專利名稱：一種細(xì)胞的載體固定化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)胞的載體固定化方法。
背景技術(shù)：
固定化技術(shù)是指利用各種理化方法將游離細(xì)胞或酶束縛在特定的空間區(qū)域內(nèi)，提 高細(xì)胞或酶的濃度，并保持生物活性和反復(fù)利用的一種技術(shù)。利用這種技術(shù)制得的細(xì)胞或 酶稱為固定化細(xì)胞或固定化酶。酶技術(shù)常應(yīng)用于生物大分子的水解以制備具有生理活性的各種小分子物質(zhì)。然而 游離酶在反應(yīng)結(jié)束后，混在產(chǎn)物中增加了產(chǎn)物分離的難度，而且游離酶直接暴露在環(huán)境中， 其催化活性受各種理化因素的影響較大。1916年Nelson和Griffin首先制備出固定化的 酶，而直到1953年Grubhofer等人才真正開(kāi)始有效的研究。與游離酶相比，固定化酶具有 以下優(yōu)點(diǎn)酶的催化效率高；可重復(fù)利用，生產(chǎn)費(fèi)用低；沒(méi)有酶脫離到產(chǎn)物中，額外加工少； 酶受到外界的影響小，酶的穩(wěn)定性高；改善了酶的行為；能夠?qū)崿F(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)，可控性強(qiáng)， 產(chǎn)品質(zhì)量有保證；有利于多酶系統(tǒng)的利用。然而，固定化酶技術(shù)仍然需要先將脂肪酶從細(xì)胞中提取出來(lái)，提取工藝通常比較 復(fù)雜，而且酶在提取和固定化過(guò)程中容易失活。1959年，Hattori和Furusaka首次將大腸 桿菌E. coli吸附在樹(shù)脂上，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞固定化。1973年，含有L-天冬氨酸酶的微生物被固 定化，并用于L-天冬氨酸的生產(chǎn)。20世紀(jì)70年代末，動(dòng)物、植物固定化細(xì)胞技術(shù)也得到了 快速的發(fā)展。目前隨著對(duì)細(xì)胞固定化技術(shù)的深入研究，固定化活細(xì)胞或稱為固定化增殖細(xì) 胞的研究工作幾乎涵蓋了所有的微生物發(fā)酵工藝，已有大量的研究文獻(xiàn)發(fā)表，并且部分研 究成果已應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐，比如啤酒生產(chǎn)、氨基酸、有機(jī)酸發(fā)酵、抗生素生產(chǎn)和污水處理等。與固定化酶相比，固定化細(xì)胞主要具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)
一，不需要將酶從微生物細(xì)胞中提取出來(lái)并加以純化，酶活力損失小、成本低。二，細(xì)胞生長(zhǎng)停滯時(shí)間短，細(xì)胞多、反應(yīng)快，抗污染能力強(qiáng)，可以連續(xù)發(fā)酵，反復(fù)使 用，應(yīng)用成本低。三，酶處于天然細(xì)胞的環(huán)境中，穩(wěn)定性高。四，使用固定化細(xì)胞反應(yīng)器，可邊加入培養(yǎng)液，邊培養(yǎng)排出發(fā)酵液，能有效地避免 反饋抑制和產(chǎn)物消耗。五，適合于進(jìn)行多酶順序連續(xù)反應(yīng)。六，易于進(jìn)行輔助因子的再生，因而更適合于需要輔助因子的反應(yīng)，如氧化還原反 應(yīng)、合成反應(yīng)等。因此，該技術(shù)的應(yīng)用已經(jīng)超過(guò)固定化酶的應(yīng)用。固定化細(xì)胞技術(shù)雖然具有廣闊的應(yīng)用前景，但大多是在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模上進(jìn)行研究， 要真正實(shí)用化或工業(yè)應(yīng)用，還有以下問(wèn)題需要解決
