專利名稱：一種減少l-色氨酸發(fā)酵過程中代謝副產(chǎn)物乙酸的方法
一種減少L-色氨酸發(fā)酵過程中代謝副產(chǎn)物乙酸的方法技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種減少L-色氨酸發(fā)酵過程中代謝副產(chǎn)物乙酸的方法， 屬于發(fā)酵法生產(chǎn)氨基酸的技術(shù)領(lǐng)域。背景技術(shù)：
:L_色氨酸又名β-吲哚基丙氨酸，化學名L-2-氨基-3-吲哚基丙酸， 別名L-胰化蛋白氨基酸、L-氨基吲哚丙酸，分子式C11H12O2N2，相對分子質(zhì)量204. 21。L-色 氨酸是人體和動物生命活動中八種必需的氨基酸之一，它以游離態(tài)或結(jié)合態(tài)存在于生物體 之中。對人和動物的生長發(fā)育、新陳代謝起著重要的作用，被稱為第二必需氨基酸，廣泛應(yīng) 用于醫(yī)藥、食品和飼料等方面。世界市場L-色氨酸年需求量約為120萬噸以上，而目前全 世界只有一萬多噸的生產(chǎn)能力，且主要集中在日本、美國、中國、韓國等國家，因而L-色氨 酸的市場前景巨大。國內(nèi)主要有上海、武漢、北京等地小規(guī)模少量生產(chǎn)用于藥品的L-色氨 酸，但尚無廠家生產(chǎn)飼料添加劑用的L-色氨酸。因此，研究提高L-色氨酸產(chǎn)量方法具有重 要的理論意義和實用價值。目前利用微生物生產(chǎn)L-色氨酸的方法主要有酶法、微生物轉(zhuǎn)化法和微生物發(fā)酵 法，其中微生物發(fā)酵法將是大規(guī)模生產(chǎn)L-色氨酸的首選技術(shù)，現(xiàn)常用菌株有大腸桿菌、谷 氨酸棒桿菌。由于大腸桿菌具有遺傳特性較清楚、易培養(yǎng)、發(fā)酵周期短并能實現(xiàn)目的基因的 高效表達等特性，因而得到廣泛地應(yīng)用。但是，大腸桿菌生長時會產(chǎn)生乙酸，尤其是在重組 菌的高密度培養(yǎng)中，乙酸的產(chǎn)生和積累不僅會影響菌體生長，還會抑制產(chǎn)物的合成。因此， 減少發(fā)酵過程中乙酸的產(chǎn)生不但有利于實現(xiàn)大腸桿菌的高密度培養(yǎng)，而且對于提高L-色 氨酸產(chǎn)量和實現(xiàn)L-色氨酸生產(chǎn)的工業(yè)化極為重要。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明根據(jù)大腸桿菌在L-色氨酸發(fā)酵過程中會產(chǎn)生乙酸，抑制菌體 生長，導致L-色氨酸產(chǎn)量降低。采用控制溶氧水平、初糖濃度、葡萄糖限制流加等措施能顯 著降低發(fā)酵過程中的乙酸含量，使得L-色氨酸產(chǎn)量得到顯著提高。在發(fā)酵過程中，乙酸產(chǎn)生主要有兩個原因，即設(shè)備的供氧能力不足使得重組菌的 呼吸受到限制和葡萄糖的攝入速率大于重組菌TCA循環(huán)的周轉(zhuǎn)能力。這兩種情況均會導致 底物通過乙酰磷酸途徑轉(zhuǎn)化為乙酸，且外源基因表達產(chǎn)生的代謝負荷會降低大腸桿菌的有 氧呼吸能力，導致重組菌生長過程中更易積累乙酸。L-色氨酸生產(chǎn)菌在生長過程中，需大量氧氣參與代謝，溶氧濃度過高或過低，都 會影響菌體生長和產(chǎn)物生成。氧氣對好氧微生物有潛在的毒副作用，氧濃度過高也會產(chǎn)生 Crabtree效應(yīng)；過低的溶氧濃度則導致乙酸的大量生成，菌體生長受到抑制，比生長速率 下降，甚至菌體發(fā)生自溶，嚴重影響產(chǎn)物合成。