專(zhuān)利名稱(chēng)：重組豬圓環(huán)病毒2型Cap抗原的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種重組豬圓環(huán)病毒2型Cap抗原的制備方 法及其酵母表達(dá)的Cap抗原為基礎(chǔ)制備的疫苗。
背景技術(shù)：
PCV2是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的感染豬的最小病毒之一，臨床上主要表現(xiàn)為消瘦、皮膚蒼 白、生長(zhǎng)緩慢、呼吸困難、皮炎腹瀉、黃疸等，自20世紀(jì)90年代加拿大首次報(bào)道以來(lái)，此病已 在世界范圍內(nèi)廣泛流行，給世界各國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的損失，我國(guó)這個(gè)養(yǎng)豬大國(guó)也深受 其害。有研究證明，豬圓環(huán)病毒病與多種因素共同作用導(dǎo)致疾病。該病與其他病原共同入 侵機(jī)體時(shí)，有利于PCV2在靶細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖，從而引起免疫抑制。目前并沒(méi)有治療PCV2的 特效藥，疫苗預(yù)防接種仍是防控PCV2的首選措施，亞單位疫苗安全、有效，國(guó)外已有免疫效 果良好的商品化亞單位疫苗，國(guó)內(nèi)尚無(wú)亞單位疫苗注冊(cè)上市，進(jìn)口的亞單位疫苗價(jià)格相當(dāng)
曰蟲(chóng) 印貝。圓環(huán)病毒2型對(duì)外界環(huán)境抵抗力較強(qiáng)，在酸性環(huán)境中及氯仿中可以存活較長(zhǎng)時(shí) 間。基因組為單股環(huán)狀DNA，全長(zhǎng)為1，767bp或1，768bp，含11個(gè)開(kāi)放性閱讀框，其中ORFl、 0RF2、0RF3研究比較多，0RF2由702個(gè)堿基組成。其主要抗原由病毒DNA互補(bǔ)鏈轉(zhuǎn)錄，編 碼含氨基酸234個(gè)，大小約27. 8ku的核衣殼蛋白(Cap蛋白)。PCV2 cap蛋白第65位 87 位，113位 139位和193位 207位氨基酸，為PCV2特異性抗原表位。PCV2 Cap蛋白作為主要保護(hù)性免疫蛋白，與PCVl Cap蛋白無(wú)交叉保護(hù)性，國(guó)內(nèi)外 研究人員都以表達(dá)出Cap蛋白為研究熱點(diǎn)。目前探索過(guò)各種表達(dá)方式，如大腸桿菌表達(dá)、桿 狀病毒表達(dá)、重組腺病毒載體等，較為成功的例子有桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，重組桿狀病毒在昆 蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)出的Cap蛋白，分子量為30KD左右，在電鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)和分離純化得到的病 毒核衣殼蛋白一致，表明Cap蛋白在外源表達(dá)系統(tǒng)中自我組裝成類(lèi)病毒粒子，試驗(yàn)證明，免 疫動(dòng)物后可誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平特異性抗體和引發(fā)特異性免疫反應(yīng)。國(guó)外已有商品化的亞單位 疫苗上市，能產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)，顯著降低病毒血癥。國(guó)內(nèi)部分高校和科研機(jī)構(gòu)用于制備 豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫苗的方法有構(gòu)建重組腺病毒和重組桿狀病毒表達(dá)Cap蛋白，前者 免疫效果有待驗(yàn)證，后者生產(chǎn)成本較高。