專利名稱：一種利用碎米生產赤蘚糖醇的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于酶工程和微生物發(fā)酵技術領域，具體涉及利用埃西托叢梗孢酵母 (Mmiliella acetoabutans ATCC 18455)作為出發(fā)菌株，以酶解后的碎米糖液作為發(fā)酵底 物，發(fā)酵生產赤蘚糖醇的方法。
背景技術：
赤蘚糖醇是一種甜度約為蔗糖70%的四碳糖醇，化學名為1，2，3，4- 丁四醇，分子 式為C4H1(iO4。赤蘚糖醇在自然界中分布廣泛，在蘑菇、酒類、醬油、奶酪、人和動物的組織液 和體液中等都有存在。由于赤蘚糖醇在人身體內具有獨特的代謝方式，使得赤蘚糖醇擁有 很多優(yōu)良的生理功能，如熱量值為零、耐受量高，副作用小、適宜糖尿病人食用、非致齲齒特 性、清除自由基功能等。因此其在功能性食品、化妝品、醫(yī)藥化工等領域的應用潛力巨大，目 前正越來越受到人們的關注。赤蘚糖醇的生產方法有兩種，化學合成法和微生物發(fā)酵法?；?學合成法是在葡萄糖酸鹽溶液中加入過氧化氫，在有鎳、鈷等金屬鹽存在的情況下進行反 應生成赤蘚糖；再通過加氫得到赤蘚糖醇。但是，從原理上來講都需要大量的過氧化氫，大 量的過氧化氫原料來源困難。另外，過氧化氫與葡萄糖或者葡萄糖酸的反應是強放熱反應， 但是，為了保持正常反應減少副反應，反應液溫度須保持在35°c以下，需要消耗大量能量， 且反應時間很長。再者，從葡萄糖酸到赤蘚糖是氧化過程，而加氫則是一個氫化還原過程， 前后形成氧化與氫化的重復，造成對能源的浪費。另外還存在環(huán)境污染和食品安全系數(shù)低 等一系列問題。因此造成了化學合成法成本高，轉化率低，產物分離純化困難而無法工業(yè)化 生產。發(fā)酵法產赤蘚糖醇，指利用微生物的生命活動，通過發(fā)酵產生赤蘚糖醇，再經過提純 精制、濃縮、結晶等步驟獲得赤蘚糖醇。其條件溫和易控制，成本較為低廉，食品安全系數(shù)較 高，因此發(fā)酵法是目前工業(yè)上生產赤蘚糖醇的主要方法。國外學者對赤蘚糖醇的研究利用較早。最早加拿大的Spencer等人在研究高滲酵 母產生甘油時，發(fā)現(xiàn)因菌種生長速度、培養(yǎng)條件不同，可產生赤蘚糖醇和阿拉伯糖醇等。其 后發(fā)現(xiàn)產赤蘚糖醇的菌株有絲孢酵母屬、假絲酵母屬、叢梗孢酵母屬、短梗霉屬等。我國對 赤蘚糖醇的研究較晚，目前使用的菌株有圓酵母屬、球擬酵母屬、假絲酵母屬等，但產量大 都較低，副產物較多，且生產技術相對比較落后，發(fā)酵液中赤蘚糖醇分離過程復雜，赤蘚糖 醇晶體純度低，造成赤蘚糖醇生產成本較高。在碳源的利用方面，工業(yè)生產中主要利用玉米 淀粉發(fā)酵產赤蘚糖醇，存在成本高，轉化率低，生產周期長，發(fā)酵液顏色較深，分離復雜等不 足。日本學者研究了利用甘油、烷烴作為發(fā)酵碳源來發(fā)酵生產赤蘚糖醇的生產方法，但是尚 未工業(yè)化生產。因此，篩選發(fā)酵效率高的生產菌株，尋找合適、低廉的發(fā)酵碳源，開發(fā)出高效 的生產和提取工藝，以降低赤蘚糖醇生產成本，增強我國甜味劑發(fā)酵產業(yè)的競爭力，是十分 有必要的。

發(fā)明內容
針對上述發(fā)酵法產赤蘚糖醇存在的不足，本發(fā)明提供一種新的利用碎米生產赤蘚糖醇的方法，該方法利用埃西托叢梗孢酵母acetoabutans ATCC 18455)作為 生產菌株，以碎米糖液作為發(fā)酵底物，發(fā)酵液分離純化精制后得到赤蘚糖醇產品。