一，固定化細(xì)胞的穩(wěn)定性問(wèn)題，由于固定化的材料對(duì)微生物的毒性、固定化條件、固定 化過(guò)程中的放熱等都對(duì)細(xì)胞有影響而使部分細(xì)胞失活。二，固定化細(xì)胞批量生產(chǎn)裝置的開(kāi)發(fā)，這是固定化細(xì)胞技術(shù)從實(shí)驗(yàn)室走向?qū)嶋H應(yīng)用的重要一步。三，廉價(jià)耐用的固定化載體及復(fù)合固定化技術(shù)的研究與開(kāi)發(fā)。四，高效固定化反應(yīng)器的開(kāi)發(fā)。固定化細(xì)胞技術(shù)主要依賴的是載體中處于固著態(tài) 的細(xì)胞，如何使載體中固定足夠多的細(xì)胞對(duì)于實(shí)現(xiàn)固定化細(xì)胞反應(yīng)器的高效生產(chǎn)無(wú)疑具有 著重要的意義。細(xì)胞的固定方法按照固定的機(jī)制和支持介質(zhì)主要可分為四種表面吸附、包埋、膜 固定、自聚集。表面吸附簡(jiǎn)單易行，但存在吸附率低、細(xì)胞易收環(huán)境影響的缺點(diǎn)；膜固定的方 法適合于生產(chǎn)細(xì)胞外分泌的大分子物質(zhì)，但產(chǎn)物和培養(yǎng)液成分容易在膜表面沉積，堵塞膜 孔；自聚集的發(fā)生受培養(yǎng)液成分及培養(yǎng)條件的影響，但至今還不甚清楚；包埋法是當(dāng)前工 業(yè)上應(yīng)用最多的固定化細(xì)胞的方法，其原理是使細(xì)胞擴(kuò)散進(jìn)入多孔性載體內(nèi)部或?qū)⒓?xì)胞包 裹在凝膠網(wǎng)格結(jié)構(gòu)中或半透性薄膜內(nèi)，小分子底物和產(chǎn)物可以自由擴(kuò)散，而細(xì)胞卻不會(huì)擴(kuò) 散到周?chē)橘|(zhì)中去。該法操作簡(jiǎn)單，對(duì)細(xì)胞活性影響小，盡管包埋材料會(huì)一定程度阻礙底物 和氧擴(kuò)散，并對(duì)大分子底物不適用，但仍是目前研究最廣泛的固定化方法。以凝膠為包埋劑 的固定化方法存在機(jī)械強(qiáng)度低、傳質(zhì)阻力較大的缺點(diǎn)，而采用多孔載體包埋細(xì)胞時(shí)，載體的 載量及固著態(tài)細(xì)胞的分布不易控制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及到的方法是針對(duì)采用多孔載體包埋細(xì)胞時(shí)存在的缺點(diǎn)加以改進(jìn)而成 的，目的是使載體中固著足夠多的細(xì)胞并實(shí)現(xiàn)細(xì)胞在載體內(nèi)的均勻分布。本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
一種細(xì)胞的載體固定化方法，其特征在于包括以下步驟
1)制備包含被固定細(xì)胞的種子液；
2)制備適合細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)液；
3)在置于反應(yīng)容器中的接種筒內(nèi)注入培養(yǎng)液，直至培養(yǎng)液體積占反應(yīng)容器體積的 709Γ80%，其中，該接種筒上下口密封，筒壁均勻分布通孔，筒外套接一整塊呈中空?qǐng)A柱狀的 載體；
4)將種子液引至接種筒內(nèi)，種子液加入量為培養(yǎng)液體積的19Γ10%；
5)繼續(xù)在接種筒內(nèi)注入培養(yǎng)液，同時(shí)開(kāi)啟出料管，使反應(yīng)容器內(nèi)的總液體體積始終 保持在反應(yīng)容器體積的90%以下；
6)通過(guò)濁度計(jì)監(jiān)測(cè)滲透出載體的液體中的細(xì)胞濃度，判斷固定化終點(diǎn)。優(yōu)化地，上述固定化方法的步驟6)替換為通過(guò)濁度計(jì)監(jiān)測(cè)滲透出載體的液體中 的細(xì)胞濃度，達(dá)到預(yù)設(shè)的逆流值時(shí)，開(kāi)始30分鐘的逆流程序使載體外的液體逆向滲透載 體至接種筒內(nèi)，逆流程序結(jié)束后即為固定化終點(diǎn)。優(yōu)化地，所述反應(yīng)容器內(nèi)對(duì)稱設(shè)有至少兩個(gè)接種筒。優(yōu)化地，所述接種筒的通孔直徑為0.2mm 1mm。本發(fā)明更詳盡的敘述如下
