專利名稱：一種內(nèi)參內(nèi)置型雙熒光素酶報告載體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種用于微小RNA(microRNA)靶 分子鑒定和活性分析的報告載體。
背景技術(shù)：
微小RNA (microRNA)是一類長約19 25nt、能在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)節(jié)靶mRNA表 達(dá)的小分子單鏈非編碼 RNA (CHIANG，H. R. ；SCHOENFELD, L. W. ；RUBY, J. G. ；AUYEUNG, V. C.； SPIES, N. ；BAEK, D. JOHNSTON, W. K. ；RUSS, C. ；LU0, S. ；BABIARZ, J. E. ；BLELLOCH, R.； SCHROTH, G.P. ；NUSBAUM, C.andBARTEL, D.P. (2010). Mammalian microRNAs experimental evaluation of noveland previously annotated genes.Genes Dev, vol. no. p.doi gad. 1884710 [pii] 10. 1101/gad. 1884710.)。它們廣泛存在于真核生物體內(nèi)，參與生物體發(fā) 育過程中細(xì)胞分化、增殖、凋亡等多種生理病理途徑的調(diào)控(S0NG，G. ；ZHANG, Y. andffANG, L. (2009) · MICR0RNA-206 targets N0TCH3, activates apoptosis, inhibitstumor cell migration and foci formation. J Biol Chem,vol. no. p. doi :M109. 046862[pii]10. 1074/ jbc. M109. 046862.)。目前普遍認(rèn)為，miRNA及其靶mRNA結(jié)合的特異性主要由“種子序列 (seed sequence) ” (guide strand 的第 2 至第 8 個核苷酸)調(diào)控(BRENNECKE, J. ；STARK, Α. ；RUSSELL,R. B. and COHEN,S. Μ. (2005). Principles ofmicroRNA-target recognition. PLoS Biol, vol. 3，no. 3，p. e85. doi :10. 1371/journal. pbio. 0030085.)。已有證據(jù)表明， miRNA識別靶標(biāo)mRNA序列的特異性并不是很高。在動物體內(nèi)，微小RNA與靶分子序列不需要 完全互補(bǔ)即可發(fā)揮作用，有研究者指出，有一些miRNA的靶mRNA可以多達(dá)數(shù)百種(BACKES， C. ；MEESE,E. ；LENH0F,H. P. and KELLER,Α. (2010). A dictionary on microRNAsand their putative target pathways. Nucleic Acids Res, vol. 38, no. 13, p.4476—4486. doi gkql67[pii] 10. 1093/nar/gkql67.)。因此如何快速準(zhǔn)確的篩選和鑒定微小RNA的靶分子 是目前微小RNA研究領(lǐng)域的最大瓶頸。目前已有多個報告系統(tǒng)用于實現(xiàn)上述目的，其中最 常用的是雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)(BARTEL，D. P. (2009). MicroRNAs target recognition and regulatory functions. Cell, vol. 136，no. 2，p. 215—233. doi :S0092_8674(09)00008 -7[pii] 10. 1016/j. cell. 2009. 01. 002.)。現(xiàn)有的雙熒光素酶報告系統(tǒng)包括兩個單獨(dú)的載 體，一個含有海腎熒光素酶基因(徹1^11￡1111(^作1^紹，1 111(3)，在其3’^1 含有多克隆位點(diǎn)， 用于克隆預(yù)測靶基因的目的片段；另一個含有螢火蟲熒光素酶基因(Firefly luciferase, Flue)，用作轉(zhuǎn)染和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)參。因此，這個報告系統(tǒng)需要制備，轉(zhuǎn)染兩個載體，其缺 點(diǎn)顯而易見(1)步驟較為復(fù)雜，無形中增加了物質(zhì)成本和勞動量；( 重復(fù)性差，批次內(nèi)差 異和批次間差異較大，結(jié)果不穩(wěn)定，易造成誤判。針對上述缺陷，我們設(shè)計了內(nèi)參內(nèi)置型熒 光素酶報告載體，利用一步式二元搭橋耦聯(lián)長距離PCR及大腸桿菌體內(nèi)同源重組方法，將 螢火蟲熒光素酶基因和海腎熒光素酶基因置于同一個載體上，同時在海腎熒光素酶基因的 3’非翻譯區(qū)引入多克隆位點(diǎn)以方便目的片段的克隆。