專利名稱：一種微生物產(chǎn)酶發(fā)酵酶法生產(chǎn)抗病毒藥物利巴韋林的工藝的制作方法
一種微生物產(chǎn)酶發(fā)酵酶法生產(chǎn)抗病毒藥物利巴韋林的工藝技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生化工程領(lǐng)域，涉及一種基因工程菌產(chǎn)酶發(fā)酵酶法生產(chǎn) 抗病毒藥物利巴韋林的工藝。背景技術(shù)：
利巴韋林(ribavirin)，化學名為1_β _D_呋喃核糖基-1H-1，2，4_三 氮唑-3-羧酰胺，別名病毒唑，是一種廣譜抗病毒藥物，對多種DNA和RNA病毒均有顯著抑 制作用，在抗病毒臨床實踐中得到廣泛應(yīng)用。利巴韋林生產(chǎn)方法有化學合成法、發(fā)酵法和酶法三類。目前，國內(nèi)在工業(yè)生產(chǎn)上 實施的化學合成法占絕大多數(shù)，存在副產(chǎn)物多，產(chǎn)率低，操作步驟多，污染嚴重，成本高等不 足。添加前體物發(fā)酵法(日本公開專利17830/1979 ；陳寧，200710057650)雖具有原料 成本低，來源廣泛，能耗低等優(yōu)點，但是不足之處在于生產(chǎn)效率低，副產(chǎn)物多，利巴韋林分離 純化成本高，必須每次培養(yǎng)菌體且發(fā)酵時間長，生產(chǎn)成本高，目前仍處于實驗室研究階段。酶法由Witkowski等首創(chuàng)，在上個世紀80、90年代發(fā)展起來，先后經(jīng)歷了三個主要 階段一是以純酶催化核糖-1-磷酸和TCA(1，2，4-三氮唑-3-羧甲酰胺)一步式生產(chǎn)利 巴韋林(US Patent 3，976，545/1976) ；二是以自然界篩選的或人工誘變育種獲得的微生物 菌體為酶源，肌苷、胞苷、鳥苷和腺苷等作為核糖供體酶促合成利巴韋林(FUjishima，1986 ； US Patent 4614719 ；US Patent5384251 ；Shirae, 1988 ；Pochodylo, 1989 ；邱蔚然，1997 ；陳 薇梅，02115486. 4/2002)；三是以基因工程菌菌體為酶源，以鳥苷和TCA為底物合成利巴 韋林。改進后的酶法具有以下優(yōu)點①反應(yīng)效率高，收率高；②反應(yīng)時間短，副產(chǎn)物少，分 離精制容易；③三廢較易處理，對環(huán)境污染較?。虎苊冈纯梢苑磸瓦B續(xù)使用；⑤在微生物不 增殖條件下，以較高的溫度(40 60°C )反應(yīng)，幾乎沒有雜菌污染；⑥核糖供體可以從多 種核苷、核苷酸中選擇，底物來源廣泛。但是，現(xiàn)有技術(shù)普遍存在的問題主要有三個一是 利巴韋林的產(chǎn)率受核苷磷酸化酶活性的限制，天然的或傳統(tǒng)誘變獲得的微生物中，核苷磷 酸化酶表達量仍舊很低；二是現(xiàn)有構(gòu)建的基因工程菌需要昂貴的化學誘導劑異丙基-ι-硫 代-β-呋喃半乳糖苷(IPTG)的誘導才能高表達目的蛋白，增加了生產(chǎn)成本，不適合工業(yè) 化生產(chǎn)；三是現(xiàn)在作為酶源的嘌呤核苷磷酸化酶均為常溫酶，酶促反應(yīng)溫度多在60°C 70°C，能耗較高。而將低溫嘌呤核苷磷酸化酶用于酶法合成利巴韋林的應(yīng)用在國內(nèi)外尚未見報道。 針對以上情況，構(gòu)建具有高表達效率、高催化活性和較低最適反應(yīng)溫度的非化學試劑誘導 型的利巴韋林工程菌，可進一步實現(xiàn)并提高酶法合成利巴韋林的效率和降低生產(chǎn)成本，并 可進一步開發(fā)利用低溫酶，拓寬其應(yīng)用范圍，因此具有很高價值。
發(fā)明內(nèi)容為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種高表達冷適 應(yīng)嘌呤核苷磷酸化酶的基因工程菌產(chǎn)酶發(fā)酵酶法生產(chǎn)抗病毒藥物利巴韋林的工藝，該工藝 縮提高了產(chǎn)酶量，降低了酶促反應(yīng)溫度和能耗，縮短了生產(chǎn)周期，提高了生產(chǎn)效率，降低了 酶法生產(chǎn)成本。為達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施，其步驟如下1、利用分子生物學技術(shù)構(gòu)建高表達冷適應(yīng)嘌呤核苷磷酸化酶的基因工程菌 DH5a (pQF-XmPNP)利用同源序列 PCR 技術(shù)由低溫菌 Pseudoalteromonassp. XM2107 中擴增冷適應(yīng)嘌呤核苷磷酸化酶編碼基因，與啟動子部分經(jīng)改造的表達載體PQE-30連 接，構(gòu)建了具有較高表達效率和很高質(zhì)粒穩(wěn)定性的組成型表達載體PQF-XmPNP和工程菌 DH5α (pQF-XmPNP)。