專利名稱：一種利用雙t-dna+1載體培育高效無選擇標記轉(zhuǎn)基因作物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明設(shè)計一種高效無選擇標記轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物新方法的建立
背景技術(shù)：
糧食問題是社會和諧、穩(wěn)定的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，是每個國家關(guān)心的核心問題之一。解 決糧食安全問題是保障國民經(jīng)濟高效和可持續(xù)發(fā)展的必要前提。近幾年，隨著環(huán)境的惡化、 耕地面積的減少、人口的增長，中國的糧食問題面臨著越來越大的挑戰(zhàn)。單純依靠傳統(tǒng)的育 種方法已經(jīng)不能解決越來越嚴竣的形勢，因此利用基因工程手段改良農(nóng)作物品種、提高作 物產(chǎn)量、培育優(yōu)良的作物品種具有重要的意義。自1983年首例轉(zhuǎn)基因植物培育成功，轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到了廣泛應(yīng)用?，F(xiàn)在轉(zhuǎn)基因植 物已擴展到包括經(jīng)濟作物、糧食作物、蔬菜、花卉、藥用植物、水果、樹木以及牧草等在內(nèi)的 35個屬、120多個物種。但是隨著轉(zhuǎn)基因作物商品化生產(chǎn)的加快，一些潛在的問題逐步浮現(xiàn) 出來，選擇性標記對環(huán)境和食物的安全性問題是被廣泛關(guān)注和討論的問題。利用農(nóng)桿菌介 導(dǎo)、基因槍等方法將外源基因轉(zhuǎn)入到植物體內(nèi)，通過選擇性標記進行輔助篩選得到轉(zhuǎn)入目 的基因德轉(zhuǎn)基因陽性植株。但是，選擇標記基因既非植物體內(nèi)的基因也非目的基因，這種多 余的存在可能導(dǎo)致一些潛在危害，主要表現(xiàn)在1，目前的所用的選擇標記基因多為抗生素 抗性基因，比如卡那霉素抗性基因、潮霉素抗性基因等，這些標記隨轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品商業(yè)化后， 轉(zhuǎn)移到病原微生物中，人們擔心會影響增強病原微生物的抗藥性，導(dǎo)致抗生素的失效。2，有 些標記基因為除草劑抗性標記基因，如果帶有該種抗性標記基因的轉(zhuǎn)基因作物同近緣野生 雜草雜交，該抗性標記基因平行轉(zhuǎn)移到雜草中，有可能會產(chǎn)生抗藥性超級雜草，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn) 帶來極大的危害。3，人們懷疑轉(zhuǎn)基因的標記基因及其產(chǎn)物可能會對人或動物產(chǎn)生一定的危 害。4，標記基因漂移到環(huán)境中會打破生態(tài)平衡，對環(huán)境造成一定的危害。因此，建立高效高 通量無選擇標記的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體系是現(xiàn)今植物轉(zhuǎn)基因工程的重要目標和迫切任務(wù)之一，也 是全球植物育種學(xué)家關(guān)心的熱點問題。目前，獲得無選擇標記轉(zhuǎn)基因植株的方法主要有位點特異性重組、轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)以 及共轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，其中共轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是研究比較多、應(yīng)用比較成熟的方法。位點特異性重組是 利用重組酶催化兩個短的、特定DNA序列間的重組，剔除選擇標記基因，從而獲得無標記 基因的轉(zhuǎn)基因作物。其原理是，把選擇標記基因插在兩個特異性重復(fù)序列之間，轉(zhuǎn)化植 物后，再特異性表達特意位點重組酶基因，通過位點特異性重組剔除選擇標記?