專利名稱：一種高效生產(chǎn)l-纈氨酸的發(fā)酵工藝的制作方法
一種高效生產(chǎn)L-纈氨酸的發(fā)酵工藝技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高效生產(chǎn)L-纈氨酸的發(fā)酵工藝，屬于發(fā)酵法生產(chǎn)氨 基酸的技術(shù)領(lǐng)域。背景技術(shù)：
L_纈氨酸(L-valine)屬于分支鏈氨基酸，是人體必需氨基酸之一。 近年來，由于氨基酸在食品、醫(yī)藥、飼料、農(nóng)業(yè)和日用化工等方面有極其廣泛的用途，尤其隨 著抗癌藥物制劑、氨基酸輸液制劑及甜味二肽生產(chǎn)的飛速發(fā)展，對原料氨基酸的需求量日 益增長，市場需求量不斷增加。最近，人們發(fā)現(xiàn)L-纈氨酸是合成一種免疫抗生素的重要中 間體，其年消耗量猛增到數(shù)千噸，現(xiàn)在世界L-纈氨酸年產(chǎn)量已達(dá)到10000噸以上。在整個(gè) 氨基酸生產(chǎn)工業(yè)中，隨著氨基酸輸液需求的不斷增長，L-纈氨酸的需求也將增長，其生產(chǎn)已 占有重要的地位。另外，纈氨酸在食品、化妝品和飼料工業(yè)上也有著廣泛的應(yīng)用。纈氨酸發(fā) 酵是典型的代謝控制發(fā)酵。國內(nèi)雖有天然蛋白質(zhì)水解液分離提取L-纈氨酸的產(chǎn)品，但產(chǎn)量 很低，質(zhì)量不佳，純度不高，無法實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-纈氨酸 具有原料成本低，反應(yīng)條件溫和及易實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，是一種非常經(jīng)濟(jì)的生產(chǎn)方法。 但是，以微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-纈氨酸，國內(nèi)大多數(shù)菌株的產(chǎn)酸水平不高，特別是L-纈氨酸 的生產(chǎn)水平和產(chǎn)量遠(yuǎn)不能滿足國內(nèi)市場的需求。因此，開展發(fā)酵法生產(chǎn)L-纈氨酸的研究具 有極其重要的意義。而且，隨著近年來原材料價(jià)格的不斷上漲和市場競爭的愈加激烈，為了在提高纈 氨酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率的同時(shí)能夠降低生產(chǎn)成本，仍有大量關(guān)于纈氨酸發(fā)酵方面的研究報(bào)道， 主要集中在誘變選育纈氨酸高產(chǎn)菌株、發(fā)酵過程控制與優(yōu)化和新原料的開發(fā)等方面。纈氨酸生產(chǎn)菌屬于營養(yǎng)缺陷型突變株，能在胞外大量積累纈氨酸是由于菌體的代 謝處于異常狀態(tài)，對環(huán)境條件非常敏感。發(fā)酵條件如碳源、氮源、無機(jī)鹽、生物素、PH、溫度及 溶氧等對纈氨酸的合成都具有重要影響。其中，底物(如葡萄糖)濃度是控制菌體代謝過 程的一個(gè)重要參數(shù)，主要通過控制相關(guān)酶的合成或活性影響菌體的代謝途徑。葡萄糖可通 過“葡萄糖效應(yīng)”阻遏、抑制多種酶的合成，如氨基酸合成酶等，這種阻遏作用主要是其分解 代謝物引起的。在以葡萄糖為碳源的纈氨酸發(fā)酵中，葡萄糖的分解代謝物阻遏會(huì)引起多種 副產(chǎn)物如乳酸的積累，從而影響糖酸轉(zhuǎn)化率。此外，溶氧也是一個(gè)至關(guān)重要的因素，雜酸的 產(chǎn)生和碳架的浪費(fèi)與溶解氧濃度密切相關(guān)。因此在發(fā)酵過程中必須控制恰當(dāng)?shù)娜苎踔?，?優(yōu)化代謝流分布，增大L-纈氨酸產(chǎn)率，減少雜酸的生成。目前，我國L-纈氨酸在生產(chǎn)工業(yè)上主要采用分批發(fā)酵模式。在這種生產(chǎn)模式中， 維持一定的底物(如葡萄糖)濃度對于纈氨酸的發(fā)酵非常重要。為達(dá)到經(jīng)濟(jì)技術(shù)的要求， 要提高單批次發(fā)酵過程中的纈氨酸產(chǎn)量就要提高初始培養(yǎng)基中的底物(如葡萄糖)濃度， 但底物濃度過高會(huì)引起滲透壓過大，影響菌體的正常代謝及纈氨酸的產(chǎn)量。反之，初始葡萄 糖濃度較低有利于菌體的生長，但后期發(fā)酵液中的殘?zhí)茄杆俸谋M，其生產(chǎn)能力不能得到最 大限度的發(fā)揮。與此同時(shí)，在目前的生產(chǎn)模式中，溶氧濃度往往不能得到很好的控制，溶氧 水平浮動(dòng)很大，不能長時(shí)間穩(wěn)定的維持在一個(gè)恰當(dāng)?shù)乃缴?。在纈氨酸發(fā)酵過程中，由于 L-纈氨酸合成不是經(jīng)由三羧酸循環(huán)，而是由丙酮酸為前提物合成，當(dāng)供氧不足時(shí)，葡萄糖降 解通過TCA循環(huán)的氧化受到抑制，細(xì)胞內(nèi)丙酮酸庫水平提高，有利于前體物增加，從而導(dǎo)致L-纈氨酸產(chǎn)量增加。