酵母表達(dá)系統(tǒng)已是一個(gè)較為成熟的外源表達(dá)系統(tǒng)之一，其操作簡(jiǎn)單方便，成功率 高，既滿足原核表達(dá)高密度生長(zhǎng)、易培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，又具備真核表達(dá)系統(tǒng)翻譯后修飾的功能。 表達(dá)的蛋白產(chǎn)量高，可以存在于細(xì)胞內(nèi)，也可以分泌至胞外。自身產(chǎn)生的蛋白極少，且不具 有毒性，近年來(lái)，已有大量生物制品在酵母表達(dá)系統(tǒng)里得到成功表達(dá)，并進(jìn)行規(guī)?；l(fā)酵生 產(chǎn)，作為生產(chǎn)成本低，產(chǎn)出量高的外源表達(dá)系統(tǒng)，酵母表達(dá)系統(tǒng)非常具有優(yōu)勢(shì)。根據(jù)酵母密 碼子偏嗜性改造目的基因，不斷優(yōu)化表達(dá)條件，有提高表達(dá)量的巨大空間。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種豬圓環(huán)病毒2型亞單位抗原的制備方法。
本發(fā)明的另一目的是提供包括根據(jù)上述制備方法所得豬圓環(huán)病毒2型亞單位抗 原的疫苗。一種豬圓環(huán)病毒2型亞單位抗原的制備方法，是采用酵母表達(dá)系統(tǒng)制備。具體步驟如下
(1)擴(kuò)增PCV2-0RF2 基因；
(2)構(gòu)建表達(dá)工程菌擴(kuò)增序列插入酵母表達(dá)載體，形成重組表達(dá)載體，線性化后轉(zhuǎn)化 畢赤酵母宿主細(xì)胞，構(gòu)建表達(dá)工程菌；
(3)重組酵母菌分泌表達(dá)。步驟(1)中所述PCV2-0RF2基因?yàn)镻CV2-0RF2全基因或根據(jù)酵母密碼子偏嗜性改 造的PCV2-0RF2基因。擴(kuò)增PCV2-0RF2 基因的引物為 SEQ ID NO: IfPSEQ ID NO: 2。步驟(2)中所述酵母表達(dá)載體為pGAPZ α A、pGAPZ α B或pGAPZ α C。步驟(2)中所述畢赤酵母宿主細(xì)胞為酵母菌Χ33、SMD1168。一種豬圓環(huán)病毒亞單位疫苗，是包括上述制備方法所得抗原。疫苗中抗原有效成 分濃度為200 35(^g/mL。上述述疫苗的制備方法，是將所得抗原溶液與防腐劑、穩(wěn)定劑、抗菌藥混合，加入 佐劑，調(diào)節(jié)pH為7. 0 7. 5，即得到亞單位疫苗。其中防腐劑為制備疫苗常用防腐劑，如LL37抗菌肽、甲醛、苯酚、苯甲醇、乳酸鏈 球菌素、尼泊金類(lèi)、硼砂等。穩(wěn)定劑為乙二胺四乙酸二鈉?？咕幬锇ㄈ缌蛩釕c大霉素、
青鏈霉素等。上述佐劑為鋁膠、卡伯波971、皂角甙、脂質(zhì)體、CpG-ODN、納米佐劑或油乳佐劑。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果
采用酵母表達(dá)系統(tǒng)操作簡(jiǎn)單、表達(dá)量較高，生產(chǎn)成本低，可以進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。構(gòu)建重 組質(zhì)粒后，通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)化，利用Z抗性即可篩選出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，提高kocin 抗性濃度，可 以篩選高拷貝量的轉(zhuǎn)化子。實(shí)驗(yàn)操作獲得重組酵母工程菌簡(jiǎn)單易行，成功率高，此表達(dá)系統(tǒng) 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化時(shí)，是將質(zhì)粒整合到酵母基因組，較為穩(wěn)定，避免目的基因丟失，能夠穩(wěn)定的遺傳。 