相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有重復(fù)性高， 復(fù)孔變異小，操作簡便，定量準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的內(nèi)置型雙熒光素酶報告載體適用于微小RNA靶分子的篩選，鑒定和確認(rèn)，也適用于在細(xì)胞水平定量分析微小RNA的活性變化.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種內(nèi)參內(nèi)置型雙熒光素酶報告載體，使其 不僅可以用于微小RNA靶分子的篩選，鑒定和確認(rèn)，同時也可以作為生物感應(yīng)器，測量體內(nèi) 微小RNA的生物學(xué)活性。本發(fā)明首先提供一種內(nèi)參內(nèi)置型雙熒光素酶報告載體，螢火蟲熒光素酶基因融合 到pRL-TK載體的海腎熒光素酶基因和氨芐青霉素抗性基因之間，兩種熒光素酶處于同一 個載體上，螢火蟲熒光素酶基因作為內(nèi)參，序列為SEQ ID No:4所示。本發(fā)明還提供上述內(nèi)參內(nèi)置型雙熒光素酶報告載體的構(gòu)建方法。該方法包括以下 步驟(1)根據(jù)螢火蟲熒光素酶基因和報告載體pRL-TK的序列，設(shè)計、合成嵌合體引物 pF-Fluc, pR-Fluc 和 PiR ；其中，pF-Fluc 為5，AAGGATCCAGGTGGCACTTTTCG TGCGATCTGCATCTCAATTAG3',pR-Fluc 為
權(quán)利要求
1.一種內(nèi)參內(nèi)置型雙熒光素酶報告載體，其特征在于，螢火蟲熒光素酶基因融合到 pRL-ΤΚ載體的海腎熒光素酶基因和氨芐青霉素抗性基因之間，兩種熒光素酶處于同一個載 體上，螢火蟲熒光素酶基因作為內(nèi)參，序列為SEQ ID No:4所示。
2.權(quán)利要求1所述內(nèi)參內(nèi)置型雙熒光素酶報告載體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以 下步驟(1)根據(jù)螢火蟲熒光素酶基因和報告載體PRL-TK的序列，設(shè)計、合成嵌合體引物 pF-Fluc, pR-Fluc 和 PlR ；其中，pF-Fluc 為5’ AAGGATCCAGGTGGCACTTTTCGTGCGATCTGCATCTCAATTAG3’， pR-Fluc 為5’ GAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACCTCACATGTTCTTTCCTGC3’ PlR 為 5’ CGAAAAGTGCCACCTGGATCCTT3‘；(2)實施一步二元式搭橋耦聯(lián)長距離PCR方法，獲得螢火蟲熒光素酶基因和報告載體 pRL-ΤΚ的融合線性片段；(3)Dpn /消化PCR產(chǎn)物，去除帶甲基化的模板質(zhì)粒DNA ；(4)轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5α ；(5)挑取單克隆菌落測序鑒定；(6)酶切確認(rèn)重組質(zhì)粒的整合情況。
3.權(quán)利要求1所述的內(nèi)參內(nèi)置型雙熒光素酶報告載體，用于微小RNA靶分子鑒定。
4.權(quán)利要求1所述的內(nèi)參內(nèi)置型雙熒光素酶報告載體，用于測量微小RNA的生物學(xué)活性。
5.權(quán)利要求1所述的內(nèi)參內(nèi)置型雙熒光素酶報告載體表達(dá)活性的評價方法，其特征 為，在哺乳動物細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染不同濃度的該報告載體，通過檢測熒光素酶活性來測試其表 達(dá)特性以及線性范圍。
6.如權(quán)利要求5所述的評價方法，其特征在于，哺乳動物細(xì)胞系包括人宮頸癌Hela細(xì) 胞，非洲綠猴腎細(xì)胞Vero，小鼠肌原細(xì)胞C2C12。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種內(nèi)參內(nèi)置型雙熒光素酶報告載體及其應(yīng)用。螢火蟲熒光素酶基因融合到pRL-TK載體的海腎熒光素酶基因和氨芐青霉素抗性基因之間，兩種熒光素酶處于同一個載體上，螢火蟲熒光素酶基因作為內(nèi)參。利用一步式二元搭橋耦聯(lián)長距離PCR及大腸桿菌體內(nèi)同源重組方法,將螢火蟲熒光素酶基因和海腎熒光素酶基因置于同一個載體上,同時在海腎熒光素酶基因的3’非翻譯區(qū)引入單克隆位點(diǎn)以方便目的片段的克隆,由此構(gòu)建成內(nèi)參內(nèi)置型的雙熒光素酶報告載體。本發(fā)明具有重復(fù)性高,復(fù)孔變異小,操作簡便,定量準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明適用于微小RNA靶分子的篩選、鑒定和確認(rèn),也適用于在細(xì)胞水平定量分析微小RNA的活性變化。
文檔編號C12N15/52GK102094037SQ20101058367
公開日2011年6月15日 申請日期2010年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月13日
發(fā)明者喬憲鳳, 劉西梅, 華再東, 華文君, 周荊榮, 姜黎, 張立萍, 李莉, 歐陽輝伍, 畢延震, 潘文, 肖紅衛(wèi), 邵長偉, 鄭新民, 魏慶信 申請人:湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所