實現(xiàn)上述目的的具體技術解決方案如下
一種利用碎米生產赤蘚糖醇的方法包括以下操作步驟
(1)碎米糖液的生產
①將碎米淘洗，挑除雜質，加溫度40°c的水浸泡2-6h，磨漿機磨漿，細度為30-60目，加 水將濃漿調至濃度為18-20° Β ，制得碎米米漿；
③在碎米米漿中加入液體的耐高溫α -淀粉酶，每噸碎米加耐高溫α -淀粉酶160mL ； 使用高溫噴射液化器液化，第一次噴射溫度105°C，帶壓維持時間15min ；第二次噴射溫度 130°C，帶壓維持時間2min ；降溫至100°C泵入層流罐，再次加入液體的耐高溫α -淀粉酶反 應，每噸碎米加耐高溫α -淀粉酶240mL，反應時間為90-100min，反應溫度為95_100°C，當 固形物含量為20%時到達反應終點，制得碎米液化液，冷卻；
③用稀鹽酸調節(jié)碎米液化液的PH值至pH4，加入糖化酶進行糖化，每噸碎米加糖化酶 lOOOg，糖化時間55-60h，糖化溫度60°C，制得碎米糖化液；
④用壓濾機壓濾碎米糖化液，壓濾溫度為55-60°C，壓力0.25MPa，制得碎米糖液；將碎 米糖液分別泵入兩個儲罐，一個儲罐作為二級種子培養(yǎng)基底物，另一個儲罐作為發(fā)酵培養(yǎng) 基底物待用；
(2)赤蘚糖醇發(fā)酵液的制取
①在搖瓶培養(yǎng)基上接入一環(huán)埃西托叢梗孢酵母(MwHieBaacetoabutans ATCC 18455)菌種，30°C搖床培養(yǎng)24h，獲得一級種子；
搖瓶培養(yǎng)基配方為葡萄糖200g/L，玉米漿干粉3g/L，尿素5g/L ；
②在一個儲罐的二級種子培養(yǎng)基底物中添加磷酸二氫鉀10g/L、硫酸鎂5g/L后，120°C 滅菌15min，泵入二級種子罐，降溫至30°C，接入一級種子，接種量5% ；無菌空氣經過濾除菌 后通入發(fā)酵罐，罐壓0. 5MPa,通氣量為0. 5vvm,培養(yǎng)條件為罐溫30°C，轉速200r/min，培養(yǎng) 時間24h，獲得二級種子液；
③在另一個儲罐的發(fā)酵培養(yǎng)基底物中添加磷酸二氫鉀10g/L、硫酸鎂5g/L、硫酸錳5g/ L、泡敵0. 05%, 1200C滅菌15min，泵入發(fā)酵罐，降溫至30°C，接入二級種子液，接種量10% ；發(fā) 酵條件為罐溫28°C ；無菌空氣經過濾滅菌后通入發(fā)酵罐，罐壓0. 05MPa，通氣量為lvvm，轉 速400r/min，發(fā)酵時間為95-100h ；葡萄糖濃度下降到0. 5%時達到發(fā)酵終點，得到含赤蘚糖 醇的發(fā)酵液，其中赤蘚糖醇含量為130-135g/L，赤蘚糖醇轉化率為42-45% ；
(3)赤蘚糖醇產品的精制
①將含赤蘚糖醇的發(fā)酵液用板框壓濾機進行粗濾以除去發(fā)酵液中菌體、蛋白質，以減 輕超濾壓力，壓濾溫度為55-60°C，壓力0. 25MPa，制得粗濾液；
②將粗濾液進行超濾操作，膜截留分子量為1000D，以除去發(fā)酵液中殘存的菌體、蛋白、 核酸、膠體顆粒的大分子物質，操作溫度常溫，超濾壓力0. 2MPa，制得超濾液；
