專利名稱：玉米耐漬性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因zm-bRLZ及分子標(biāo)記與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及到一個位于玉米第9染色體上，與玉米 苗期耐漬性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因zm-bRLZ的克隆及其功能標(biāo)記的開發(fā)與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
南方春玉米和北方夏玉米在正常的栽培季節(jié)中，經(jīng)常遭受洪澇和漬害，因長期漬 水使玉米根系處于低氧狀態(tài)，導(dǎo)致玉米減產(chǎn)。漬害已成為制約玉米高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的重要非生物 逆境因子。培育耐漬性玉米品種是減少淹水脅迫帶來損失的有效途徑。許多研究表明，玉米自交系間存在耐漬性的遺傳差異，這為通過育種手段進行玉 米耐漬性的遺傳改良提供了基因資源。在建立玉米苗期耐漬性鑒定指標(biāo)的基礎(chǔ)上，我們對 120份玉米自交系種質(zhì)進行了耐漬性的鑒定篩選(姜華武，張祖新，1999)，以耐漬性顯著 差異的自交系(HZ32，Mol7，K12等)為材料，我們開展了控制玉米耐漬性的QTL定位、全基 因組的表達(dá)譜分析、代謝途徑中重要酶基因的表達(dá)和活性研究(張祖新等，2003;Zhang et al.，2005b ；Tang et al.，2005)等。然而，由于玉米耐漬性為一復(fù)雜性狀，存在顯著的基因 型與環(huán)境互作，同時脅迫強度和時間具有不可預(yù)測性，因此，使用常規(guī)育種技術(shù)對玉米耐漬 性改良比較困難。近年來研究表明，分子設(shè)計育種將分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)和 常規(guī)育種方法有機結(jié)合在一起，可為玉米耐漬性的遺傳改良提供一套全新的技術(shù)方案。優(yōu)良耐漬基因的發(fā)掘、鑒定與克隆是開展玉米耐漬性分子設(shè)計育種的前提。近年 來，模式植物(擬南芥和水稻)耐漬響應(yīng)的關(guān)鍵代謝途徑的闡明及其重要基因克隆(Hoeren et al. ,1998 ；Xu et al. ,2006 ；Hattori et al.，2009)，為植物耐漬性的遺傳改良提供了 基因資源。當(dāng)今，在植物耐漬性改良探索中所使用的基因資源主要包括1)導(dǎo)入發(fā)酵途徑 相關(guān)基因如Adhl、Pdcl、Pdc2、Ldh等，提高擬南芥植株對低氧脅迫的耐性；在棉花和水稻中 也有類似的報道(Ellis et al. ,2002 ；Dolferous et al.，2003 ；Ismond et al. ,2003) 2)導(dǎo)入?yún)捬跽T導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子如AtMYB2基因，啟動發(fā)酵途徑和其他代謝途徑中相關(guān)基因的 表達(dá)，增強擬南芥對低氧脅迫的長期適應(yīng)反應(yīng)(Hoeren et al.，1998)，但AtMYB2的組成型 超量表達(dá)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化植株夭折(Dolferous et al.，2003)。3)導(dǎo)入外源物種透明顫菌的血紅 蛋白基因vhb，提高植物根系對氧的捕獲效率，以緩解長時間淹水造成的厭氧脅迫。因此，在 育種實踐中可用的基因資源非常有限，進一步鑒定并克隆玉米耐漬基因仍然十分必要。鑒于此，本發(fā)明利用cDNA芯片技術(shù)，鑒定并克隆了一個玉米苗期耐漬性響應(yīng)的轉(zhuǎn) 錄因子基因zm-bRLZ，證實了該基因在玉米耐漬性形成中的功能及作用機理，基于基因序列 開發(fā)了一對功能性分子標(biāo)記，為玉米耐漬性的分子設(shè)計育種提供了新的基因資源和實用性 標(biāo)記。