一種使載體中固定化細(xì)胞均勻分布的方法是通過(guò)設(shè)計(jì)一種不銹鋼接種筒實(shí)現(xiàn)的。該圓 筒1-2底部開(kāi)放，筒外邊緣有一圈螺紋，可以與一個(gè)不銹鋼底盤(pán)接合，從而使底部封閉，種 子液自流路4-14、4-15、4-16進(jìn)入接種圓筒中。接種筒的頂部具塞，塞子中央有攪拌器接入口，筒壁密布小孔。使用時(shí)，將接種筒安裝到不銹鋼底盤(pán)上，底盤(pán)中央具有一基座，可以放置攪拌器 軸，接種筒頂部塞子穿過(guò)攪拌軸將接種筒封閉，多孔載體設(shè)計(jì)成空心圓筒狀，內(nèi)徑Cl1與接種 筒外徑d2滿足Cl1=Cl2，從而可以將載體套在接種筒上。再通過(guò)接種筒向接種裝置中添加發(fā)酵 培養(yǎng)液至終體積為反應(yīng)容器容積的709Γ80%。對(duì)添加有發(fā)酵培養(yǎng)液的反應(yīng)容器進(jìn)行高壓滅 菌后，按照19Γ10%的接種量向接種筒中添加種子液。最后，換用新鮮、滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)液從 流路4-15、4-16通入，置換筒內(nèi)原有的種子液，種子液則經(jīng)筒壁上的小孔流入載體并最終 固定在載體中?；蛘呱鲜龅呐囵B(yǎng)液皆為事先滅菌。作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案，前述的不銹鋼接種筒的尺寸可以根據(jù)固定化細(xì)胞生 物反應(yīng)器及所需載體的大小而定，底盤(pán)上可以設(shè)計(jì)出一至數(shù)個(gè)螺紋接口，以便與一至數(shù)個(gè) 接種筒連接。當(dāng)連接兩個(gè)以上接種筒時(shí)，取消攪拌軸內(nèi)置的設(shè)計(jì)，即將攪拌軸置于接種筒 外，同時(shí)，接種管路不再?gòu)慕臃N筒底部接入接種筒、而是由原來(lái)攪拌軸所處位置進(jìn)入接種筒。前述的使載體中固定化細(xì)胞均勻分布的方法，其不銹鋼接種筒還可以設(shè)計(jì)成如圖 3所示。接種筒底部封閉，攪拌軸外置，不銹鋼底盤(pán)上設(shè)計(jì)可以安放不銹鋼接種筒的凹槽。 這種設(shè)計(jì)適用于同時(shí)安裝多個(gè)接種筒的情況。前述的使載體中固定化細(xì)胞均勻分布的方法，其不銹鋼接種筒的筒壁上分布的小 孔直徑為0. 2mnTlmm，實(shí)際使用中根據(jù)菌種的類(lèi)別和種子液的特性設(shè)計(jì)成不同的尺寸。前述的使載體中固定化細(xì)胞均勻分布的方法，其待固定載體的外環(huán)境中安裝有一 濁度計(jì)，可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)經(jīng)載體流出的培養(yǎng)液中的游離細(xì)胞的濃度，從而判斷出細(xì)胞固定化 的終點(diǎn)。前述的使載體中固定化細(xì)胞均勻分布的方法，其經(jīng)載體流出的培養(yǎng)液先經(jīng)流路 4-17進(jìn)入容器4-4，再由流路4-17前半段管路、流路4_18、流路4_15、流路4_16構(gòu)成一循 環(huán)回路。如此多次循環(huán)，直至載體中達(dá)到最佳載量。前述的使載體中固定化細(xì)胞均勻分布的方法，其接種好的載體可以根據(jù)需要直接 用于固定化發(fā)酵反應(yīng)或者在無(wú)菌條件下分割成適當(dāng)大小的載體顆粒。