(注編碼冷適應(yīng)嘌呤核苷磷酸化酶基因的克隆表達、重組蛋白純化及酶學性質(zhì) 研究曾于2010年2月在《微生物學報》第50卷第2期發(fā)表。經(jīng)進一步改造獲得的高表達 冷適應(yīng)嘌呤核苷磷酸化酶的工程菌DH5 α (pQF-XmPNP)現(xiàn)保藏于天津科技大學代謝工程研 究室，公眾如有需要，可徑直與發(fā)明人聯(lián)系。)2、工程菌高密度產(chǎn)酶發(fā)酵(1)產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖 4%，酵母膏0. 2% 0. 3%，豆?jié)?2%， 玉米漿 1% 2%，MgSO4 · 7Η20 0. 0. 15%，KH2PO4 0. 2% 0. 4%，F(xiàn)eS042 4mg/L, 微量元素混合液0. 2 0. 4 %，自來水96 % 98 %，培養(yǎng)基pH值為7. 4 7. 6。(2)發(fā)酵控制工藝采用5L發(fā)酵罐，發(fā)酵溫度33 35°C，空氣流量為0. 8 8. OL/min,罐壓0. 001 0. 006MPa,溶氧維持在15 40%，發(fā)酵pH值控制在7. 2 7. 5，發(fā)酵時間為12 20h。3、酶源制備將發(fā)酵完畢后發(fā)酵液離心，菌體用50mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH7. 6) 洗滌兩遍后用25mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH7. 6)重懸備用；4、酶促反應(yīng)條件(1)反應(yīng)底物鳥苷和TCA;(2)底物濃度50 300mmol/L ；(3)投料比，鳥苷TCA=I 1 1 1.3;(4)酶用量 30 120g(濕重)/L;(5)反應(yīng)條件，50°C，20h ；5、產(chǎn)物利巴韋林定量分析反應(yīng)完畢后離心，取上清液經(jīng)無菌去離子水稀釋適當倍數(shù)，采用高效液相色譜 (High Performance Liquid Chromatography, HPLC)定量檢測利巴韋林。工作條件為 Agilent 1200型高效液相色譜儀；檢測器VWD (可變波長紫外檢測器)；檢測波長207nm ； 進樣器標準型自動進樣器；進樣量5 μ L ；色譜柱Kromasil C18，5 μ，250_Χ4. 6mm ；流動相 水乙腈=96 4(V/V)；柱溫 30°C ；流速 lml/min0利巴韋林轉(zhuǎn)化率定義
產(chǎn)物利巴韋林摩爾濃度 、AfW
,,女…、__χ 100%
轉(zhuǎn)化率(％)=
底物鳥苷摩爾濃度本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果1)采用高表達基因工程菌，目的蛋白(冷適應(yīng)嘌呤核苷磷酸化酶)得以高效表達， 目的蛋白/菌體總蛋白達到16% 22%，菌體酶活力有較大提高。2)對載體啟動子和操縱基因進行了改造，賦予了該工程菌非誘導型高效表達目 的蛋白和較高質(zhì)粒穩(wěn)定性的一系列特征，很大程度上滿足了工業(yè)化生產(chǎn)對基因工程菌的需要。
3)發(fā)酵周期短，菌體密度高，經(jīng)16 20小時產(chǎn)酶發(fā)酵即可得到較高酶活的酶源細 胞，比現(xiàn)有技術(shù)中16 22小時的發(fā)酵時間縮短了 4 6小時。發(fā)酵液光密度值0D_最高 可達60。4)酶促反應(yīng)溫度低，比現(xiàn)有技術(shù)中60 70°C的反應(yīng)溫度降低了 10 20°C，降低 了能耗和生產(chǎn)成本。5) 75 80%的轉(zhuǎn)化率雖然較現(xiàn)有工藝(80 98% )低，但本發(fā)明底物鳥苷濃度高 達lOOmmol/L (現(xiàn)有技術(shù)為肌苷20mmol/L)，酶源用量僅為30 50g濕菌體/L反應(yīng)液(現(xiàn) 有技術(shù)為50 200g濕菌體/L反應(yīng)液)，反應(yīng)20小時利巴韋林產(chǎn)量可達18. 3 19. 5/L， 酶源細胞反復利用50次，轉(zhuǎn)化率仍可達70 75%。