③將超濾液進一步納濾，膜截留分子量200D，以脫除發(fā)酵液中的色素、核苷酸、氨基酸、 短肽、部分鹽離子，操作溫度40°C，納濾壓力2MPa，濃縮倍數(shù)為15倍，制得納濾液；④將納濾液通過多效降膜蒸發(fā)器濃縮至原體積液的20%后送入結晶罐，結晶罐留種 10% ；結晶總時間60h，其中養(yǎng)晶12h，冷卻結晶48h ；常規(guī)離心分離，干燥，制得赤蘚糖醇； 制得的赤蘚糖醇為白色結晶粉末，有蔗糖甜味，無異味，水分含量0. 05%，赤蘚糖醇純度為 98-99%ο所述碎米為秈米副產物，即秈米的碎米，或粳米副產物，即粳米的碎米。本發(fā)明的有益技術效果體現(xiàn)在以下方面
①利用埃西托叢梗孢酵母acetoabutans ATCC 18455)作為生產菌株，其 赤蘚糖醇轉化率高，發(fā)酵周期短，較其他菌株發(fā)酵生產周期節(jié)省時間約40h，且沒有如甘油 等副產物，發(fā)酵性能穩(wěn)定。②利用碎米糖液作為發(fā)酵底物，與其他碳源底物如烷烴、甘油、玉米淀粉等相比， 菌株利用率高，不需添加額外氮源且碎米本身較為廉價，因此有效的降低了生產成本。發(fā)酵 液顏色更淺，發(fā)酵液中的赤蘚糖醇更容易分離。過濾分離得到的碎米蛋白可以作其他用途， 達到了碎米的全利用，提高了碎米的利用深度。③發(fā)酵液通過板框過濾分離得到的酵母可以用作單細胞蛋白、飼料等用途。采用 超濾、納濾等新分離工藝，較傳統(tǒng)工藝中使用活性炭脫色效果更好以及色譜柱分離效率更 高，回收率達到90%以上，有效的降低了分離成本。且避免了色譜柱分離中大量洗脫溶劑的 使用，減少了環(huán)境污染。④利用多效降膜蒸發(fā)器進行濃縮，傳熱快，受熱時間短(2min)，較其他濃縮方式處 理量大，操作費用低且設備空間小。冷卻結晶法進行結晶操作，產品得率高，雜質少，工序簡 單，終產物純度達到98%以上。
具體實施例方式下面結合實施例，對本發(fā)明作進一步地描述。實施例1
(1)碎米糖液的生產
①將秈米副產物碎米淘洗，挑除碎米中的雜質后，加40°c水浸泡2h后用磨漿機磨漿， 細度為40目，加水將濃漿調至濃度20° Β ，制得碎米米漿；
在碎米米漿中加入液體的耐高溫α “淀粉酶，每噸碎米加耐高溫α -淀粉酶160mL。 使用|H」溫噴射液化器液化，第一次噴射溫度105°C，帶壓維持時間15min。第二次噴射溫度 130°C，帶壓維持時間2min。降溫至100°C后泵入層流罐，再次加入同樣的耐高溫α -淀粉 酶反應，每噸碎米加耐高溫α -淀粉酶240mL，反應時間90min，反應溫度100°C，當固形物含 量為20%時到達反應終點，制得碎米液化液；
③待碎米液化液冷卻后，用稀鹽酸將PH值調節(jié)至pH4，加入糖化酶，每噸碎米加糖化酶 lOOOg，糖化時間為60h，糖化溫度60°C，制得碎米糖化液；
斗用壓濾機壓濾碎米糖化液，壓濾溫度為60°C，壓力0. 25MPa。制得碎米糖液，將碎米 糖177別泵入兩個儲罐，一個儲罐作為二級種子培養(yǎng)基底物，另一個儲罐作為發(fā)酵培養(yǎng)基 底物待用。(2)赤蘚糖醇發(fā)酵液的制?、龠x擇埃西托叢梗孢酵母acetoabutansATCC 18455)作為出發(fā)菌株；
②搖瓶培養(yǎng)基滅菌后接入一環(huán)埃西托叢梗孢酵母acetoabutansATCC 18455)菌種，30°C搖床培養(yǎng)24h。搖瓶培養(yǎng)基配方為葡萄糖200g/L，玉米漿干粉3g/L，尿 素5g/L。經菌種鏡檢及OD值等各項指標達標后獲得一級種子；
