40基因組(包 含上游725bp啟動(dòng)子和下游778bp終止區(qū)片段)以及編碼區(qū)cDNA片段，分別構(gòu)建到不同的 雙元表達(dá)載體中，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化入ahl 16突變體Fl代中，待果莢成熟后收取種子， 在平板上用T-DNA片段所含抗性進(jìn)行篩選，從而得到轉(zhuǎn)基因植物。經(jīng)過對(duì)轉(zhuǎn)基因T2代植株 的背景分析，證明了該基因的突變導(dǎo)致了該突變體的不育表型。本發(fā)明正確的克隆了 AHL16 基因(SEQ ID Nol)，氨基酸序列分析表明AHL16基因只包含1個(gè)外顯子和兩個(gè)內(nèi)含子，編 碼一個(gè)由257個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的蛋白，屬于AHL(AT-hook motif nuclear localized protein)家族(SEQ ID No2)。步驟四，AHL16基因調(diào)控小孢子胼胝質(zhì)的合成以及花粉外壁的發(fā)育通過半薄切 片觀察比較了 ahll6突變體與野生型的整個(gè)花藥發(fā)育過程，在減數(shù)分裂完成以后，突變體的絨氈層空泡化較為嚴(yán)重，而四分體正常。在花藥發(fā)育第八期，突變體小孢子從四分體中釋 放后，與野生型相比較為腫大，空泡化也較為嚴(yán)重。從花藥發(fā)育第九期開始，突變體中小孢 子逐漸降解，至十一期僅留下花粉外壁骨架(圖幻。電鏡觀察表明，突變體的小孢子在初生 外壁(primexine)形成，外壁頂蓋(tectum)及骨架(baculum)形成方面，與野生型沒有可 見的差別，但其外壁內(nèi)層(intine)未能形成。在第九期以后，野生型中花粉逐漸分泌纖維 素和果膠物質(zhì)并附著在外壁內(nèi)層上，但ahll6突變體中則發(fā)現(xiàn)其外壁內(nèi)層和花粉內(nèi)壁都存 在明顯的缺失。在野生型花粉成熟時(shí)，突變體花粉的內(nèi)容物已完全降解，只剩下外壁網(wǎng)格狀 結(jié)構(gòu)的殘余物(圖4)。綜上所述，ahll6的小孢子由于外壁內(nèi)層結(jié)構(gòu)的缺失，導(dǎo)致花粉內(nèi)壁 的沉積異常，小孢子內(nèi)容物逐漸降解，從而引起花粉敗育。步驟五，AHL16基因在花藥絨氈層中特異表達(dá)半定量RT-PCR顯示，AHL16基因在 根，莖，花，葉等組織都有表達(dá)。由于該基因突變體的表型為雄性配子體發(fā)育異常，為詳細(xì) 了解AHL16在花藥中的時(shí)空表達(dá)，我們進(jìn)行了原位雜交試驗(yàn)。在小孢子的減數(shù)分裂時(shí)期， AHL16的信號(hào)在性母細(xì)胞及絨氈層中能夠被微弱地檢測(cè)到。減數(shù)分類完成后，該基因在絨氈 層中有強(qiáng)烈地表達(dá)，而四分體中的信號(hào)較弱。小孢子從四分體中釋放后，AHL16的表達(dá)水平 急劇降低(圖5)。這些結(jié)果表明AHL16在絨氈層分泌高度活躍的時(shí)期可能作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào) 控了花粉外壁內(nèi)層的發(fā)育，其突變后導(dǎo)致花粉外壁內(nèi)層與內(nèi)壁的先后缺失。步驟六，AHL16處于絨氈層發(fā)育關(guān)鍵因子AMS的下游擬南芥 AB0RTEDMICR0SP0RES (AMS)基因編碼了一個(gè)bHLH家族的轉(zhuǎn)錄因子，在控制絨氈層發(fā)育和功 能上有重要作用。該基因突變體的絨氈層細(xì)胞在減數(shù)分裂時(shí)期無(wú)法形成分泌型細(xì)胞，提前 降解。由于AHL16在四分體時(shí)期的絨氈層中特異表達(dá)，本發(fā)明通過原位雜交的方法，發(fā)現(xiàn) AHL16基因的表達(dá)在ams突變體背景下完全不能檢測(cè)到(圖6)。AtMYB103基因則編碼一個(gè) R2R3MTO家族的轉(zhuǎn)錄因子，其突變體絨氈層后期發(fā)育異常，花粉外壁外層無(wú)法形成，但外壁 內(nèi)層與內(nèi)壁發(fā)育正常，表型與ahll6正好相反。原位雜交表明，AHL16基因在AtMYB103基 因突變體msl88中，表達(dá)模式與野生型相似，并未受到影響(圖6)。這些結(jié)果表明，AHL16 可能處于AMS的下游，與AtMYB103在不同的途徑中分別控制花粉外壁外層和外壁內(nèi)層的發(fā) 育。糧食供給是人類生存與發(fā)展的根本。植物的生殖器官為動(dòng)物和人類提供了食物的 主要來源。由于雄性不育品種為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上異花授粉提供了極大的便利，所以控制作物的 雄性生殖發(fā)育對(duì)作物育種和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)至關(guān)重要。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展使得應(yīng)用AHL16 基因調(diào)控植物育性成為可能。有益效果在本發(fā)明提供的AHL16基因?yàn)橐环N擬南芥雄性不育的調(diào)控基因，與先前報(bào)道的其 他雄性不育調(diào)控基因不同，為新發(fā)現(xiàn)的特異性的雄性不育分子標(biāo)記，以此標(biāo)記可鑒定擬南 芥或其他植物的雄性不育植物的基因型。在此基因的應(yīng)用方面，本發(fā)明提供的新的雄不育植株獲得方法，即利用本發(fā)明克 隆的基因進(jìn)行分子水平的轉(zhuǎn)基因育種，克服了常規(guī)的雜交和回交育種方法育種的時(shí)間長(zhǎng)、 育種效果不確定的缺陷。利用本發(fā)明的AHL16基因，通過反義敲除的手段還能提供一種新的雄性不育植株