，F(xiàn)今在植 物基因工程中常用的位點特異性重組系統(tǒng)主要有，酵母FLPPFRTs位點特異重組系統(tǒng)， Zygosaccharomyces rouxii的RPRS系統(tǒng)，噬菌體Pl的CreP Iox系統(tǒng)，以及噬菌體Mu的 Gin重組酶系統(tǒng)。但是，利用該方法獲得無選擇標記的轉(zhuǎn)基因植物，一般需要二次轉(zhuǎn)化或有 性雜交獲得重組酶，使無選擇標記轉(zhuǎn)基因作物的獲得過程過于復(fù)雜，不利于轉(zhuǎn)基因作物商 品化的發(fā)展。最近發(fā)展的可調(diào)控的位點特異性系統(tǒng)簡化了無選擇標記基因培育的過程，但 是其作用機理仍需要進一步研究，實際操作也有待提高。轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)能夠利用專座酶從植物染色體上的一個位置轉(zhuǎn)移到另一個位置，利用這種重組特性可以剔除轉(zhuǎn)基因作物的選擇 標記。AcPDs和SpmPdSpm是兩個研究得最深入的轉(zhuǎn)座子家族。但是，因為大多數(shù)被修飾過 的轉(zhuǎn)座因子(如插入了 ipt基因)被切除后又會重新插入基因組中的其它位置，只有轉(zhuǎn)座 失誤的細胞才能形成表型正常的轉(zhuǎn)基因作物。這種剔除選擇標記基因的方法效率比較低， 在轉(zhuǎn)基因作物的商品化過程中受到限制。最初共轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是指用兩個獨立的質(zhì)粒，其中一 個含有選擇標記基因，另一個含有目的基因，同時轉(zhuǎn)化目的細胞，兩個質(zhì)?？赏瑫r整合進植 物細胞，培育這種共同整合的轉(zhuǎn)化植株后代，經(jīng)過有性階段的遺傳重組，選擇標記基因與目 的基因分離，從而得只含有目的基因而不帶選擇標記基因的轉(zhuǎn)化植株。共轉(zhuǎn)化系統(tǒng)要求共 轉(zhuǎn)化頻率要高而且共轉(zhuǎn)化的DNA在受體細胞中處于不連鎖狀態(tài).。實際操作中，位于不同轉(zhuǎn) 化載體中的轉(zhuǎn)基因共整合頻率往往較低，并且常整合在受體基因組的同一位點。為了解決 以上問題，研究者又構(gòu)建了含有兩個T-DNA的超級雙元載體，即將選擇標記基因和目的基 因分別插入到同一質(zhì)粒中兩個相互獨立的T-DNA區(qū)內(nèi)。這種超級雙元載體使共整合效率低 的問題得到了緩解。但是，雙T-DNA轉(zhuǎn)化受體細胞，得到的共整合轉(zhuǎn)化細胞大部分為整合在 受體基因組的同一位點，這種情況的整合在后代遺傳分離中不能分離得到無選擇標記的目 的基因轉(zhuǎn)化植株，如何用最簡便的方法剔除這種整合是提高共轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵一步，也是 把無選擇標記的轉(zhuǎn)基因技術(shù)推向市場的必要途徑。本發(fā)明改進了傳統(tǒng)的雙T-DNA載體，在雙T-NDA區(qū)域之間加入一個啟動子和特定 基因，命名為雙T-DNA+1載體，這樣當雙T-DNA共同整合到染色體的同一位置時，該特定基 因就會在啟動子的啟動下表達，可以利用該特定基因的特性通過簡便的方法直接剔除這種 轉(zhuǎn)基因植株，選擇目的基因和選擇標記基因共整合到不同染色體或同一染色體不同位置的 植株進行培育，通過后代遺傳分離獲得無選擇標記的轉(zhuǎn)基因植株，這樣大大節(jié)省了人力物 力財力，為了無選擇標記轉(zhuǎn)基因的商品化推進了重要的一步。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是建立一種高效無選擇標記的轉(zhuǎn)基因載體，命名為雙T-DNA+1 載體，該載體包含兩個T-DNA功能結(jié)構(gòu)域，分別攜帶選擇標記基因和目的基因，在這兩個 T-DNA結(jié)構(gòu)域之間的區(qū)域，攜帶一個啟動子和特定基因。該載體的標記基因可以為任何可用 于植物轉(zhuǎn)化的標記基因，如潮霉素轉(zhuǎn)移酶基因、卡那霉素抗性基因、膦絲霉素轉(zhuǎn)移酶基因 等，目的基因包括任何有生產(chǎn)應(yīng)用價值的基因比如抗蟲基因、抗旱基、耐寒基因、抗除草劑 的基因等等。啟動子包括任何植物體內(nèi)源的啟動子、外源啟動子、組成型啟動子、誘導(dǎo)性型 啟動子、組織特異性啟動子、器官誘導(dǎo)型啟動子。