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是從玉米中克隆一個玉米苗期耐漬性相關(guān)的基因的完整編碼區(qū)DNA片段及其啟動子，利用該基因開發(fā)實用性分子標(biāo)記。我們將這個基因命名為zm-bRLZ。本發(fā)明利用不同耐漬性的玉米自交系Mol7(引自國家農(nóng)作物種質(zhì)保存中心，漬水 敏感)和Hz32(引自國家農(nóng)作物種質(zhì)保存中心，耐漬性強)為材料，其中Hz32在西南地區(qū) 育種中被廣泛應(yīng)用。我們制作了玉米全生育期均一化cDNA芯片，通過對Hz32和Mol7在淹 水脅迫條件下苗期根系的基因表達(dá)差異研究，鑒定得到了一個耐漬性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因 zm-bRLZ。利用Real time PCR進一步驗證了芯片結(jié)果，該基因在耐漬材料Hz32中受淹水脅 迫誘導(dǎo)，而在敏感材料Mol7中則變化不明顯。使用RACE技術(shù)獲得了該基因的1199bp全長 cDNA，序列分析顯示，該cDNA序列含有1個869bp的開放閱讀框，編碼282個氨基酸；預(yù)測的 蛋白質(zhì)序列中有一個bZip/bRLZ結(jié)構(gòu)域和一個DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，具有真核生物L(fēng)eu Zipper 類轉(zhuǎn)錄因子的典型特征。洋蔥表皮的瞬時表達(dá)分析證實，該基因產(chǎn)物在細(xì)胞核內(nèi)累積。凝 膠滯后分析證實，該基因蛋白質(zhì)產(chǎn)物與ADH啟動子(M32984. 1)厭氧響應(yīng)元件(anaerobic responsive element :ARE)體外結(jié)合。另外，通過對K12 (引自國家農(nóng)作物種質(zhì)保存中心，漬 水敏感)及Hz32兩個材料之間的比較測序，成功開發(fā)了 一對基于zm-bRLZ基因序列的CAPS 標(biāo)記，利用K12XHz32 F2群體，將該基因定位于9. 04bin耐漬性QTL峰值處，該QTL貢獻(xiàn)率 為7.0%。候選基因的關(guān)聯(lián)分析證實，zm-bRLZ基因啟動子區(qū)域與3'-非轉(zhuǎn)錄區(qū)區(qū)的多個 單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點與多個耐漬性指標(biāo)(如地上部長度、地上部鮮重及地上部長度 系數(shù))均極顯著關(guān)聯(lián)。本發(fā)明的優(yōu)點在于(1)本發(fā)明首次在玉米中克隆并證實了一個耐漬性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因，為玉米 耐漬性遺傳改良提供了新的基因資源；(2)基于本發(fā)明所克隆的基因開發(fā)了一對功能性分子標(biāo)記，可為分子標(biāo)記輔助育 種提供實用性的分子標(biāo)記。


序列表SEQ ID NO 1是本發(fā)明克隆的與玉米耐漬性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因zm-bRLZ 的核苷酸序列。序列表SEQ ID NO 2是本發(fā)明克隆的與玉米耐漬性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因zm-bRLZ 編碼區(qū)。序列表SEQ ID NO 3是本發(fā)明克隆的與玉米耐漬性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因zm-bRLZ 編碼的氨基酸序列。序列表SEQ ID NO :4_11是擴增玉米耐漬性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因zm-bRLZ的引物 序列。序列表SEQ ID NO 12是基因zm-bRLZ的CAPS分子標(biāo)記的核苷酸序列。