酵母表達(dá)系統(tǒng)與昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、哺乳細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)同樣對(duì)表達(dá)的蛋白有加工折疊和翻 譯后修飾的功能，從而使表達(dá)的蛋白具有生物活性，比起大腸桿菌更有優(yōu)勢(shì)，但比哺乳細(xì)胞 表達(dá)系統(tǒng)操作更簡(jiǎn)便。而與釀酒酵母相比，畢赤酵母不易過(guò)度糖基化。該病毒主要引起免 疫組織病變，是其他細(xì)菌、病毒入侵的門(mén)戶，目前存在的豬圓環(huán)病毒滅活苗的安全性還有待 驗(yàn)證，昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的PCV2-Cap已制備成商品化疫苗，且臨床效果良好，由于生 產(chǎn)工藝復(fù)雜，生產(chǎn)成本的原因，導(dǎo)致其價(jià)格昂貴，難以推廣。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)可以采用基 礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵，僅提供酵母生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)即可高密度發(fā)酵，細(xì)胞干重可達(dá)100g/l，同時(shí)酵母 細(xì)胞自身分泌的蛋白很少，分離純化往往需要較為復(fù)雜的工藝，而酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的蛋 白分離純化只需分離上清、微濾、濃縮除鹽3步即可。在優(yōu)化后的培養(yǎng)條件下，表達(dá)量高，生 產(chǎn)成本低，有利于豬圓環(huán)病毒亞單位疫苗的推廣使用。


圖1 構(gòu)建重組酵母工程菌的技術(shù)路線4圖2 :PCV2-Cap表達(dá)的SDS-PAGE電泳圖，M為預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，1為未經(jīng)濃縮 pGAPZ α A-0RF2-X33表達(dá)上清，2為pGAPZ α Α-Χ33空載體的表達(dá)上清；
圖3 檢測(cè)PCV2-Cap免疫原性的免疫印跡分析圖。M為預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，1-2為未 經(jīng)濃縮pGAPZ α A-0RF2-X33表達(dá)上清，3為pGAPZ α Α-Χ33空載體的表達(dá)上清。
具體實(shí)施例方式下面實(shí)施例中使用的生物材料為Ze0CinTM抗性、表達(dá)載體pGAPZaA、/^Aia pas tor is 受體菌 X33、SMDl 168 購(gòu)于 hvitrogen 公司 xrTap DNA 聚合酶、T4 DNA Ligase、 限制性?xún)?nèi)切酶煬ο I ,Not I ,Avr II為T(mén)aKafei公司產(chǎn)品疋.coli DH5 α由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸 醫(yī)學(xué)院傳染病實(shí)驗(yàn)室保存。質(zhì)粒提取試劑盒、PCR純化試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)自PR0MEGA 公司。其余生化試劑購(gòu)于鼎國(guó)生物有限公司。病毒來(lái)源為ELISA檢測(cè)為血清學(xué)陽(yáng)性的病豬 肺臟。實(shí)施例1
以質(zhì)粒pGAPZ α A為酵母表達(dá)載體，以酵母菌Χ33為表達(dá)宿主菌，制備方法包括以下步
驟