^將其中一個儲罐中的碎米糖液添加磷酸二氫鉀10g/L、硫酸鎂5g/L后，120°C滅菌 15mm泵入二級種子罐，降溫至30°C后接入一級種子，接種量5%。無菌空氣經過濾除菌后通 入發(fā)酵罐，罐壓0. 5MPa，通氣量為0. 5vvm，培養(yǎng)條件為罐溫30°C，轉速200r/min，培養(yǎng)時間 24h。經菌種鏡檢及OD值等各項指標達標后獲得二級種子液；
④將另外一個儲罐中的碎米糖液添加磷酸二氫鉀10g/L、硫酸鎂5g/L、硫酸錳5g/L、泡 敵0. 05%后，120°C滅菌15min泵入發(fā)酵罐，降溫至30°C后接入二級種子液，接種量10%。發(fā) 酵條件為罐溫28°C。無菌空氣經過濾滅菌后通入發(fā)酵罐，罐壓0. 05MPa,通氣量為lvvm，轉 速400r/min，發(fā)酵時間100h。葡萄糖濃度下降到0. 5%時達到發(fā)酵終點，得到含赤蘚糖醇的 發(fā)酵液，其中赤蘚糖醇含量為135g/L，赤蘚糖醇轉化率為43. 3%。(3)赤蘚糖醇產品的精制
①將發(fā)酵液泵入至儲料罐后用板框壓濾機進行粗濾以除去發(fā)酵液中菌體、蛋白質等物 質，以減輕超濾壓力，壓濾溫度60°C，壓力0. 25MPa，制得粗濾液；
②將粗濾液進行超濾操作，膜截留分子量1000D，以除去發(fā)酵液中的殘存的菌體、蛋白、 核酸、膠體顆粒等大分子物質，操作溫度常溫，超濾壓力0. 2MPa，制得超濾液；
③將超濾液進一步納濾，膜截留分子量200D，以脫除發(fā)酵液中的色素、核苷酸、氨基酸、 短肽、部分鹽離子等，操作溫度40°C，納濾壓力2MPa，濃縮倍數(shù)為15倍，制得納濾液；
④將得到的納濾液通過多效降膜蒸發(fā)器濃縮至原體積液的20%后送入結晶罐，結晶罐 留種10%。結晶總時間60h，其中養(yǎng)晶12h，冷卻結晶48h。常規(guī)離心分離，干燥包裝后制得 產品，制得的赤蘚糖醇晶體為白色結晶粉末，有蔗糖甜味，無異味，水分含量0. 05%，赤蘚糖 醇純度為99%。實施例2
(1)碎米糖液的生產
①將粳米副產物碎米淘洗，挑除碎米中的雜質后，加40°C水浸泡6h后用磨漿機磨漿， 細度為40目，加水將濃漿調至濃度18° Β ，制得碎米米漿；
②在碎米米漿中加入液體的耐高溫α-淀粉酶，每噸碎米加耐高溫α -淀粉酶160mL。 使用高溫噴射液化器液化，第一次噴射溫度105°C，帶壓維持時間15min。第二次噴射溫度 130°C，帶壓維持時間2min。降溫至100°C后泵入層流罐，再次加入同樣的耐高溫α -淀粉 酶反應，每噸碎米加耐高溫α-淀粉酶240mL，反應時間lOOmin，反應溫度95°C，當固形物含 量為20%時到達反應終點，制得碎米液化液；
) 寺碎米液化液冷卻后，用稀鹽酸將PH調節(jié)至ρΗ4，加入糖化酶，每噸碎米加糖化酶
IOOO8塘化時間為55h，糖化溫度60°C，制得碎米糖化液；
+用壓濾機壓濾碎米糖化液，壓濾溫度為60°C，壓力0. 25 MPa0制得碎米糖液，將碎米
糖液分別泵入兩個儲罐，一個儲罐作為二級種子培養(yǎng)基底物，另一個儲罐作為發(fā)酵培養(yǎng)基底物待用。(2)赤蘚糖醇發(fā)酵液的制取
①選擇埃西托叢梗孢酵母acetoabutansATCC 18455)作為出發(fā)菌株；