獲得方法。
在本發(fā)明對(duì)AHL16基因的研究過程中還揭示，它是一個(gè)AHL(AT_hook motif nuclearlocalized protein)家族蛋白，該基因通過調(diào)控小孢子外壁內(nèi)層的發(fā)育進(jìn)而影響 小孢子的成熟過程，突變體發(fā)育后期花粉完全敗育。AHL16是在花藥發(fā)育7-9期非常重要的 一個(gè)基因，也是目前報(bào)道的第一個(gè)與花粉內(nèi)壁沉積相關(guān)的基因。而其他所報(bào)道的孢子體控 制的不育相關(guān)基因鮮有完全不育表型。利用該發(fā)育生物學(xué)的調(diào)控因子，可以進(jìn)一步為控制 花壁內(nèi)層發(fā)育過程進(jìn)而影響植物花粉育性提供可供選擇的手段。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“雄性不育”是指植物雄性生殖器官不能產(chǎn)生正常功能的雄配子 (花粉)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“單基因隱型突變體”是指突變體受到單個(gè)基因的控制，其遺傳 分離比符合孟德爾遺傳規(guī)律。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“T-DNA插入突變”是指利用轉(zhuǎn)基因的方法把外源DNA片段插入 目的植物從而使其基因突變的方法。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“TAIL-PCR”是指利用依照目標(biāo)序列旁的已知序列的3個(gè)較高退 火溫度的嵌套特異性引物和一系列較短且Tm值較低的隨機(jī)簡(jiǎn)并引物組合，通過3輪熱不對(duì) 稱的溫度循環(huán)分級(jí)反應(yīng)來進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得已知序列的側(cè)翼序列。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明經(jīng)過深入而廣泛的研究，從擬南芥分離出控制花藥發(fā)育的調(diào)控蛋白AH L16，其調(diào)控了雄性小孢子的發(fā)育過程。本發(fā)明已經(jīng)證實(shí)，通過調(diào)節(jié)AH L16的活性可以產(chǎn)生 花粉敗育的植物，所以開發(fā)和利用此基因進(jìn)行人工創(chuàng)制不育系等農(nóng)業(yè)應(yīng)用方面具有很大的 經(jīng)濟(jì)效益。如本文所用，AH L16蛋白多肽是用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白純化技術(shù)純化的AH L16蛋白，純的 多肽在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。本發(fā)明的多肽可以是重組多肽，天然 多肽，合成多肽，優(yōu)選重組多肽。該多肽可以是糖基化的，或是非糖基化的。本發(fā)明還包括 AH L16蛋白的片段，衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“片段”，“衍生物”和“類似物”是指 基本上保持本發(fā)明的天然AH L16蛋白相同生物學(xué)功能和活性的多肽。本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“AH L16多肽”指具有AH L16蛋白相同功能的SEQ ID No. 2的多肽或其他變異形式。這些變異 形式包括(但不限于)若干個(gè)氨基酸的缺失，插入或取代，以及在C末端或N末端添加數(shù) 個(gè)氨基酸。該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然變異體、誘 導(dǎo)變異體，在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與AH L16雜交的DNA所編碼的蛋白，以及利用抗AH L16的抗血清獲得的多肽或蛋白。發(fā)明還提供AH L16蛋白或多肽的類似物，這些類似物與 天然AH L16蛋白的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾差異，或 者兼而有之。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如分子克隆操 作手冊(cè)，或按照制造廠商所建議的條件。常規(guī)無(wú)機(jī)化學(xué)試劑和有機(jī)溶劑購(gòu)自上海化學(xué)試劑廠，限制性內(nèi)切酶購(gòu)自上海皓嘉生物公司，引物由上海生工公司合成。