維持一定水平的溶氧濃度，不僅有利于菌體 生長，還有利于提高產(chǎn)酸水平。優(yōu)化碳源是實現(xiàn)L-色氨酸生產(chǎn)菌高密度發(fā)酵的關(guān)鍵因素，葡萄糖是目前最常用 的碳源物質(zhì)。培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度嚴重影響細胞的代謝方式，糖濃度超過50g/L時，大腸 桿菌的生長將會受到抑制。當L-色氨酸生產(chǎn)菌的比攝糖速率超過一定的臨界值時，即使在 氧充足條件下E. coli也會發(fā)生Crabtree效應(yīng)而產(chǎn)生乙酸。控制葡萄糖的攝入速率略低于 或等于TCA循環(huán)的周轉(zhuǎn)能力，可有效避免中間產(chǎn)物乙酰輔酶A通過乙酰磷酸途徑產(chǎn)生乙酸， 因此維持發(fā)酵過程中合適的葡萄糖濃度可有效減少乙酸產(chǎn)生。
此方法在不增加額外設(shè)備和人力投入的情況下，有效減少L-色氨酸發(fā)酵過程中 乙酸的產(chǎn)生并顯著提高了 L-色氨酸的產(chǎn)量，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的本發(fā)明提供了減少L-色氨酸發(fā)酵過程中代謝副產(chǎn)物乙酸的方法，其特征是在 L-色氨酸發(fā)酵過程中，采用10 20g/L初糖濃度，更優(yōu)選20g/L，控制溶氧水平在20 30%，更優(yōu)選20%，維持發(fā)酵液中葡萄糖濃度為2 5g/L，更優(yōu)選2g/L。本發(fā)明提出了適用于減少L-色氨酸發(fā)酵過程中副產(chǎn)物乙酸的方法，它通過采用 控制溶氧水平、初糖濃度、葡萄糖限制流加及控制菌體比生長速率等措施能顯著降低發(fā)酵 過程中的乙酸含量，使菌體生物量及L-色氨酸產(chǎn)量得到顯著提高。
具體實施方式下面通過實施例對本發(fā)明作進一步的說明，所舉之例并不限制本發(fā)明的保護范 圍實施例1 采用的菌株為大腸桿菌；培養(yǎng)基為在現(xiàn)有普遍采用的發(fā)酵培養(yǎng)基[葡萄糖20g/L、 酵母膏 lg/L，(NH4)2SO4 4g/L，檸檬酸鈉 2g/L，MgSO4 · 7H20 5g/L，KH2PO4 2g/L，F(xiàn)eSO4 · 7H20 lOOmg/L]；培養(yǎng)方法將菌種接入種子培養(yǎng)基[葡萄糖20g/L，酵母膏15g/L，(NH4)2SO4 IOg/ L，檸檬酸鈉 0. 5g/L，MgSO4 · 7H205g/L，KH2PO4 1. 5g/L，F(xiàn)eSO4 · 7H20 15mg/L，Vbi lOOmg/L] 中，接種量為10% ；在32°C、pH為7. 0和溶氧為20%條件下于5L自動控制發(fā)酵罐中培養(yǎng) 12h至對數(shù)期，按10%的接種量接入含有發(fā)酵培養(yǎng)基的30L自動控制發(fā)酵罐中，初始通氣 量2L/min，攪拌轉(zhuǎn)速500r/min 800r/min，溶氧水平為10 %，通過自動流加氨水控制pH 在7. 0，培養(yǎng)溫度32°C，以泡敵消泡，并通過流加濃度為800g/L的葡萄糖溶液將殘?zhí)强刂圃?2g/L，發(fā)酵至40h停止。放罐時，代謝副產(chǎn)物乙酸含量為0.9g/L，L-色氨酸產(chǎn)量為32. Sg/ L，比對照實驗(代謝副產(chǎn)物乙酸含量為2. 