具體實施方式實施例1構(gòu)建高表達冷適應(yīng)嘌呤核苷磷酸化酶的組成型基因工程菌 DH5α (pQF-XmPNP)采用相關(guān)分子生物學技術(shù)對高效表達載體pQE-30進行改造后命名為PQF，其具有 如下特點①用乳糖啟動子替換了來自噬菌體的T5強啟動子，以防因強啟動子過高的啟動 效率而使重組蛋白過快表達致使其來不及折疊或折疊錯誤而無酶活性；②兩個乳糖操縱基 因的去除賦予了載體在無化學誘導劑IPTG或乳糖誘導下也能高效表達的特性，這也使得 該載體只適合表達對菌體無毒害作用的蛋白；③合成的核糖體結(jié)合位點RBS II，保證高效 的翻譯；④兩個強而有利的轉(zhuǎn)錄終止子來自λ噬菌體的t0和來自大腸桿菌rrnB操縱元 的Tl，可以有效預防轉(zhuǎn)錄中的通讀現(xiàn)象并保證表達質(zhì)粒的穩(wěn)定性。采用PCR技術(shù)，將編碼冷適應(yīng)嘌呤核苷磷酸化酶的基因deo D從重組子pXMH 上克隆擴增，并與PQF重組，轉(zhuǎn)化E. C01 i DH5 α，經(jīng)DNA測序和重組蛋白表達實驗證 明成功構(gòu)建了高表達冷適應(yīng)嘌呤核苷磷酸化酶的組成型重組子PQF-XmPNP和工程菌 DH5α (pQF-XmPNP)。將工程菌DH5 α (pQF-XmPNP)于LBAmplr平板上三區(qū)畫線，37°C恒溫箱培養(yǎng)16h獲 得單菌落用牙簽挑取單菌落到含有5mL LB/Ampr液體培養(yǎng)基的試管中，37 °C，200r/min培養(yǎng) 14h，取適量菌液進行SDS-PAGE蛋白電泳分析。發(fā)酵液酶活力測定以Iml發(fā)酵液離心后的 菌體為酶源，20mmol/L鳥苷和TCA為底物，25mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH7. 6)反應(yīng)液，60°C下 催化利巴韋林生成反應(yīng)30min。每分鐘催化底物生成1 μ mol利巴韋林所需的酶量為一個酶 活單位。LB培養(yǎng)基培養(yǎng)14h，菌體密度OD6tltl最高可達3，其中目的蛋白/菌體總蛋白最高可 達18. 5%，產(chǎn)酶發(fā)酵液酶活力可達2600U/L。實施例2工程菌DH5 α (pQF-XmPNP)質(zhì)粒穩(wěn)定性采用平板稀釋計數(shù)法。將凍存于-80°C甘油管中的工程菌DH5 α (pQF-XmPNP)在 含ΙΟΟμ g/L氨芐青霉素的LB平板上三區(qū)劃線，37°C培養(yǎng)16h，挑取單菌落接種于5ml液體 選擇性培養(yǎng)基(LB/AmpD中，搖管培養(yǎng)12h后以的接種量轉(zhuǎn)入5ml液體非選擇性培養(yǎng)基 (LB)，開始連續(xù)搖管培養(yǎng)試驗。每12h轉(zhuǎn)種一次，接種量為1%，連續(xù)傳代30次，每隔5次 取樣進行平板稀釋檢測質(zhì)粒的缺失程度。檢測時，取菌液Iml用無菌水逐級稀釋，取三個合 適的梯度，分別涂在固體選擇性培養(yǎng)基和非選擇性培養(yǎng)基平板上，每個處理三個重復。倒置 在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h，計算各皿中的菌落數(shù)。將選擇性培養(yǎng)基中的菌落數(shù)與非選擇性培養(yǎng)基中菌落數(shù)進行比較，即可計算出質(zhì)粒的缺失率，見表1。表1工程菌DH5 α (pQF-XmPNP)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性
權(quán)利要求
一種微生物產(chǎn)酶發(fā)酵酶法生產(chǎn)抗病毒藥物利巴韋林的工藝，即利用自行構(gòu)建的高表達冷適應(yīng)嘌呤核苷磷酸化酶的基因工程菌DH5α(pQF XmPNP)產(chǎn)酶發(fā)酵，以鳥苷和TCA(1，2，4 三氮唑 3 羧甲酰胺)為底物，微生物酶法生產(chǎn)利巴韋林，其特征在于該生產(chǎn)工藝包括A.利用分子生物學技術(shù)構(gòu)建高表達冷適應(yīng)嘌呤核苷磷酸化酶的基因工程菌DH5α(pQF XmPNP)利用同源序列PCR技術(shù)由低溫菌Pseudoalteromonas sp.XM2107中擴增冷適應(yīng)嘌呤核苷磷酸化酶編碼基因，與啟動子部分經(jīng)改造的表達載體pQE 30連接，構(gòu)建了具有較高表達效率和很高質(zhì)粒穩(wěn)定性的表達載體pQF XmPNP和工程菌DH5α(pQF XmPNP)。