原位探針制備試劑盒 購(gòu)自美國(guó)Roche公司，MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶等其余分子生物學(xué)試劑均購(gòu)自美國(guó) Promega公司。Eppendorf梯度式PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司，熒光PCR儀為美國(guó) ABI公司產(chǎn)品。實(shí)施例11.擬南芥(Arabidopsis thaliana)突變體 ahl 16，原始野生型為 Columbia(Col) 生態(tài)型(上海師范大學(xué)植物分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存)。2.擬南芥材料栽培條件擬南芥在0. 1 %的瓊脂糖中4°C春化2-4天后培養(yǎng)在黑 土；蛭石；珍珠巖(1:6: 0. 25)的混合土中。培養(yǎng)時(shí)在其上層罩一層塑料膜以保持濕 度，當(dāng)擬南芥萌發(fā)出子葉后去掉塑料層。光照時(shí)間為16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗，濕度保持在 60-70%，溫度控制在22-25°C，光照強(qiáng)度為50 μ ΕπΓ、—1，營(yíng)養(yǎng)液為PNS (表1)。表1. PNS母液成分和1升1 X PNS配方
權(quán)利要求
1.一種分離的花藥發(fā)育控制蛋白多肽，其特征在于，所述的多肽選自下組a)SEQ ID No. 2氨基酸序列的多肽；或b)在SEQID No. 2的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或插入1_10個(gè)氨基酸所衍生的，且 具有花藥發(fā)育控制功能的蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的多肽為SEQID No. 2氨基酸序列的多肽。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的核苷酸序列選自下組a)編碼權(quán)利要求1所述多肽的多核苷酸；或b)SEQID No. 1所示的序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸編碼如SEQID No. 2 所示的氨基酸序列的多肽。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸的序列如SEQID No. 1所示。
6.一種載體，其特征在于，含有權(quán)利要求3所述的多核苷酸。
7.一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的宿主細(xì)胞含有權(quán)利要求6所述的 載體。
8.—種花藥發(fā)育控制蛋白的制備方法，包含以下步驟a)在適合表達(dá)花藥發(fā)育控制蛋白的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞；和b)從培養(yǎng)物中分離出所述的花藥發(fā)育控制蛋白。
9.一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟a)將權(quán)利要求3所述的多核苷酸轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞；和b)將步驟a)中的植物細(xì)胞再生植株。
10.一種權(quán)利要求1所述的花藥發(fā)育控制蛋白多肽、以及權(quán)利要求3所述的多核苷酸的 用途，其特征在于，用于控制植物花藥的發(fā)育。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種花藥發(fā)育控制基因及其在擬南芥雄性不育中的應(yīng)用。從T-DNA插入突變體庫(kù)中篩選到擬南芥雄性不育突變體ahl16，克隆并鑒定了控制擬南芥育性的基因AHL16，具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，遺傳互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證明野生型中的AHL16基因可以恢復(fù)突變體的雄性不育表型。氨基酸序列分析及亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)表明AHL16編碼一個(gè)(AT-hookmotif nuclear localized protein)家族的蛋白，定位于細(xì)胞核中。擬南芥中，該基因的突變導(dǎo)致雄性完全敗育。該基因在闡述小孢子外壁內(nèi)層與內(nèi)壁結(jié)構(gòu)的發(fā)育影響植物育性方面，以及雜交制種提高作物產(chǎn)量方面具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/29GK102140131SQ201010618510
公開日2011年8月3日 申請(qǐng)日期2010年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月31日
發(fā)明者徐曉峰, 朱駿, 楊仲南 申請(qǐng)人:上海師范大學(xué)