②搖瓶培養(yǎng)基滅菌后接入一環(huán)埃西托叢梗孢酵母acetoabutansATCC 18455)菌種，30°C搖床培養(yǎng)24h。搖瓶培養(yǎng)基配方為葡萄糖200g/L，玉米漿干粉3g/L，尿 素5g/L。經菌種鏡檢及OD值等各項指標達標后獲得一級種子；
③將其中一個儲罐中的碎米糖液添加磷酸二氫鉀10g/L、硫酸鎂5g/L后，120°C滅菌 15min泵入二級種子罐，降溫至30°C后接入一級種子，接種量5%。無菌空氣經過濾除菌后通 入發(fā)酵罐，罐壓0. 5MPa，通氣量為0. 5vvm，培養(yǎng)條件為罐溫30°C，轉速200r/min，培養(yǎng)時間 24h。經菌種鏡檢及OD值等各項指標達標后獲得二級種子液。(|)將另外一個儲罐中的碎米糖液添加磷酸二氫鉀10g/L、硫酸鎂5g/L、硫酸錳5g/ L、泡敵0. 05%后，120°C滅菌15min泵入發(fā)酵罐，降溫至30°C后接入二級種子液，接種量 10%。發(fā)酵條件為罐溫28 V。無菌空氣經過濾滅菌后通入發(fā)酵罐，罐壓0. 05MPa,通氣量為 lvvm，轉速400r/min，發(fā)酵時間95h。葡萄糖濃度下降到0. 5%時達到發(fā)酵終點，得到含赤蘚 糖醇的發(fā)酵液，其中赤蘚糖醇含量為131g/L，赤蘚糖醇轉化率為42. 7%。(3)赤蘚糖醇產品的精制
精制步驟同實施例1，制得的赤蘚糖醇晶體水分含量為0. 05%，赤蘚糖醇純度為98%。
權利要求
一種利用碎米生產赤蘚糖醇的方法，其特征在于包括以下操作步驟(1)碎米糖液的生產將碎米淘洗，挑除雜質，加溫度40℃的水浸泡2 6h，磨漿機磨漿，細度為30 60目，加水將濃漿調至濃度為18 20°Bé，制得碎米米漿；在碎米米漿中加入液體的耐高溫α 淀粉酶，每噸碎米加耐高溫α 淀粉酶160mL；使用高溫噴射液化器液化，第一次噴射溫度105℃，帶壓維持時間15min；第二次噴射溫度130℃，帶壓維持時間2min；降溫至100℃泵入層流罐，再次加入液體的耐高溫α 淀粉酶反應，每噸碎米加耐高溫α 淀粉酶240mL，反應時間為90 100min，反應溫度為95 100℃，當固形物含量為20%時到達反應終點，制得碎米液化液，冷卻；用稀鹽酸調節(jié)碎米液化液的pH值至pH4，加入糖化酶進行糖化，每噸碎米加糖化酶1000g，糖化時間55 60h，糖化溫度60℃，制得碎米糖化液；用壓濾機壓濾碎米糖化液，壓濾溫度為55 60℃，壓力0.25MPa，制得碎米糖液；將碎米糖液分別泵入兩個儲罐，一個儲罐作為二級種子培養(yǎng)基底物，另一個儲罐作為發(fā)酵培養(yǎng)基底物待用；(2)赤蘚糖醇發(fā)酵液的制取在搖瓶培養(yǎng)基上接入一環(huán)埃西托叢梗孢酵母(Moniliella acetoabutans ATCC 18455)菌種，30℃搖床培養(yǎng)24h，獲得一級種子；搖瓶培養(yǎng)基配方為葡萄糖200g/L，玉米漿干粉3g/L，尿素5g/L；在一個儲罐的二級種子培養(yǎng)基底物中添加磷酸二氫鉀10g/L、硫酸鎂5g/L后，120℃滅菌15min，泵入二級種子罐，降溫至30℃，接入一級種子，接種量5%；無菌空氣經過濾除菌后通入發(fā)酵罐，罐壓0.5MPa，通氣量為0.5vvm，培養(yǎng)條件為罐溫30℃，轉速200r/min，培養(yǎng)時間24h，獲得二級種子液；在另一個儲罐的發(fā)酵培養(yǎng)基底物中添加磷酸二氫鉀10g/L、硫酸鎂5g/L、硫酸錳5g/L、泡敵0.05%，120℃滅菌15min，泵入發(fā)酵罐，降溫至30℃，接入二級種子液，接種量10%；發(fā)酵條件為罐溫28℃；無菌空氣經過濾滅菌后通入發(fā)酵罐，罐壓0.05MPa，通氣量為1vvm，轉速400r/min，發(fā)酵時間為95 