前述的使載體中固定化細(xì)胞均勻分布的方法，其流路可以逆向進(jìn)行，即逆流程序， 即容器4-4中自載體流出的培養(yǎng)液在泵4-6的作用下，經(jīng)流路4-17流回反應(yīng)器，而與此同 時(shí)，接種筒中的培養(yǎng)液在泵4-5的作用下，經(jīng)流路4-16、4-15流回容器4-2中。如此多次循 環(huán)，使空心圓柱狀載體內(nèi)外側(cè)的細(xì)胞密度一致，即實(shí)現(xiàn)固定化細(xì)胞的均勻分布，逆流程序優(yōu) 選30分鐘。前述的使載體中固定化細(xì)胞均勻分布的方法，其中的不銹鋼接種筒可以用于一種 新型固定化細(xì)胞生物反應(yīng)器(圖5)中，用于DHA/EPA、風(fēng)味肽等海洋活性物質(zhì)的連續(xù)酶解富 集和多次酶解制備。待細(xì)胞固定在載體中后，以原料液取代初始培養(yǎng)液，繼續(xù)利用循環(huán)泵 4-5將原料液經(jīng)流路4-15、流路4-16泵入不銹鋼接種筒，同時(shí)，開(kāi)啟循環(huán)泵4-6，將滲到載體 外的反應(yīng)液抽出，經(jīng)流路4-17進(jìn)入收集瓶中。如此實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的連續(xù)酶解富集。前述的使載體中固定化細(xì)胞均勻分布的方法，其中的不銹鋼接種筒可以用于一種 新型固定化細(xì)胞生物反應(yīng)器中，用于DHA/EPA、風(fēng)味肽等海洋活性物質(zhì)的連續(xù)酶解富集和 多次酶解制備，其中所述的多次酶解制備是通過(guò)如圖4所示的流路實(shí)現(xiàn)的。原料液加入不銹鋼接種筒中后，關(guān)閉閥門(mén)4-9、閥門(mén)4-11，利用循環(huán)泵 將滲到載體外的反應(yīng)液經(jīng)流路 4-17、流路4-18、流路4-15、流路4-16重新泵入不銹鋼接種筒中，進(jìn)行二次酶解反應(yīng)。通過(guò) 定時(shí)取樣檢測(cè)，確定重復(fù)酶解的次數(shù)。如此實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的多次酶解制備。本發(fā)明細(xì)胞固定化方法適用于普通微生物細(xì)胞和酶等，尤其適用于假絲酵母細(xì) 胞。與現(xiàn)有固定化方法相比，本發(fā)明涉及到的使載體中固定化細(xì)胞均勻分布的方法具 有以下優(yōu)勢(shì)
(1)操作簡(jiǎn)單、對(duì)細(xì)胞活性影響小、固著態(tài)細(xì)胞密度大，適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)；
(2)設(shè)計(jì)一種不銹鋼接種筒，適當(dāng)放大之后，即可用于細(xì)胞的固定化，又可用于固定化 細(xì)胞生產(chǎn)；
(3)載體先整體用于細(xì)胞固定化，再根據(jù)需要分割成適當(dāng)尺寸的載體顆粒，有效避免了 將小顆粒載體直接用于細(xì)胞固定化所產(chǎn)生的細(xì)胞固著不均勻及載體利用率不高的缺點(diǎn)。


圖1本發(fā)明設(shè)計(jì)的單筒、有螺紋接口接種裝置各部件及其組裝示意圖。圖2本發(fā)明設(shè)計(jì)的多筒、有螺紋接口接種裝置各部件及其組裝示意圖。圖3本發(fā)明設(shè)計(jì)的多筒、無(wú)螺紋接口接種裝置各部件及其組裝示意圖。圖4本發(fā)明設(shè)計(jì)的固定化過(guò)程各流路示意圖。圖5應(yīng)用本發(fā)明設(shè)計(jì)的接種筒進(jìn)行固定化細(xì)胞生產(chǎn)的生物反應(yīng)器示意圖。圖中各附圖標(biāo)記含義見(jiàn)下表