1.從圓環(huán)病毒2型感染豬肺臟分離病毒，全基因組擴(kuò)增得到目的基因0RF2。上游引物 為SEQ ID Ν0:1，下游引物為SEQ ID NO: 2，反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min，然后開(kāi)始30個(gè) 循環(huán)，90°C 30S,50°C 40S，72°C 45S，最后 72°C延伸 lOmin。2.PCV2 0RF2基因與pMD18_T克隆載體的連接和轉(zhuǎn)化，將pMD18_T載體0. 5μ 與步 驟1中擴(kuò)增得到的目的基因0RF2 4. 5μ 及Solution I 5.0 PL輕輕混勻后，16°C連接過(guò) 夜，連接產(chǎn)物標(biāo)記為PMD18-0RF2。連接產(chǎn)物5μ 轉(zhuǎn)化制備的DH5 α感受態(tài)細(xì)胞150μ ，轉(zhuǎn)化 的菌液均勻鋪LB平板(氨芐青霉素=10(^g/mL)，次日挑取單菌落搖菌，送hvitrogen公司 測(cè)序，并抽提質(zhì)粒，損ο /和Afoi /雙酶切鑒定成功后，質(zhì)粒保存于-20°C備用。3.將酵母表達(dá)載體pGAPZa A與pMD18-0RF2作損ο I^WNot /雙酶切，經(jīng)1%瓊脂 糖凝膠電泳分離基因片段，膠回收表達(dá)載體和目的基因，再使用T4 DNA連接酶連接，構(gòu)建重 組表達(dá)載體，標(biāo)記為pGAPZ a A-0RF2,按步驟2中轉(zhuǎn)化方式轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，抽提重組 質(zhì)粒，ZAo /和Afoi /雙酶切鑒定成功后，重組質(zhì)粒保存于_20°C備用。4.重組表達(dá)載體pGAPZ a A-0RF2轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞畢赤酵母X33，構(gòu)建重組表達(dá)工程 菌。將感受態(tài)A/^1Siori1S X33 (80 μ L)與 Jkt #單酶切 pGAPZ a A-0RF2 (10 μ g)相混合， 1.5 kV、200Q電擊5 ms。將轉(zhuǎn)化后的酵母細(xì)胞均勻平鋪于新鮮制備YPDS平板(含kocin 抗性10(^g/mL)，待平板把液體吸收(約15min)，將平板倒置，于30°C溫箱中培養(yǎng)至單菌落 出現(xiàn)(2天左右)。采用煮一凍一煮法制備菌液PCR模板分析A/^astoris轉(zhuǎn)化子，上游引 物為SEQ ID N0:1，下游引物為SEQ ID N0:2能擴(kuò)增出700 bp左右的單菌落為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。 得到重組酵母工程菌pGAPZ a A-0RF2-X33。5. pGAPZ a A _0RF2_X33用YPDS培養(yǎng)液做分泌表達(dá)。挑取表面光滑、邊緣整齊的白 色單菌落于4mL YPD培養(yǎng)液作為種子液，培養(yǎng)約1 菌液渾濁，吸取ImL重懸于50mLYPDS培 養(yǎng)基中(裝量為10%)，220r/min, 30°C震蕩培養(yǎng)。72h后5000r/minX IOmin離心收集培養(yǎng)上 清作SDS-PAGE或保存于_80°C備用。PCV2_Cap表達(dá)的SDS-PAGE電泳圖見(jiàn)圖2，在^KDa附 近有一條特異條帶，而空載體沒(méi)有，表明PCV2 0RF2基因已在酵母菌X33中成功分泌表達(dá)。檢測(cè)PCV2-Cap免疫原性的免疫印跡分析圖見(jiàn)圖3，以PCV2感染豬血清作為一抗，辣根過(guò)氧 化物酶標(biāo)記羊抗豬IgG作為二抗，經(jīng)DAB-H2A顯色后，在26KDa附近出現(xiàn)一條特異性條帶， 空載體沒(méi)有出現(xiàn)。表明PCV2 0RF2基因在酵母中表達(dá)的Cap蛋白具有一定的抗原性。pGAPZ α A載體以pGAP為組成型強(qiáng)啟動(dòng)子，在葡萄糖存在的情況下即可誘導(dǎo)酵母 進(jìn)入蛋白表達(dá)狀態(tài)，即在YPDS培養(yǎng)基中，酵母細(xì)胞生長(zhǎng)，同時(shí)表達(dá)目的蛋白，不需要甲醇誘 導(dǎo)表達(dá)，甲醇是一種無(wú)色、透明、易燃、易揮發(fā)的有毒液體，在運(yùn)輸、保存過(guò)程中比較危險(xiǎn)，表 達(dá)產(chǎn)物也難以避免甲醇污染。