特定基因包括任何致死基因和報告基因比 如紅色熒光蛋白基因、綠色熒光蛋白基因、藍色熒光蛋白基因以及GUS基因等等。本發(fā)明的另一個目的是提供一種利用該雙T-DNA+1載體獲得無選擇標記的轉(zhuǎn)基 因作物體系，具體實施過程包括1，構(gòu)建攜帶相應(yīng)目的基因的雙T-DNA載體并轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌。2，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化法，把構(gòu)建好的植物表達載體轉(zhuǎn)化目標植物3，對獲得TO代轉(zhuǎn)基因苗進行分子和表型分析，剔除含有選擇標記基因和特定基 因的共整合轉(zhuǎn)基因后代，選擇含有選擇標記基因和目的基因但不含特定基因的轉(zhuǎn)基因后代 進行培養(yǎng)。
4，種植篩選得到的Tl代轉(zhuǎn)基因株系，通過PCR選擇只含有目的基因的轉(zhuǎn)基因植 株。進一步通過遺傳分離比獲得只含目的基因的轉(zhuǎn)基因純合株系。下面結(jié)合實施實例進一步闡述本發(fā)明，而不構(gòu)成對本發(fā)明權(quán)利要求范圍的限制。


圖1植物表達雙T-DNA+1載體KT350圖2植物表達雙T-DNA載體KT!349圖IT350轉(zhuǎn)基因Tl代種子表型分析，其中A為目的基因和標記基因共整合到染 色體同一位置的Tl代種子；B為目的基因和標記基因共整合到染色體不同位置的Tl代種子。實施例1 雙T-DNA+1載體KT!350的構(gòu)建ΚΤ350結(jié)構(gòu)見附圖一，為雙T-DNA+AsRED基因，一個雙T-DNA為選擇標記基因 hptll潮霉素抗性基因，另一個雙T-DNA為抗鹽基因KY1，特異性基因為紅色熒光蛋白基因 AsRED0以本實驗室的pKAT-1為模板，擴出3k-AsRed_Tnos區(qū)域，并導(dǎo)入BamHI位點，通過 連接反應(yīng)構(gòu)建到T-easy載體上，進一步亞克隆構(gòu)建到已經(jīng)含有雙T-DNA的載體KT349(結(jié) 構(gòu)見附圖二)上。構(gòu)建過程中的酶切、連接、回收、純化等分子技術(shù)，均按分子克隆手冊中 的方法進行。(分子克隆實驗室手冊，Sambrook et al, New York Co Id Spring harbor laboratory 1989press)實施例二 KT350轉(zhuǎn)化水稻苗的獲得去殼的水稻成熟種子先用70%乙醇浸泡1-2分鐘，然后用0. 升汞浸泡30分 鐘，進行表面滅菌(最好在搖床上進行)，無菌水沖洗3-4次，再將種子放在無菌濾紙上吸干 水分后，放在成熟胚愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，26°C暗培養(yǎng)。挑選色澤淡黃的愈傷組織共培養(yǎng)。把含有KT350載體的農(nóng)桿菌AGLO在含有50mg/L Kanamycin的YM平板上劃線， 黑暗培養(yǎng)2-3天，用一金屬匙收集農(nóng)桿菌菌體，將其懸浮于共培養(yǎng)CM液體培養(yǎng)基中，調(diào)
整菌體濃度至0D600為0. 3-0. 5，加入乙酰丁香酮，使其終濃度為IOOmM,即為共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化水 稻用的農(nóng)桿菌懸浮液。挑選狀態(tài)較好(繼代培養(yǎng)5-7天、色澤淡黃)的愈傷組織放入100ml無菌三角瓶 中，加入適量農(nóng)桿菌懸浮液(保證有足夠的菌液與材料接觸即可)，進行轉(zhuǎn)化。將共培養(yǎng)后 的愈傷組織放在含有50mg/l潮霉素的篩選培養(yǎng)基上，26°C暗培養(yǎng)。經(jīng)兩輪篩選后長出的抗 性愈傷組織中，挑選乳黃色致密的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)至含有50mg/L潮霉素的分化培養(yǎng)基上 培養(yǎng)。當抗性愈傷組織分化的芽長至約2cm時，將小苗移到生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)兩周左右。 