而溶氧過高時(shí)，乙酰乳酸合成酶酶活明顯降低，且TCA循環(huán)流量加大， 造成碳流損失；但溶氧過低時(shí)，TCA循環(huán)代謝流量減小，不足以平衡葡萄糖酵解速率，從而 刺激了乳酸脫氫酶的酶活，使代謝流轉(zhuǎn)向乳酸生成，造成乳酸積累。這兩種情況均不利于纈 氨酸生成。此外，現(xiàn)有的很多L-纈氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基配方都不能很好的最大限度去滿足其相 應(yīng)生產(chǎn)菌株的生長代謝和產(chǎn)酸要求。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有的纈氨酸生產(chǎn)方法發(fā)酵產(chǎn)酸量較低、糖 酸轉(zhuǎn)化率低等缺陷，提供一種高效發(fā)酵生產(chǎn)L-纈氨酸的方法。在不增加額外設(shè)備和人力投 入的情況下，實(shí)現(xiàn)了整個(gè)發(fā)酵周期的縮短和L-纈氨酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率的大幅提高，適合于工 業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明提供的一種高效發(fā)酵生產(chǎn) L-纈氨酸的方法，包括種子培養(yǎng)和進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酸，其特征是發(fā)酵過程中，通過調(diào)節(jié)發(fā)酵罐 攪拌轉(zhuǎn)速和風(fēng)量將溶氧控制在適當(dāng)?shù)乃缴?，整個(gè)發(fā)酵過程既不產(chǎn)生較多乳酸等雜酸副 酸，也不導(dǎo)致由于TCA循環(huán)流量加大而造成碳源大量流失，通過流加液氨控制pH，通過流加 適量泡敵消泡，并通過流加一定較高濃度的葡萄糖溶液將殘?zhí)强刂圃谝欢ㄋ剑拐麄€(gè)發(fā) 酵過程中既不產(chǎn)生葡萄糖抑制，也不構(gòu)成底物限制，發(fā)酵至60h停止。該方法的具體步驟如下(1)培養(yǎng)種子配制種子培養(yǎng)基[葡萄糖2.5%、酵母粉0.4%、玉米漿1.5%、豆餅 水解液 1%、ΚΗ2Ρ04 ·3Η20 0. 1 MgSO4 ·7Η20 0· 04%、MnSO4 ·H2O 0. 001%,VB1 0. 00003%, VH 0.00002%、尿素0.05% ]，121°C滅菌15min ；將菌種接入種子培養(yǎng)基中，接種量一般為 10% ；在適宜的溫度、pH和溶氧條件下于5L自動(dòng)控制發(fā)酵罐中培養(yǎng)至對數(shù)期。(2)低氧發(fā)酵將步驟(1)制得的種液以10% 20%接種量接種發(fā)酵，控制發(fā)酵 液溫度為32°C;通入適當(dāng)空氣，調(diào)節(jié)適當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速，采用分階段供氧模式控制溶氧0 18h 為20%左右，18h以后為5% 10% ；通過自動(dòng)流加25%的液氨控制pH在6. 7 7. 0 ；通 過流加適量泡敵消泡；并通過流加濃度為600 900g/L的葡萄糖溶液將殘?zhí)强刂圃?. 5 2.0%，發(fā)酵至60h停止。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果與現(xiàn)有工藝相比，本發(fā)明的方法具有以下特點(diǎn)1、本發(fā)明通過適當(dāng)流加較高濃度的葡萄糖溶液將殘?zhí)菨舛瓤刂圃谇‘?dāng)水平，使整 個(gè)發(fā)酵過程中既不因葡萄糖濃度過高而引起滲透壓過大且產(chǎn)生“葡萄糖效應(yīng)”阻遏分解代 謝物，也不因葡萄糖濃度過低而構(gòu)成底物限制，使發(fā)酵液中的殘?zhí)茄杆俸谋M，導(dǎo)致菌種生產(chǎn) 能力不能得到最大限度的發(fā)揮；2、本發(fā)明通過適當(dāng)調(diào)節(jié)發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速和風(fēng)量將溶氧濃度控制在恰當(dāng)?shù)乃缴希?