專利名稱：檢測豬偽狂犬病毒和豬細小病毒的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測豬偽狂犬病毒和豬細小病毒的試劑盒。
背景技術(shù)：
豬偽狂犬病(PRV)和細小病毒病(PPV)是養(yǎng)豬業(yè)常見的引起豬繁殖障礙性的疾 病，且也與斷奶仔諸多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)、豬皮炎腎病綜合征(PDNS)、豬增生 性壞死性肺炎(PNP)等也有密切關(guān)系。PRV和PPV常呈混合感染。其中PRV對豬的 危害很大，可導致妊娠母豬流產(chǎn)、死產(chǎn)、木乃伊胎，初生仔豬具有明顯的神經(jīng)癥狀，死 亡率幾乎100%，PPV主要導致豬繁殖障礙，在臨床上以受感染母豬產(chǎn)出死胎、畸形胎、 木乃伊胎及病弱仔豬為特征。很多豬場都同時存在著兩種疾病，對養(yǎng)豬業(yè)造成較大經(jīng)濟 損失。因此，建立一種高效、靈敏的鑒別診斷方法對這兩種病的防治具有重要意義。雙 重PCR方法可在同一反應體系中同時對兩種病毒的目的基因進行擴增，省時、快速、敏 感、高效。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測豬偽狂犬病毒和豬細小病毒的PCR試劑。本發(fā)明提供的PCR試劑，包括引物對1和引物對2，所述引物對1中的一條引物 為序列表中的序列1所示的DNA分子，所述引物對1中的另一條引物為序列表中的序列 2所示的DNA分子，所述引物對2中的一條引物為序列表中的序列3所示的DNA分子， 所述引物對2中的另一條引物為序列表中的序列4所示的DNA分子。本發(fā)明的提供的PCR試劑，由引物對1、弓丨物對2和PCR擴增緩沖液組成；所述引物對1中的一條引物為序列表中的序列1所示的DNA分子，所述引物對 1中的另一條引物為序列表中的序列2所示的DNA分子，所述引物對2中的一條引物為 序列表中的序列3所示的DNA分子，所述引物對2中的另一條引物為序列表中的序列4 所示的DNA分子；所述引物對1中各引物和所述引物對2中各引物在所述PCR試劑中的濃度均為 0.75pmol/ μ L。所述PCR擴增緩沖液由DNA聚合酶、dNTP、DNA聚合酶緩沖液和水組成；所述dNTP在所述的PCR試劑中的濃度為312.5 μ mol/L，所述DNA聚合酶在所 述的PCR試劑中的濃度為0.1U/yL。所述引物對1和所述引物對2進行PCR擴增時的退火溫度均為54°C，退火時間 均為40s。含有所述PCR試劑的試劑盒也是本發(fā)明保護的范圍。所述的PCR試劑在制備檢測豬偽狂犬病和豬細小病毒試劑盒中的應用；所述的 試劑盒在制備檢測豬偽狂犬病和豬細小病毒試劑盒中的應用；所述的PCR試劑在檢測豬偽狂犬病和豬細小病毒中的應用；所述的試劑盒在檢測豬偽狂犬病和豬細小病毒中的應 用；以上應用均是本發(fā)明保護的范圍。 本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明提供的檢測檢測豬偽狂犬病毒和豬細小病毒的PCR 試劑，引物為兩對引物對，摸索到了最佳引物濃度、dNTP濃度、聚合酶的濃度，應用于 同時檢測PRV和PPV的雙重PCR方法中，臨床試驗證明利用該試劑能快速、特異、敏 感地從病料中檢出PRV、PPV,為PRV、PPV的臨床快速診斷和流行病學研究奠定了基 石出。


圖1為最佳退火溫度
圖2為最佳引物濃度
圖3為最佳dNTP濃度
圖4為最佳Go Taq DNA聚合酶濃度
圖5為雙重PCR方法的敏感性試驗
圖6為雙重PCR方法的特異性試驗
圖7為臨床樣品檢測結(jié)果1
圖8為臨床樣品檢測結(jié)果2
圖9商品化疫苗中PPV和PRV的檢測
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。豬偽狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV,貨號VR-1362)、豬細小病 毒(porcine parvovirus, PPV,貨號VR_742)、日本流行性乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV,貨號 VR-1259)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PorcineReproductive and Respiratory Syndrome Viras, PRRSV,貨號 VR2332)、牛皰疫病毒(Bovine herpesvirus 1，BHV-1,貨號 VR-2181)，犬細小病毒(Canine parvovirus，CPV,貨號 VR-953)，以 上均購自美國標準菌種收藏所(American Type Culture Collection, ATCC)。豬繁殖與呼吸綜合征病毒高致病性變異株(PRRSV高致病性變異株)由中國動 物疫病預防控制中心分離鑒定的NVDC-JXA1毒株，保藏編號為CGMCC No.1964，涉及 的專利號為 ZL200710086549.7。