專利名稱：一株干酪乳桿菌及其選育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株干酪乳桿菌及其選育方法，屬于食品生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
干酪乳桿菌是一類廣泛使用的益生菌，作為工業(yè)化的細(xì)胞工廠，干酪乳桿菌在食 品、發(fā)酵等領(lǐng)域成為生產(chǎn)的主力軍，具有極高的經(jīng)濟價值。然而，在實際的工業(yè)生產(chǎn)過程中， 干酪乳桿菌卻不可避免的面臨著來自外界環(huán)境的各種不利條件的影響。隨著發(fā)酵的不斷進 行，有機酸積累量不斷增加，在此過程中，發(fā)酵生成的乳酸、乙酸被動擴散進入細(xì)胞質(zhì)，快速 解離成不能被細(xì)胞膜滲出的質(zhì)子和攜帶電荷的酸根離子，并導(dǎo)致胞內(nèi)PH的急劇下降和ATP 合成能力的匱乏，嚴(yán)重影響了細(xì)胞的生物量和生理活性，限制了細(xì)胞的正常生長和代謝，大 大降低了生產(chǎn)效率。同時，以干酪乳桿菌為主題的活菌益生產(chǎn)品，在人體胃腸道中還面臨著 諸如胃酸、膽鹽等環(huán)境脅迫。因此，如何保持干酪乳桿菌的菌體活性成為學(xué)術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界共 同關(guān)注的焦點問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一株干酪乳桿菌，該菌株于2010年11月4日， 保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO =M 201(^92，地址中國，武漢，武 漢大學(xué)，其分類學(xué)命名為干酪乳桿菌Lb-2 {Lactobacillus casei Lb_2)。所述干酪乳桿菌在pH 4. 3的條件下，0D_值達到3. 12，相對于選育前提高了 56. 78%ο本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是提供一種選育耐酸性乳酸菌的方法。解決上述問題的技術(shù)方案為將出發(fā)菌株培養(yǎng)至穩(wěn)態(tài)，降低培養(yǎng)體系PH值，按照 一定稀釋率流加培養(yǎng)基至穩(wěn)態(tài)，再次降低體系pH值，按照一定稀釋率流加培養(yǎng)基至穩(wěn)態(tài)； 重復(fù)上述過程，直至選育得到一株耐酸性乳酸菌。所述出發(fā)菌株為干酪乳桿菌ilactobacillus casei)，購自美國ATCC，編號為 ATCC No: 334ο所述穩(wěn)態(tài)是指細(xì)胞生長達到穩(wěn)定狀態(tài)。所述流加培養(yǎng)基，主要是流加生長限制因子來調(diào)控微生物生長繁殖與代謝速度的 連續(xù)培養(yǎng)方式。所述按照一定稀釋率流加，是以恒定的速率流入培養(yǎng)基，以恒定的速率流出培養(yǎng) 液，從而保證了培養(yǎng)基化學(xué)成分的穩(wěn)定，使培養(yǎng)系統(tǒng)中的微生物始終保持穩(wěn)定的生長速度。本發(fā)明選育得到的干酪乳桿菌Lb-2 (CCTCC NO =M 201(^92)在較低pH的條件下， 具有更好生長性能，具有良好的乳酸、鹽酸和膽鹽耐受性；本發(fā)明提供的選育方法，簡單易 行并且效果明顯。
具體實施例方式實施例1干酪乳桿菌(CCTCC NO =M 2010292)的選育方法
以商業(yè)化的干酪乳桿菌(LactohciBm casei) ATCC334為出發(fā)菌株，將其在種子培 養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，接種于pH5. 3的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)至0D_=3. 0后，按照稀釋率 0. 1 h—1的流加速率向恒化器中流加發(fā)酵培養(yǎng)基至穩(wěn)態(tài)，再降低培養(yǎng)體系pH至5.0，停止流 加(D=O)。此時細(xì)胞在pH5. 0的培養(yǎng)基中生長，當(dāng)菌體濃度達到0D_=3. 0時，流加流加新 鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基直至達到穩(wěn)態(tài)。如此反復(fù)操作逐漸降低發(fā)酵PH至4. 3，且生長達到平衡。取恒化培養(yǎng)的最終培養(yǎng)液，經(jīng)適當(dāng)稀釋涂布pH4. 3的平板，挑選單菌落，將單菌落 于PH為4. 3條件下發(fā)酵，根據(jù)生物量大小篩選出突變菌株。得到多株具有耐受高濃度環(huán) 境脅迫抗性的干酪乳桿菌，其中一株命名為干酪乳桿菌Lb-2，其分類學(xué)命名為干酪乳桿菌 Lb-2 Lactobacillus casei Lb-2)，于2010年11月4日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心， 保藏編號為 CCTCC NO =M 2010292o所述恒化培養(yǎng)的裝置稱為恒化器，購自New Brunswick公司，大小為1. 3 L，裝液量 為 0. 7 L0實施例2干酪乳桿菌Lb-2酸脅迫條件下的生長特性 1、菌種活化