選擇高約10cm、根系發(fā)達的小苗，用溫水洗去培養(yǎng)基，在溫室內(nèi)移栽入土。實施例三KT350轉(zhuǎn)基因TO代苗的篩選以及獲得實施例二得到的具有潮霉素抗性的轉(zhuǎn)基因水稻苗，有三種情況，一種為選擇標記 基因單轉(zhuǎn)入水稻苗；第二種為選擇標記基因和KYl基因共整合到染色體同一位置的轉(zhuǎn)基因 水稻苗，這種情況下，AsRED也整合到染色體上，水稻的種子呈現(xiàn)紅色見附圖三，第三種為選 擇標記基因和KYl基因共整合到染色體上不同位置的轉(zhuǎn)基因水稻苗，這種株系是后代能夠 分離得到無選擇標記轉(zhuǎn)基因苗的株系。一般情況下，第二種的轉(zhuǎn)基因株系要占到轉(zhuǎn)基因苗 的70%左右，以前的轉(zhuǎn)化體系剔除這種轉(zhuǎn)基因體系要到Tl代的苗期，通過PCR技術(shù)，篩選只含目標基因KYl但不含選擇標記基因的株系，這樣的篩選不僅工作量大，而且周期長，不利 于轉(zhuǎn)基因技術(shù)的商業(yè)化。本發(fā)明中，可以利用AsRED的表達，直接剔除種子為紅色的Tl代 的種子，大大減少了工作量，使轉(zhuǎn)基因的高效商品化成為可能。
本發(fā)明在大豆、棉花、玉米、高粱方面的實施實例工作正在進行中。
權(quán)利要求
1.一種培育高效無選擇標記轉(zhuǎn)基因作物的方法，包括以下步驟a)構(gòu)建目的基因和選擇標記基因分別位于兩個獨立T-DNA結(jié)構(gòu)域，在兩個T-DNA結(jié)構(gòu) 域間攜一個啟動子和特定基因的雙T-DNA+1植物表達載體。b)把構(gòu)建好的雙T-DNA+1載體轉(zhuǎn)化目的農(nóng)作物，獲得轉(zhuǎn)化植株。c)通過特定基因的表達特性以及分子檢測，篩選目的基因和選擇標記基因整合在同一 植株不同染色體和同一染色體不同位置的轉(zhuǎn)基因株系。d)通過遺傳分離比獲得無選擇標記的轉(zhuǎn)基因作物。
2.按照權(quán)利1要求所述，目的基因是任何的抗蟲基因、抗逆基因、抗衰老基因、抗除草 劑基因、產(chǎn)量改良基因、品質(zhì)改良基因或由上述基因組合的融合基因或多價基因。
3.按照權(quán)利1要求所述，兩個T-DNA結(jié)構(gòu)域之間的啟動子是任何的植物內(nèi)源啟動子和 外源啟動子，包括組成型啟動子、誘導(dǎo)性型啟動子、組織特異性啟動子、器官誘導(dǎo)型啟動子、 調(diào)節(jié)型啟動子或者由調(diào)控結(jié)構(gòu)域和啟動子的融合片段。
4.按照權(quán)利1要求所述，兩個T-DNA結(jié)構(gòu)域之間的特定基因是所有的致死基因或報告 基因，這些報告基因包括紅色熒光蛋白基因、藍色熒光蛋白基因、綠色熒光蛋白基因、GUS基 因等。
5.按照權(quán)利1要求所述，其特征在于目的農(nóng)作物包括所有的單子葉植物和雙子葉植物。
6.根據(jù)權(quán)利5要求所述，單子葉植物為水稻、玉米、小麥、高粱、谷子、大麥、燕麥、黑麥， 雙子葉植物為棉花、大豆、煙草、油菜、番茄。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種高效獲得無選擇轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的方法，包括構(gòu)建目的基因和選擇標記基因分別位于兩個獨立T-DNA結(jié)構(gòu)域，在兩個T-DNA結(jié)構(gòu)域間攜一個啟動子和特定基因的雙T-DNA+1植物表達載體；把構(gòu)建好的雙T-DNA+1載體轉(zhuǎn)化目的農(nóng)作物，獲得轉(zhuǎn)化植株；通過特定基因的表達特性以及分子檢測，篩選目的基因和選擇標記基因整合在同一植株不同染色體或同一染色體不同位置的轉(zhuǎn)化株系；通過遺傳分離比獲得無選擇標記的轉(zhuǎn)基因作物。
文檔編號C12Q1/68GK102102108SQ20101056733
公開日2011年6月22日 申請日期2010年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月1日
發(fā)明者劉軍華, 夏勉, 孔祥鳳 申請人:北京未名凱拓作物設(shè)計中心有限公司