培養(yǎng)基碳源可分批一次性添加，也可以初始碳源適當(dāng)降低，經(jīng) 過(guò)6-10h左右流加碳源，流加碳源的優(yōu)勢(shì)在于提高酵母細(xì)胞的碳源利用率。高拷貝數(shù)不必 定能得到高表達(dá)量，單拷貝比2拷貝子和3拷貝子低，原因可能在于高拷貝子翻譯效率亦 高，營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足，對(duì)表達(dá)的蛋白加工折疊和翻譯后修飾不能有序進(jìn)行，選擇合適的多拷貝 子也是提高表達(dá)量的重點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)可以選擇磷酸鹽緩沖液控制表達(dá)過(guò)程溶液PH值為6. 5。 盡可能的提高溶氧量，試驗(yàn)證明，表達(dá)量隨著溶氧量增加而升高。表達(dá)時(shí)菌液初始OD值應(yīng) 達(dá)到在1.5以上，一般在營(yíng)養(yǎng)充足的情況下，菌液密度越高，表達(dá)量越高。先以YPD培養(yǎng)液 培養(yǎng)重組酵母菌至0D=2 6，吸取菌液重懸于YPDS培養(yǎng)液，使OD > 1. 5，或當(dāng)達(dá)到0D=2 6時(shí)，5000r/min離心收集菌體，重懸于YPDS培養(yǎng)液，表達(dá)時(shí)間可為3 5天，培養(yǎng)過(guò)程中， 要保證充足的溶氧值(D0)，表達(dá)溫度控制在28 V 30°C之間，高于30°C，不利于酵母細(xì)胞 生長(zhǎng)。溫度初期可控制在觀 30°C，隨著菌液濃度增加，適當(dāng)降低培養(yǎng)溫度，緩解酵母細(xì)胞 生長(zhǎng)速度過(guò)快，以及蛋白水解酶活性過(guò)高，從而影響目的蛋白的產(chǎn)量。表達(dá)過(guò)程中要注意防 止過(guò)量泡沫產(chǎn)生，會(huì)影響DO值，收集表達(dá)上清時(shí)培養(yǎng)菌濕重可以達(dá)到40g/L，甚至100 g/L， 甚至150 g/L，甚至更高。表達(dá)的過(guò)程可調(diào)控，可優(yōu)化，使表達(dá)量飆升有非常大的空間，這需 要在生產(chǎn)過(guò)程中不斷的進(jìn)行摸索。實(shí)施例2
以質(zhì)粒pGAPZa A為酵母表達(dá)載體，以酵母菌SMDl 168為表達(dá)宿主菌，制備方法包 括以下步驟
1.從圓環(huán)病毒2型感染豬肺臟分離病毒，全基因組擴(kuò)增得到目的基因0RF2。上游引 物為SEQ ID N0:1，下游引物為SEQ ID NO: 2，反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min，然后開(kāi)始30 個(gè)循環(huán)，90°C 30S，50°C 40S，72°C 45S，最后72°C延伸lOmin。根據(jù)酵母密碼子偏嗜性改造 0RF2基因，送生工生物工程(上海)有限公司全基因合成得到目的基因。重組質(zhì)粒標(biāo)記為 pBluescript II SK+-0RF2。目的基因序列如 SEQ ID NO:3 所示，共 734bp。2. pBluescript II SK+-0RF2 質(zhì)粒 2μ 轉(zhuǎn)化制備的 DH5 α 感受態(tài)細(xì)胞 150μ ，轉(zhuǎn) 化的菌液均勻鋪LB平板(氨芐青霉素=10(^g/mL)，次日挑取單菌落搖菌，抽提質(zhì)粒，Xho I 和/雙酶切鑒定成功后，將質(zhì)粒保存于-20°C備用。3.如實(shí)施例1步驟3所述將酵母表達(dá)載體pGAPZ α A與含目的基因的重組質(zhì) 粒pBluescript II SK+-0RF2作煬ο /和Λ^ /雙酶切，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離基 因片段，膠回收表達(dá)載體和目的基因，再使用Τ4 DNA連接酶連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體 pGAPZa A-0RF2。