圖1 是Real time PCR顯示zm_bRLZ基因在淹水4h的Hz32被誘導(dǎo)表達(dá)情況。圖2 是zm-bRLZ基因的外顯子、內(nèi)含子所在位置的示意圖。圖3 是pEGAD載體示意圖。圖4 是zm-bRLZ表達(dá)產(chǎn)物的洋蔥表皮定位。圖5 是pGEX-KG載體示意圖。圖6 是zm-bRLZ蛋白質(zhì)分離及其凝膠阻滯電泳分析結(jié)果，圖中泳道1 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記；泳道2 純化的zm-bRLZ蛋白質(zhì)；泳道3 純化的zm-bRLZ蛋白質(zhì)+含ARE元件的 探針；泳道3 游離ARE元件探針。圖7 是CAPS標(biāo)記電泳圖，泳道1 =DNA分子量標(biāo)記DL2000 ；泳道2 =G型基因型；
泳道3 =G型基因型；泳道4 雜合基因型。圖8 是zm-bRLZ基因在第9染色體上的定位及耐漬QTL的定位，注作圖群體為 K12XHZ32 F2群體，QTL定位群體為K12XHZ32 F2 :3群體。圖9 是zm-bRLZ基因與玉米耐漬相關(guān)性狀的關(guān)聯(lián)分析，注縱坐標(biāo)表示解釋的表 型變異；橫坐標(biāo)表示DNA序列位置；T5表示地上部分長度；T6表示地上部長度系數(shù)。
具體實施例方式以下實施實例進一步定義本發(fā)明，并描敘了克隆zm-bRLZ基因、闡明基因功能及 其功能標(biāo)記開發(fā)的方法。根據(jù)以下的描述和實例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本 特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明做出適當(dāng)?shù)耐晟坪托薷模?使其適用各種用途和條件。實施例1 利用cDNA芯片篩選得到zm-bRLZ(1)芯片篩選得到差異表達(dá)基因zm-bRLZ本發(fā)明選用耐漬性較差的Mol7和耐漬性強的Hz32兩個玉米自交系為試材。種 子萌發(fā)后，于沙缽盆栽培養(yǎng)至兩葉一心期。挑選長勢一致的若干單株平均分成兩組。一組 作為對照，在正常水分和管理條件下生長；另一組采用IX完全培養(yǎng)液[成分=Ca(NO3) 2 820. 7mg/L，KNO3 505. 6mg/L，MgSO4 ·7Η20 616. 2mg/L, KH2PO4 272. 2mg/L, Fe-EDTA 13. 02mg/ L, H3BO3 2. 860mg/L, MnSO4 1. 015mg/L, CuSO4 · 5H20 0. 079mg/L, ZnSO4 · 7H20 0. 220mg/L, H2MoO4 0. 090mg/L]進行l(wèi)h、2h、4h和8h的淹水處理，淹水深度以水面剛好淹沒最下葉片基 部為宜。分別剪取處理和對照的根系，于-70°C保存?zhèn)溆谩＠帽旧暾埲怂趯嶒炇覙?gòu)建的玉米自交系Mol7全生育期均一化cDNA文庫(見 Zhang et al.，2005a)，使用BioRobotics試劑盒(劍橋公司，英國)將10886個插入片段 PCR產(chǎn)物點制于尼龍膜上，制成cDNA芯片(方法見Zhang et al. , 2005b) 將Hz32和Mol7 淹水處理lh、2h、4h和對照的總RNA樣品，各自分離其mRNA并反轉(zhuǎn)錄，得到33P標(biāo)記的第一 鏈cDNA產(chǎn)物做探針，用于與cDNA芯片雜交。預(yù)雜交液(6X檸檬酸鹽緩沖液SSC，0. 5% 十二烷基硫酸鈉SDS，5 XDenhardt' s試劑，100 μ g/ml鮭魚精DNA)中68°C預(yù)雜交3h，然 后加入探針于雜交液(6XSSC，0. 5%十二烷基硫酸鈉，100 μ g/mL鮭魚精DNA)中雜交過夜。 雜交結(jié)束后洗膜液(0.1 XSSC，0.5%十二烷基硫酸鈉)中，65°C洗膜lh。洗好的膜用利用 FLA-3000A Plate/Fluorescent Image Analyzer (東京電力，日本)掃描。選取處理與對照 差異在3倍以上的克隆進行測序分析。