使整個(gè)發(fā)酵過程中既不因溶氧濃度過低導(dǎo)致TCA循環(huán)代謝流量減小，不足以平衡葡萄糖酵 解速率，從而刺激了乳酸脫氫酶的酶活，使代謝流轉(zhuǎn)向乳酸生成，造成乳酸積累，也不因溶 氧濃度過高導(dǎo)致TCA循環(huán)流量加大生成大量C02而造成碳源的大量流失，而且引起乙酰乳 酸合成酶酶活明顯降低，致使L-纈氨酸產(chǎn)量下降；3、本發(fā)明在與現(xiàn)有生產(chǎn)工藝相比不增加任何額外設(shè)備和人力投入的情況下，縮短 了整個(gè)發(fā)酵周期，種子培養(yǎng)縮短至7 9h，并大幅提高了 L-纈氨酸的產(chǎn)量(55g/L以上)和 轉(zhuǎn)化率(25%以上)，整個(gè)工藝過程操作簡便，生產(chǎn)成本較低，經(jīng)濟(jì)效益顯著，十分適合于工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實(shí)施方式實(shí)施例1 使用的微生物菌種為現(xiàn)有纈氨酸生產(chǎn)菌。用上述菌株進(jìn)行高效發(fā)酵，所用培養(yǎng)基 有兩種(1)種子培養(yǎng)基葡萄糖2.5%、酵母粉0.4%、玉米漿1.5%、豆餅水解液1%、 KH2PO4 0.1%, MgSO4 ‘ 7Η20 0. 04%、MnSO4 · H2O 0. 001 %、VBJOOug/L、VH 200ug/L、尿素 0. 05%。用 NaOH 和鹽酸調(diào) pH 至 6. 7 7. 0，121°C滅菌 15min。(2)發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖6%、玉米漿2.5%、豆餅水解液2.5%、KH2PO4O. 05%、 MgSO4 · 7H20 0. 02 %, MnSO4 · H2O 0. 001 Met 0. 05 lie 0. 006 Leu 0. 02 VB10. 00001%, VH 0. 000008% ο 用 NaOH 和鹽酸調(diào) pH 至 6. 7 7. 0，115°C滅菌 20min。將菌種接入種子培養(yǎng)基中，接種量為10% ；在32°C、pH為7.0和溶氧為20%條 件下于5L自動(dòng)控制發(fā)酵罐中培養(yǎng)8h至對數(shù)期，按10%的接種量接入含有發(fā)酵培養(yǎng)基的 5L自動(dòng)控制發(fā)酵罐中，控制發(fā)酵液溫度為32°C，通入適當(dāng)空氣，調(diào)節(jié)適當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速，采用分 階段供氧模式控制溶氧0 18h為20%，18 60h為5%，通過自動(dòng)流加液氨控制pH在
6.7 7. 0，通過流加適量泡敵消泡，并通過流加濃度為600g/L的葡萄糖溶液將殘?zhí)强刂圃?0. 5%，發(fā)酵至60h停止。L-纈氨酸的產(chǎn)量為56g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為25. 5%。實(shí)施例2:使用的微生物菌種為現(xiàn)有纈氨酸生產(chǎn)菌。用上述菌株進(jìn)行高效發(fā)酵，所用培養(yǎng)基 有兩種(1)種子培養(yǎng)基同實(shí)施例1。(2)發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖10%、玉米漿1.5%、豆餅水解液3.5%、KH2PO4O. 1%、 MgSO4 ·7Η20 0. 03%,MnSO4 0. 001%,Met 0. 05%,Ile 0· 006%、LeuO. 02%、VB1 0. 00002%, VH 0. 000015% ο 用 NaOH 和鹽酸調(diào) pH 至 6. 7 7. 0，115°C滅菌 20min。將菌種接入種子培養(yǎng)基中，接種量為10% ；在32°C、pH為7. 0和溶氧為20%條件 下于5L自動(dòng)控制發(fā)酵罐中培養(yǎng)8h至對數(shù)期，按10%的接種量接入含有發(fā)酵培養(yǎng)基的5L自 動(dòng)控制發(fā)酵罐中，控制發(fā)酵液溫度為32°C，通入適當(dāng)空氣，調(diào)節(jié)適當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速，采用分階段 供氧模式控制溶氧0 18h為20 %，18 60h為5 %，通過自動(dòng)流加液氨控制pH在6. 7