pGAPZ a A-0RF2轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，抽提重組質(zhì)粒，損ο /和Λ^ /雙 酶切鑒定成功后，重組質(zhì)粒保存于-20 V備用。4.重組表達(dá)載體pGAPZa A-0RF2轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞畢赤酵母SMDl 168，構(gòu)建重組表達(dá) 工程菌。將感受態(tài)A/^1Siori1S SMDl 168 (80 μ L)與 Jkt #單酶切 pGAPZ a A-0RF2 (10 μ g)相混合，1.5 kV、200Q電擊5 ms。將轉(zhuǎn)化后的酵母細(xì)胞均勻平鋪于新鮮制備YPDS平板(含 kocin 抗性lOOPg/mL)，待平板把液體吸收，將平板倒置，于30°C溫箱中培養(yǎng)至單菌落出 現(xiàn)(2天左右)。采用煮一凍一煮法制備菌液PCR模板分析A/^astoris轉(zhuǎn)化子，上游引物 為SEQ ID NO: 1，下游引物為SEQ ID N0:2能擴(kuò)增出700 bp左右的單菌落為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。 得到重組酵母工程菌pGAPZ α A-0RF2-SMD1168。5.pGAPZaA-0RF2_SMD1168用YPDS培養(yǎng)液做分泌表達(dá)。挑取表面光滑、邊緣 整齊的白色單菌落于4mLYPD培養(yǎng)液作為種子液，培養(yǎng)約24h菌液渾濁，吸取ImL重懸于 50mLYPDS 培養(yǎng)基中(裝量為 10%)，220r/min, 30°C振蕩培養(yǎng)。72h 后 5000r/min 離心 lOmin， 收集培養(yǎng)上清作SDS-PAGE或保存于-80°C備用。pGAPZ a A載體以pGAP為強(qiáng)啟動(dòng)子，在培養(yǎng)基中加入葡萄糖即可誘導(dǎo)酵母進(jìn)入蛋 白表達(dá)狀態(tài)，在YPDS培養(yǎng)基中，酵母細(xì)胞生長(zhǎng)，同時(shí)表達(dá)目的蛋白，培養(yǎng)基碳源可分批一次 性添加，也可以初始碳源適當(dāng)降低，經(jīng)過(guò)1 左右流加碳源，流加碳源的優(yōu)勢(shì)在于提高酵母 細(xì)胞的碳源利用率。溫度控制在^ 30°C，SMD1168生長(zhǎng)速度較為緩慢，但也有優(yōu)勢(shì)，不 至于使菌繁殖過(guò)快，缺陷蛋白酶，降低分泌的蛋白降解率，從而提高目的蛋白的表達(dá)量。表 達(dá)時(shí)菌液密度應(yīng)達(dá)到OD值在1. 5以上，一定范圍內(nèi)在營(yíng)養(yǎng)充足的情況下，菌液密度越高，表 達(dá)量越高。先以YPD培養(yǎng)液培養(yǎng)重組酵母菌至0D=2 6，吸取菌液重懸于YPDS培養(yǎng)液，使 OD彡1. 5，或當(dāng)達(dá)到0D=2 6時(shí)，5000r/min離心收集菌體，重懸于YPDS培養(yǎng)液，表達(dá)時(shí)間 可為3 5天，但培養(yǎng)過(guò)程中，要保證充足的溶氧值(D0)，表達(dá)pH為6. 0,6. 5更優(yōu)，7. 0更 優(yōu)，不可超過(guò)8. 0。表達(dá)過(guò)程中要注意防止培養(yǎng)液產(chǎn)生過(guò)量泡沫影響DO值，培養(yǎng)菌液濃度可 以達(dá)到40g/L，甚至100g/L，甚至150g/L，甚至更高。在表達(dá)時(shí)，培養(yǎng)液應(yīng)調(diào)控在需要范圍內(nèi)，并加入磷酸緩沖液，保持pH的穩(wěn)定，有利 于目的蛋白的穩(wěn)定存在，并且遠(yuǎn)離Cap蛋白的等電點(diǎn)pl，本實(shí)驗(yàn)中，不可低于pH6.0。適量 添加蛋白酶抑制劑和蛋白酶底物也是可取的，如EDTA、氨基酸、蛋白胨等，以不影響酵母細(xì) 胞生長(zhǎng)增殖為原則。同時(shí)要考慮酵母細(xì)胞在培養(yǎng)液中的滲透壓。分離和純化