豬瘟病毒(classic swine fever virus, CSFV)為豬瘟活疫苗(兔源)，其中含有豬 瘟兔化弱毒購自青島易邦生物工程有限公司，批準文號為獸藥生字(2005) 150131001。Go Taq DNA 聚合酶(5U/ μ L)購自 Promega 公司、dNTP 購自 Amersham Biosciences 公司，Marker I 購自全式金公司、QIAmp DNA Mini and Blood Mini Kit 提取總 DNA試劑盒購自Qiagen公司，引物合成自上海英駿生物技術(shù)有限公司。所有的溶液用水除特殊說明外，均為去離子水。所有配制溶液除經(jīng)特殊說明 外，均經(jīng)15磅/in2高壓蒸汽滅菌30min后于4°C保存。50XTAE 242g Tris堿溶于700ml去離子水中，力卩57.1ml冰乙酸、100ml0.5mol/LEDTA(pH 8.0)，定容至 1000ml。溴化乙錠(EB)儲液IOOmgEB溶于IOml去離子水中，劇烈攪拌，完全溶解， 終濃度10mg/ml，室溫下避光保存。1.5%瓊脂糖凝膠稱取1.5g瓊脂糖溶于IOOml IXTAE電泳緩沖液中，融化后 加入5M 10mg/ml EB貯存液，使凝膠中EB終濃度達到0.5 μ g/ml。實施例1、雙重PCR體系的建立及條件的優(yōu)化1、引物設(shè)計與合成根據(jù)GenBank上已發(fā)表的序列，應用DNAMan軟件對PPV VP2基因(Genbank 登錄號DQ464345)、PRV gE基因(Genbank登錄號AF403049)進行同源性分析，根據(jù) 分析結(jié)果，應用Primer Primier 5.0軟件對各自保守區(qū)設(shè)計多對特異性引物，并通過NCBI BLAST對引物特異性進行鑒定，均具有良好的特異性。引物由Introvigen上海生物技術(shù) 公司合成。引物序列見表1。表IPPV和PRV雙重PCR弓丨物
權(quán)利要求
1.一種檢測豬偽狂犬病毒和豬細小病毒的PCR試劑，包括引物對1和引物對2，所述 引物對1中的一條引物為序列表中的序列1所示的DNA分子，所述引物對1中的另一條 引物為序列表中的序列2所示的DNA分子，所述引物對2中的一條引物為序列表中的序 列3所示的DNA分子，所述引物對2中的另一條引物為序列表中的序列4所示的DNA分子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PCR試劑，其特征在于所述PCR試劑由引物對1、引物 對2和PCR擴增緩沖液組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的PCR試劑，其特征在于所述引物對1中各引物和所 述引物對2中各引物在所述PCR試劑中的濃度均為0.75pmOl/l·! L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的PCR試劑，其特征在于所述PCR擴增緩沖液由DNA聚合酶、dNTP、DNA聚合酶緩沖液和水組成； 所述dNTP在所述的PCR試劑中的濃度為312.5 μ mol/L,所述DNA聚合酶在所述的 PCR試劑中的濃度為0.1U/ μ L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的PCR試劑，其特征在于所述引物對1和所述引物對2進行PCR擴增時的退火溫度均為54°C，退火時間均為40s。
6.含有權(quán)利要求1-5中任一所述PCR試劑的試劑盒。
7.權(quán)利要求1-5中任一所述的PCR試劑在制備檢測豬偽狂犬病和豬細小病毒試劑盒 中的應用。
8.權(quán)利要求6中所述的試劑盒在制備檢測豬偽狂犬病和豬細小病毒試劑盒中的應用。
9.權(quán)利要求1-5中任一所述的PCR試劑在檢測豬偽狂犬病和豬細小病毒中的應用。
10.權(quán)利要求6中所述的試劑盒在檢測豬偽狂犬病和豬細小病毒中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測豬偽狂犬病毒和豬細小病毒的試劑盒，本發(fā)明提供的檢測豬偽狂犬病毒和豬細小病毒的試劑盒，包括引物對1和引物對2，所述引物對1中的一條引物為序列表中的序列1所示的DNA分子，所述引物對1中的另一條引物為序列表中的序列2所示的DNA分子，所述引物對2中的一條引物為序列表中的序列3所示的DNA分子，所述引物對2中的另一條引物為序列表中的序列4所示的DNA分子。本發(fā)明的實驗證明，利用該試劑能快速、特異、敏感地從病料中檢出PRV、PPV，為PRV、PPV的臨床快速診斷和流行病學研究奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號C12Q1/70GK102010914SQ201010567649
公開日2011年4月13日 申請日期2010年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月25日
發(fā)明者倪建強, 夏應菊, 曲萍, 汪葆玥, 田克恭, 翟新驗, 訾占超, 韓雪, 顧小雪 申請人:中國動物疫病預防控制中心