7.0，通過流加適量泡敵消泡，并通過流加濃度為800g/L的葡萄糖溶液將殘?zhí)强刂圃?%左 右，發(fā)酵至60h停止。L-纈氨酸的產(chǎn)量為57g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為26%。實(shí)施例3 使用的微生物菌種為現(xiàn)有纈氨酸生產(chǎn)菌。用上述菌株進(jìn)行高效發(fā)酵，所用培養(yǎng)基 有兩種(1)種子培養(yǎng)基同實(shí)施例1。(2)發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖8%、玉米漿0. 5%、豆餅水解液4. 5%、KH2PO4O. 1%, MgSO4 ·7Η20 0. 04%,MnSO4 0. 001%,Met 0. 05%,Ile 0· 006%、LeuO. 02%、VB1 0. 00002%, VH 0. 000015% ο 用 NaOH 和鹽酸調(diào) pH 至 6. 7 7. 0，115°C滅菌 20min。將菌種接入種子培養(yǎng)基中，接種量為10% ；在32°C、pH為7. 0和溶氧為20%條件下于5L自動(dòng)控制發(fā)酵罐中培養(yǎng)8h至對數(shù)期，按10%的接種量接入含有發(fā)酵培養(yǎng)基的5L自 動(dòng)控制發(fā)酵罐中，控制發(fā)酵液溫度為32°C，通入適當(dāng)空氣，調(diào)節(jié)適當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速，采用分階段 供氧模式控制溶氧0 18h為20 %，18 60h為5 %，通過自動(dòng)流加液氨控制pH在6. 7 7. 0，通過流加適量泡敵消泡，并通過流加濃度為900g/L的葡萄糖溶液將殘?zhí)强刂圃? 1. 5%，發(fā)酵至60h停止。L-纈氨酸的產(chǎn)量為59g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為27%。
權(quán)利要求
一種高效生產(chǎn)L 纈氨酸的發(fā)酵工藝，包括種子培養(yǎng)和進(jìn)行低氧控制發(fā)酵，其特征是發(fā)酵過程中，通過調(diào)節(jié)發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速和風(fēng)量將溶氧控制在適當(dāng)?shù)乃缴?，使整個(gè)發(fā)酵過程既不產(chǎn)生較多乳酸，也不導(dǎo)致由于TCA循環(huán)流量加大生成大量CO2而造成碳源大量流失，通過流加液氨控制pH，通過流加適量泡敵消泡，并通過流加一定濃度的葡萄糖溶液將殘?zhí)强刂圃谳^低水平，使整個(gè)發(fā)酵過程中既不產(chǎn)生葡萄糖抑制，也不構(gòu)成底物限制，發(fā)酵至60h停止。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是發(fā)酵過程中流加糖濃度為600 900g/L，殘 糖控制在0.5 2.0%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的發(fā)酵液的溶氧濃度為分階段控制 0 18h 為 10-30%, 18h 以后為 5~15% 0
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述發(fā)酵液中各組分占總量的百分比為 接種量10 20%，葡萄糖6 10%，玉米漿0.5 2.5%，豆餅水解液2. 5 4.5%， MgSO4 ·7Η20 0. 02 0. 04%,MnSO4 · H2O 0. 0005 0. 001 %，MetO. 05%、Ile 0. 006%,Leu 0. 02%, Vbi 0. 00001 0. 00002%, VH0. 000008% 0. 000015%。
全文摘要
一種高效生產(chǎn)L-纈氨酸的發(fā)酵工藝。解決現(xiàn)有生產(chǎn)工藝產(chǎn)酸量較低且糖酸轉(zhuǎn)化率低等問題。本發(fā)明包括以營養(yǎng)缺陷型和纈氨酸滲漏型菌株為生產(chǎn)菌株，以一些營養(yǎng)組分按一定比例配制成營養(yǎng)豐富且均衡的培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵過程中，通過調(diào)節(jié)發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速和風(fēng)量將溶氧控制在適當(dāng)?shù)乃缴希ㄟ^流加液氨控制pH，并通過流加一定濃度的葡萄糖溶液將殘?zhí)强刂圃谳^低水平，發(fā)酵至60h停止。本發(fā)明在不增加任何額外設(shè)備和人力投入的情況下，縮短了整個(gè)發(fā)酵周期，并大幅提高了L-纈氨酸的產(chǎn)量(55g/L以上)和轉(zhuǎn)化率(25％以上)，整個(gè)工藝過程操作簡便，生產(chǎn)成本較低，十分適合于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12P13/08GK101962664SQ20101052743
公開日2011年2月2日 申請日期2010年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月2日 公開號(hào)201010527435.發(fā)明者馮寧, 劉淑云, 徐慶陽, 謝希賢, 陳寧 申請人:天津科技大學(xué)