權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞的載體固定化方法，其特征在于包括以下步驟1)制備包含被固定細(xì)胞的種子液；2)制備適合細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)液；3)在置于反應(yīng)容器中的接種筒內(nèi)注入培養(yǎng)液，直至培養(yǎng)液體積占反應(yīng)容器體積的 709Γ80%，其中，該接種筒上下口密封，筒壁均勻分布通孔，筒外套接一整塊呈中空?qǐng)A柱狀的 載體；4)將種子液引至接種筒內(nèi)，種子液加入量為培養(yǎng)液體積的19Γ10%；5)繼續(xù)在接種筒內(nèi)注入培養(yǎng)液，同時(shí)開(kāi)啟出料管，使反應(yīng)容器內(nèi)的總液體體積始終保 持在反應(yīng)容器體積的90%以下；6)通過(guò)濁度計(jì)監(jiān)測(cè)滲透出載體的液體中的細(xì)胞濃度，判斷固定化終點(diǎn)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化方法，其特征在于包括以下步驟1)制備包含被固定細(xì)胞的種子液；2)制備適合細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)液；3)在置于反應(yīng)容器中的接種筒內(nèi)注入培養(yǎng)液，直至培養(yǎng)液體積占反應(yīng)容器體積的 709Γ80%，其中，該接種筒上下口密封，筒壁均勻分布通孔，筒外套接一整塊呈中空?qǐng)A柱狀的 載體；4)將種子液引至接種筒內(nèi)，種子液加入量為培養(yǎng)液體積的19Γ10%；5)繼續(xù)在接種筒內(nèi)注入培養(yǎng)液，同時(shí)開(kāi)啟出料管，使反應(yīng)容器內(nèi)的總液體體積始終保 持在反應(yīng)容器體積的90%以下；6)通過(guò)濁度計(jì)監(jiān)測(cè)滲透出載體的液體中的細(xì)胞濃度，達(dá)到預(yù)設(shè)的逆流值時(shí)，開(kāi)始30分 鐘的逆流程序使載體外的液體逆向滲透載體至接種筒內(nèi)，逆流程序結(jié)束后即為固定化終 點(diǎn)ο
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的固定化方法，其特征在于所述反應(yīng)容器內(nèi)對(duì)稱設(shè)有至少 兩個(gè)接種筒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的固定化方法，其特征在于所述接種筒的通孔直徑為0.2mm Imm0
全文摘要
本發(fā)明涉及一種可以使載體中固定化細(xì)胞均勻分布的方法，具體指的是一種采用一個(gè)具塞且壁上密布小孔的不銹鋼筒接種筒，使載體套在圓筒上，通過(guò)加壓將種子液由圓筒內(nèi)轉(zhuǎn)移到載體中，配合特定的反沖裝置實(shí)現(xiàn)固定化細(xì)胞在載體中均勻分布的方法。與現(xiàn)有固定化方法相比，本發(fā)明涉及到的使載體中固定化細(xì)胞均勻分布的方法具有以下優(yōu)勢(shì)操作簡(jiǎn)單、對(duì)細(xì)胞活性影響小、固著態(tài)細(xì)胞密度大，適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)；設(shè)計(jì)一種不銹鋼接種筒，適當(dāng)放大之后，既可用于細(xì)胞的固定化，又可用于固定化細(xì)胞生產(chǎn)；載體先整體用于細(xì)胞固定化，再根據(jù)需要分割成適當(dāng)尺寸的載體顆粒，有效避免了將小顆粒載體直接用于細(xì)胞固定化所產(chǎn)生的細(xì)胞固著不均勻及載體利用率不高的缺點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N11/00GK102140445SQ20101061850
公開(kāi)日2011年8月3日 申請(qǐng)日期2010年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月31日
發(fā)明者何鍵東, 滕宏飛, 王朋, 羅紅宇, 辛建美 申請(qǐng)人:浙江海洋學(xué)院