其中，zm-bRLZ基因在HZ32中受淹水脅迫高效誘導(dǎo) 表達(dá)，在Mo 17中變化不顯著。(2)實時定量PCR驗證分別取Hz32和Mol7淹水lh、2h、4h和8h處理及對照的總RNA各5 μ g，進行cDNA 第一鏈的合成。反轉(zhuǎn)錄選用 RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (購 自MBI，Lithuania公司試劑盒，按照試劑盒的說明書操作)進行。選取玉米看家基因 actin (NMJ)Ol 155179) AAGTACCCGATTGAGCATGG, GATGGAGTTGTACGTGGCCT 為對照。PCR 引物見表 1.所示。熒光定量 PCR 使用 CFX96 Real-TimeSystem C1000 Thermal Cycler (Bio-RAD， USA)，使用寶生物工程(大連)有限公司SYBRGreen PCR MasterMix試劑盒。熒光 定量反應(yīng)體系為20 yL:含有SYBR Mix 10 μ L，正反向引物TTCATCCGGGAGAGCGGCGA， GCGAAACCGAAGCCGGGTGAdO μ moL/L)各0. 8 μ L，模板2 μ L和焦碳酸二乙酯處理過的無菌 水。擴增條件為94°C預(yù)變性2min ；94°C IOs, 60°C 30s, 72°C 15s，38個循環(huán)。每組實驗3 個生物學(xué)重復(fù)，2次技術(shù)重復(fù)。結(jié)果表明，實時定量PCR與芯片結(jié)果相符合(圖1)。表1 zm-bRLZ基因組序列擴增引物
權(quán)利要求
一個分離克隆的控制玉米耐漬性的轉(zhuǎn)錄因子基因zm bRLZ，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示。
2.權(quán)利要求1所述的基因，它的cDNA序列如序列表SEQID NO :2所示。
3.一種控制玉米耐漬性的轉(zhuǎn)錄因子基因zm-bRLZ的CAPS標(biāo)記，其PCR引物組合為 bRLZ-7 CAACTCAAATAGCTGGTGGC, bRLZ-8 CCCGGTCAACCCTTGTTTTGTATG, PCR 產(chǎn)物酶切所用 的限制性核酸內(nèi)切酶為Msp I。
4.權(quán)利要求1或2所述的基因在玉米遺傳改良中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求3所述的標(biāo)記在玉米分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。涉及一種玉米耐漬性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因zm-bRLZ的克隆及應(yīng)用，該基因的核苷酸序列如SEQ ID No1所示，全長4027bp，含6個外顯子。其cDNA序列如SEQ ID NO2所示，編碼282個氨基酸。在淹水脅迫下，該基因在玉米自交系Hz32幼苗根系中上調(diào)表達(dá)，在Mo17中其表達(dá)水平不變?；虻鞍踪|(zhì)產(chǎn)物與ADH啟動子厭氧響應(yīng)因子體外結(jié)合，表明zm-bRLZ基因?qū)捬跽T導(dǎo)基因具有調(diào)控作用。利用玉米耐漬性自交系Hz32和高度敏感系K12中zm-bRLZ基因序列差異，開發(fā)了一對CAPS標(biāo)記。利用K12×Hz32 F2群體，將該基因定位于9.04bin耐漬性QTL峰值處。候選基因關(guān)聯(lián)分析證實，zm-bRLZ基因啟動子區(qū)域及3′-UTR區(qū)的多個SNP位點與多個耐漬性指標(biāo)均極顯著關(guān)聯(lián)。
文檔編號C12N15/11GK101974537SQ201010284678
公開日2011年2月16日 申請日期2010年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月13日
發(fā)明者姜媛媛, 張祖新, 邱法展, 鄒錫玲, 鄭用璉 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)