B.工程菌高密度產(chǎn)酶發(fā)酵將步驟A中獲得的經(jīng)擴大培養(yǎng)的菌種接入發(fā)酵培養(yǎng)基進行工程菌高密度產(chǎn)酶發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源含量應(yīng)為0.2％～4％，氮碳比N∶C應(yīng)介于20∶100～80∶100之間，無機鹽含量應(yīng)為0.1～12％，發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH7.2～7.8，培養(yǎng)溫度30℃～36℃，振蕩培養(yǎng)或發(fā)酵罐培養(yǎng)12～20h，接種量為2％～10％(V/V)；發(fā)酵過程中，添加氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值維持在7.2～7.5；C.酶源制備將步驟B發(fā)酵完畢后離心產(chǎn)酶發(fā)酵液，菌體用50mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH7.6)洗滌兩遍后用25mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH7.6)重懸備用；D.酶促反應(yīng)條件鳥苷和TCA；底物濃度分別為50～300mmol/L；投料比，鳥苷∶TCA＝1∶1～1∶1.3；酶用量30～120g(濕重)/L；反應(yīng)條件，50℃，20h；E.產(chǎn)物利巴韋林定量分析將步驟E反應(yīng)完畢后離心，取上清液經(jīng)無菌去離子水稀釋適當倍數(shù)，采用高壓高效液相色譜法定量檢測產(chǎn)物利巴韋林。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)工藝，其特征在于B步發(fā)酵采用的基因工程菌，即高效表 達冷適應(yīng)嘌呤核苷磷酸化酶的DH5 α (pQF-XmPNP)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)工藝，其特征在于B步產(chǎn)酶發(fā)酵采用的培養(yǎng)基葡萄糖 4%，酵母膏0. 2% 0. 3%，豆?jié)?2%，玉米漿 2%，MgS04 ·7Η20 0. 0. 15%, KH2PO4 0. 2% 0. 4%，F(xiàn)eSO4 2 4mg/L，微量元素混合液 0. 2 0. 4%，自來水 96% 98%，發(fā)酵pH值控制在7. 2 7. 5。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)工藝，其特征在于B步產(chǎn)酶發(fā)酵采用的控制工藝采用 5L發(fā)酵罐，發(fā)酵溫度33 35°C，空氣流量為0. 8 8. OL/min,罐壓0. 001 0. 006MPa,溶 氧維持在15 40%，發(fā)酵時間為12 20h。
全文摘要
一種利用基因工程菌產(chǎn)酶發(fā)酵，微生物酶法生產(chǎn)抗病毒藥物利巴韋林的生產(chǎn)工藝。構(gòu)建高效表達冷適應(yīng)嘌呤核苷磷酸化酶的基因工程菌DH5α(pQF-XmPNP)，優(yōu)化冷適應(yīng)酶表達條件，采用該工程菌，以葡萄糖、酵母膏、豆?jié)?、玉米漿、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、微量元素和自來水為原料，進行產(chǎn)酶發(fā)酵，以所得菌體為酶源，以鳥苷和TCA(1，2，4-三氮唑-3-羧甲酰胺)為底物，50℃反應(yīng)生產(chǎn)利巴韋林。本發(fā)明降低了傳統(tǒng)酶法反應(yīng)溫度，降低了能耗，產(chǎn)酶效率高，底物轉(zhuǎn)化率高，環(huán)境污染程度低，工藝簡單，降低了生產(chǎn)成本。
文檔編號C12N15/55GK101974585SQ201010527428
公開日2011年2月16日 申請日期2010年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月2日 公開號201010527428.發(fā)明者劉淑云, 夏俊剛, 徐慶陽, 謝希賢, 陳寧 申請人:天津科技大學