100h；葡萄糖濃度下降到0.5%時達到發(fā)酵終點，得到含赤蘚糖醇的發(fā)酵液，其中赤蘚糖醇含量為130 135g/L，赤蘚糖醇轉化率為42 45%；(3)赤蘚糖醇產品的精制將含赤蘚糖醇的發(fā)酵液用板框壓濾機進行粗濾以除去發(fā)酵液中菌體、蛋白質，以減輕超濾壓力，壓濾溫度為55 60℃，壓力0.25MPa，制得粗濾液；將粗濾液進行超濾操作，膜截留分子量為1000D，以除去發(fā)酵液中殘存的菌體、蛋白、核酸、膠體顆粒的大分子物質，操作溫度常溫，超濾壓力0.2MPa，制得超濾液；將超濾液進一步納濾，膜截留分子量200D，以脫除發(fā)酵液中的色素、核苷酸、氨基酸、短肽、部分鹽離子，操作溫度40℃，納濾壓力2MPa，濃縮倍數(shù)為15倍，制得納濾液；將納濾液通過多效降膜蒸發(fā)器濃縮至原體積液的20%后送入結晶罐，結晶罐留種10%；結晶總時間60h，其中養(yǎng)晶12h，冷卻結晶48h；常規(guī)離心分離，干燥，制得赤蘚糖醇；制得的赤蘚糖醇為白色結晶粉末，有蔗糖甜味，無異味，水分含量0.05%，赤蘚糖醇純度為98 99%。176775dest_path_image001.jpg,300589dest_path_image002.jpg,647256dest_path_image003.jpg,623565dest_path_image004.jpg,713881dest_path_image001.jpg,957780dest_path_image002.jpg,209770dest_path_image003.jpg,688023dest_path_image001.jpg,316451dest_path_image002.jpg,680436dest_path_image003.jpg,103327dest_path_image005.jpg
2.根據(jù)權利要求1所述的一種利用碎米生產赤蘚糖醇的方法，其特征在于所述碎米 為秈米副產物，即秈米的碎米，或粳米副產物，即粳米的碎米。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用碎米生產赤蘚糖醇的方法。該方法以埃西托叢梗孢酵母(MoniliellaacetoabutansATCC18455)作為生產菌株，以碎米糖液作為發(fā)酵底物制備高純度的赤蘚糖醇，具體操作包括碎米糖液的制備、赤蘚糖醇發(fā)酵液的制取和赤蘚糖醇產品的精制三個步驟。本發(fā)明赤蘚糖醇轉化率高，發(fā)酵周期短，且沒有如甘油等副產物，發(fā)酵性能穩(wěn)定；降低了生產成本；操作費用低且設備空間?。划a品得率高，雜質少，工序簡單，終產物純度達到98%以上。
文檔編號C12P7/18GK101979616SQ201010541268
公開日2011年2月23日 申請日期2010年11月12日 優(yōu)先權日2010年11月12日
發(fā)明者劉鵬, 吳紅引, 張秋子, 李瑩, 王澤南, 蘇婭 申請人:合肥工業(yè)大學