9g/L，L-色氨酸產(chǎn)量為23. 4g/L)乙酸含量減少 T 68. 96%, L-色氨酸產(chǎn)量提高了 40. 17%。實施例2:采用的菌株為大腸桿菌；培養(yǎng)基為在現(xiàn)有普遍采用的發(fā)酵培養(yǎng)基(同實施例1)葡 萄糖濃度為10g/L ；培養(yǎng)方法同實施例1。放罐時，代謝副產(chǎn)物乙酸含量為1. 3g/L，L-色氨 酸產(chǎn)量為30. 2g/L，比對照實驗(代謝副產(chǎn)物乙酸含量為2. 9g/L，L-色氨酸產(chǎn)量為23. 4g/ L)乙酸含量減少了 55. 17，L-色氨酸產(chǎn)量提高了 29.06%。實施例3:采用的菌株為大腸桿菌；培養(yǎng)基為在現(xiàn)有普遍采用的發(fā)酵培養(yǎng)基(同實施例1)； 培養(yǎng)方法同實施例1，控制溶氧水平為30%。放罐時，代謝副產(chǎn)物乙酸含量為1. 5，L-色氨 酸產(chǎn)量為28. 7g/L，比對照實驗(代謝副產(chǎn)物乙酸含量為2. 9g/L，L-色氨酸產(chǎn)量為23. 4g/ L)乙酸含量減少了 48. 27%，L-色氨酸產(chǎn)量提高了 22.65%。實施例4:采用的菌株為大腸桿菌；培養(yǎng)基為在現(xiàn)有普遍采用的發(fā)酵培養(yǎng)基(同實施例1)； 培養(yǎng)方法同實施例1，通過流加濃度為800g/L的葡萄糖溶液將殘?zhí)强刂圃?g/L。放罐時， 代謝副產(chǎn)物乙酸含量為1. 6，L-色氨酸產(chǎn)量為26. 71g/L，比對照實驗(代謝副產(chǎn)物乙酸含量為2.9g/L，L-色氨酸產(chǎn)量為23.4g/L)乙酸含量減少了 44.83%，L-色氨酸產(chǎn)量提高了 14. 14%。
權(quán)利要求
本發(fā)明提供了減少L 色氨酸發(fā)酵過程中代謝副產(chǎn)物乙酸的方法，其特征是在L 色氨酸發(fā)酵過程中，采用10～20g/L初糖濃度，控制溶氧水平在20～30％，維持發(fā)酵液中葡萄糖濃度為2～5g/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是在L-色氨酸發(fā)酵過程中，初糖濃度為10 20g/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是在L-色氨酸發(fā)酵過程中，控制溶氧水平在 20 30%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是在L-色氨酸發(fā)酵過程中，維持發(fā)酵液中葡 萄糖濃度為2 5g/L。
全文摘要
一種減少L-色氨酸發(fā)酵過程中代謝副產(chǎn)物乙酸的方法。本發(fā)明涉及一種發(fā)酵法制備L-色氨酸的改進方法。本發(fā)明根據(jù)調(diào)整細胞代謝流分配的原理，采用控制溶氧水平、初糖濃度、葡萄糖限制流加及控制菌體比生長速率等措施顯著降低發(fā)酵過程中的乙酸含量，使菌體生物量及L-色氨酸產(chǎn)量得到顯著提高。
文檔編號C12R1/19GK101967502SQ20101052746
公開日2011年2月9日 申請日期2010年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月2日 公開號201010527463.發(fā)明者劉淑云, 徐慶陽, 謝希賢, 陳寧, 黃靜 申請人:天津科技大學