將保藏于_70°C甘油管中的出發(fā)菌株干酪乳桿菌(Lacto如以7ΛΛ5 casei) ATCC 3；34及 選育到的干酪乳桿菌Lb-2以1的接種量接入種子培養(yǎng)基，在37°C靜置培養(yǎng)16h。2、種子培養(yǎng)
以H的接種量分別取活化好的干酪乳桿菌ATCC 334和干酪乳桿菌Lb-2到種子培養(yǎng) 基，37。c,靜置培養(yǎng)至至對數(shù)中期。3、發(fā)酵罐培養(yǎng)
以2 %的接種量將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液分別轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，控制發(fā)酵灌的pH為4. 3， 以乳酸和鹽酸作為PH調(diào)節(jié)劑，于37 0CUOO rpm條件下培養(yǎng)64 h。發(fā)酵結(jié)束后測定發(fā)酵液 中菌體，在PH分別為4.3的條件下，最終干酪乳桿Lb-2，菌體濃度比干酪乳桿菌ATCC 334 提高了 56. 78%，結(jié)果如表1所示。所述種子培養(yǎng)基為葡萄糖20 g ΙΛ蛋白胨10 g L—1，牛肉膏10 g L—1，酵母浸出 汁5 g L—1，無水乙酸鈉5 g ΙΛ磷酸二氫鉀2 g L—1，檸檬酸三銨2 g L-1，MgSO4 · 7H20 0. 2 g Γ1，MnSO4 · H2O 0. 05 g Γ1，pH 6. 5。所述發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖8 g L—1，蛋白胨10 g L—1，牛肉膏10 g L—1，酵母浸出汁 5 g L—1，無水乙酸鈉5 g L—1，磷酸二氫鉀2 g L—1，檸檬酸三銨2 g L-1，MgSO4 · 7H20 0. 2 g ΙΛ MnSO4 · H2O 0. 05 g Γ1。表1酸脅迫條件下菌體生長特性
權(quán)利要求
1.一株干酪乳桿菌，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO =M 2010292。
2.一株權(quán)利要求1所述干酪乳桿菌，其特征在于，將菌株置于pH 4. 3的乳酸中脅迫3 h，存活率為12. 36%。
3.一株權(quán)利要求1所述干酪乳桿菌，其特征在于，將菌株置于pH 2. 5的鹽酸中脅迫3 h，存活率為71.62%。
4.一株權(quán)利要求1所述干酪乳桿菌，其特征在于，將菌株置于1.6%的膽鹽中脅迫3 h， 存活率為2. 71%。
5.一種權(quán)利要求1所述干酪乳桿菌的選育方法，包括如下步驟1)將出發(fā)菌株培養(yǎng)至穩(wěn)態(tài)；2)降低培養(yǎng)體系pH值；3)流加一定稀釋率的培養(yǎng)基至菌株達到穩(wěn)態(tài)；4)循環(huán)步驟2)到步驟3)逐步降低至目標(biāo)pH，以使菌株達到穩(wěn)態(tài)；5)從最終培養(yǎng)液中分離單菌落。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，具體步驟如下1)將干酪乳桿菌ATCC3!M培養(yǎng)至0D6(K1=3.0 ；2)降低培養(yǎng)體系pH;3)按稀釋率0.1 流加培養(yǎng)基至0D6(K1=3. 0 ；4)循環(huán)步驟2)到步驟3)逐步降低pH至4.3，且菌株生長達到平衡；5)從最終培養(yǎng)液中分離單菌落。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于，培養(yǎng)基為葡萄糖8g L—1，蛋白胨10 g L—1，牛肉膏10 g L—1，酵母浸出汁5 g L—1，無水乙酸鈉5 g L—1，磷酸二氫鉀2 g L—1，檸檬 酸三銨 2 g ΙΛ MgSO4 · 7Η20 0. 2 g Λ MnSO4 · H2O 0. 05 g Γ1。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株干酪乳桿菌及其選育方法，屬于食品生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明將干酪乳桿菌ATCC334恒化培養(yǎng)至穩(wěn)態(tài)，降低培養(yǎng)體系pH值，按照一定稀釋率流加培養(yǎng)基至穩(wěn)態(tài)，再次降低體系pH值，按照一定稀釋率流加培養(yǎng)基至穩(wěn)態(tài)；重復(fù)上述過程，直至篩選到一株耐低pH值的干酪乳桿菌(CCTCC NOM2010292)。選育得到的菌株在pH4.3的培養(yǎng)基中生物量較原始菌株提高了50%，并且對pH3.3的乳酸、pH2.5的鹽酸以及1.6%的膽鹽的耐受性分別提高了103倍、4.8倍和2.3倍。本發(fā)明有效地提高了乳酸菌對環(huán)境脅迫的耐受性，可用于選育食品工業(yè)中具有環(huán)境脅迫抗性的乳酸菌。
文檔編號C12R1/245GK102080058SQ20101057946
公開日2011年6月1日 申請日期2010年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月9日
發(fā)明者吳重德, 堵國成, 張娟, 陳堅 申請人:江南大學(xué)