表達(dá)完成分離上清后，上清存于-80°C待用，或不經(jīng)濃縮直接進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)目 的蛋白表達(dá)分析，以空載體表達(dá)做對(duì)照，雜蛋白極少，清晰可見(jiàn)目的蛋白條帶時(shí)，可進(jìn)行純 化蛋白用于制備亞單位疫苗。純化方法較多，少量純化Cap蛋白，可以將酵母連同上清 5，000r/min離心10分鐘，上清用分子量10，000透析袋在pH7. 4滅菌PBS緩沖液中透析直 至平衡，期間換5 7次緩沖液，有條件可以使用機(jī)械攪拌，加快透析速度。再以PEG8000 濃縮透析產(chǎn)物，將透析產(chǎn)物保留在透析袋內(nèi)置于PEG8000粉末中，直到濃縮量達(dá)到要求。大 量分離純化，建議采取離心收集上清-陶瓷膜微濾-納濾膜去鹽濃縮純化，也可以選擇膜過(guò) 濾分離上清，上清進(jìn)行超濾濃縮，再納濾除鹽。本實(shí)驗(yàn)在生物反應(yīng)器中表達(dá)，培養(yǎng)上清透析 后用Bradford法A595nm處測(cè)定總蛋白濃度，計(jì)算所表達(dá)的蛋白可高達(dá)0. 08 lg/L，凝膠 薄層掃描儀掃描，重組蛋白占總蛋白40% 80%，蛋白表達(dá)量及其依賴(lài)于菌種保存情況和表 達(dá)條件的控制，當(dāng)菌體污染或活力降低時(shí)，可能分泌較多雜蛋白，而目的蛋白分泌較少或降 解，故從構(gòu)建篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子到分泌表達(dá)目的蛋白的整個(gè)過(guò)程應(yīng)嚴(yán)格控制無(wú)菌，否則直接 嚴(yán)重影響表達(dá)量，甚至不表達(dá)。由于不受污染的理想情況下表達(dá)，雜蛋白極少，所以本發(fā)明 下游加工至多需3步，能保持蛋白活性，簡(jiǎn)單易行，表達(dá)量高，生產(chǎn)成本較低，使普遍應(yīng)用已驗(yàn)證其有效性的亞單位疫苗成為可能。實(shí)施例3.亞單位疫苗的制備
將防腐劑、保護(hù)液、穩(wěn)定劑、抗菌藥等一種或幾種成分與分離純化的Cap蛋白混合，加 入佐劑同生理鹽水或PBS混合，將混合物pH值調(diào)至生理值，即pH7. 0 7. 5，組成豬圓環(huán)病 毒亞單位疫苗。佐劑可以選用鋁膠、卡伯波971、皂角甙、脂質(zhì)體、CpG-ODN、納米佐劑、油乳 佐劑等，可選擇加入細(xì)胞因子如干擾素、白細(xì)胞介素等，其中Cap蛋白的有效成分濃度應(yīng)達(dá) 200-35(^g/mL，每劑量 200_350μβ。試驗(yàn)結(jié)果將本發(fā)明實(shí)施例1制備的Cap蛋白按照本文所述少量分離純化蛋白方 法純化后，測(cè)量Cap蛋白濃度，用生理鹽水稀釋為100(^g/mL作為抗原。此亞單位疫苗有 效抗原量為20(^g/mL，LL37抗菌肽終含量為100U/mL，加入鋁膠原液含量為約20%，按照獸 用生物制品規(guī)程要求進(jìn)行成品疫苗的檢驗(yàn)，用合格制品進(jìn)行臨床試驗(yàn)。選取表現(xiàn)健康的25 日齡斷奶仔豬20頭，25日齡時(shí)稱(chēng)重，各組仔豬體重差異不顯著，隨機(jī)分成4組，血清學(xué)檢測(cè) PCV2為陰性的仔豬有10頭。初次免疫后14天加強(qiáng)免疫，經(jīng)2周，使用豬圓環(huán)病毒2型強(qiáng)毒 株病毒液(104TCID5(1/mL) 2mL對(duì)A、B、C、D組滴鼻攻毒。按照以下表1進(jìn)行免疫試驗(yàn)
表權(quán)利要求
1.一種重組豬圓環(huán)病毒2型Cap抗原的制備方法，是采用酵母表達(dá)系統(tǒng)，制備步驟如下(1)擴(kuò)增PCV2-0RF2 基因；(2)構(gòu)建表達(dá)工程菌擴(kuò)增序列插入酵母表達(dá)載體，形成重組表達(dá)載體，線性化后轉(zhuǎn)化 畢赤酵母宿主細(xì)胞，構(gòu)建表達(dá)工程菌；(3)重組酵母菌分泌表達(dá)，得到重組豬圓環(huán)病毒2型Cap抗原蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(1)中所述PCV2-0RF2基因?yàn)?PCV2-0RF2全基因或根據(jù)酵母密碼子偏嗜性改造的PCV2-0RF2基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于擴(kuò)增PCV2-0RF2基因的引物核苷 酸序列為 SEQ ID NO: 1 和 SEQ ID NO:2。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(2)中所述酵母表達(dá)載體為 pGAPZ α A、pGAPZ α B 或 pGAPZ α C。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(2)中所述畢赤酵母宿主細(xì)胞為 酵母菌Χ33或酵母菌SMDl 168。
6.一種豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫苗，其特征在于包括權(quán)利要求1所述制備方法獲得的 抗原。
7.權(quán)利要求6所述疫苗的制備方法，是將所得抗原溶液與防腐劑、穩(wěn)定劑、抗菌藥混 合，加入佐劑，調(diào)節(jié)ρΗ為7. 0 7. 5，即得到亞單位疫苗。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于抗原有效成分濃度為200 350μβ/mLo
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的制備方法，其特征在于所述防腐劑為L(zhǎng)L37抗菌肽、甲 醛、苯酚、苯甲醇、乳酸鏈球菌素、尼泊金類(lèi)或硼砂；所述穩(wěn)定劑為乙二胺四乙酸二鈉；所 述抗菌藥物為硫酸慶大霉素或青鏈霉素；所述佐劑為鋁膠、卡伯波971、皂角甙、脂質(zhì)體、 CpG-ODN,納米佐劑或油乳佐劑。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種重組豬圓環(huán)病毒2型Cap抗原的制備方法，是采用酵母表達(dá)系統(tǒng)，先擴(kuò)增PCV2-ORF2基因，然后構(gòu)建表達(dá)工程菌，即將擴(kuò)增序列插入酵母表達(dá)載體，形成重組表達(dá)載體，線性化后轉(zhuǎn)化畢赤酵母宿主細(xì)胞，構(gòu)建表達(dá)工程菌，最后重組酵母菌分泌表達(dá)，得到重組豬圓環(huán)病毒2型Cap抗原蛋白。酵母表達(dá)系統(tǒng)對(duì)表達(dá)的蛋白有加工折疊和翻譯后修飾的功能，從而使表達(dá)的蛋白具有生物活性，比起大腸桿菌更有優(yōu)勢(shì)，但比哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)操作更簡(jiǎn)便。而與釀酒酵母相比，畢赤酵母不易過(guò)度糖基化，因此分離純化步驟簡(jiǎn)單。采用酵母表達(dá)系統(tǒng)操作簡(jiǎn)單、表達(dá)量較高，生產(chǎn)成本低，可以進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，有利于豬圓環(huán)病毒亞單位疫苗的推廣使用。
文檔編號(hào)C12N15/33GK102127533SQ20101061822
公開(kāi)日2011年7月20日 申請(qǐng)日期2010年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月31日
發(fā)明者劉娜, 劉德輝, 吳鋒, 黃毓茂 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)