專利名稱：一種獸用微生態(tài)制劑及其制備方法與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種獸用微生態(tài)制劑及其制備方法與用途，屬于微生態(tài)制劑技術(shù)領(lǐng) 域。
背景技術(shù)：
獸用微生態(tài)制劑是一種綠色、安全的飼料添加劑，具有防病、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、促 進(jìn)生長、增加體重等多種功能，且無污染，無殘留，不產(chǎn)生抗藥性。目前，市場上的微生態(tài)制劑存在以下幾個(gè)方面的問題(1)活菌含量低，而研究表 明，如果一種菌在盲腸內(nèi)容物中的濃度低于IO7個(gè)/g，則該菌產(chǎn)生的酶及代謝產(chǎn)物不足以影 響宿主，難以滿足治療需要；(2)不耐抗生素；(3)對(duì)高溫、胃酸和膽鹽不穩(wěn)定，致使只有少 數(shù)菌株進(jìn)入腸道后仍具有活性，達(dá)不到發(fā)揮作用所需的活菌數(shù)量；(4)不穩(wěn)定，保存期短。 由于微生態(tài)制劑存在的這些問題，從而影響了其在動(dòng)物上的應(yīng)用效果，限制了微生態(tài)制劑 的廣泛應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種對(duì)抗生素有耐受性、活菌含量高、穩(wěn)定、保存期長的獸 用微生態(tài)制劑。該獸用微生態(tài)制劑中主要活性成分是酪酸梭菌CGMCCNo. 1925菌粉。本發(fā)明的另一目的是提供該獸用微生態(tài)制劑的制備方法和用途。本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明提供一種獸用微生態(tài)制劑，該制劑的活性成分為酪酸梭菌CGMCC No. 1925 菌粉。其中，所述的酪酸梭菌(Clostridium butyricum)CGMCC No. 1925為申請(qǐng)人從動(dòng) 物腸道中分離、選育得到，經(jīng)中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心鑒定，并于2007年1月22 日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏(簡稱CGMCC)，保藏號(hào)為 CGMCC No. 1925。本發(fā)明的酪酸梭菌CGMCC No. 1925對(duì)膽汁的耐受性很高，膽汁處理對(duì)酪酸 梭菌的活性幾乎沒有影響；短時(shí)間內(nèi)可耐強(qiáng)酸，如PH 1.0或pH 2.0，在pH 3. 0、4. 0條件下 可長時(shí)間耐酸，酪酸梭菌的活性基本不受影響；耐高溫，具有較好的熱存放穩(wěn)定性；對(duì)一些 抗生素不敏感，如對(duì)硫酸粘桿菌素不敏感，對(duì)諾氟沙星敏感性弱。本發(fā)明的獸用微生態(tài)制劑中，酪酸梭菌CGMCC No. 1925菌濃度為lX106CFU/g lX1010CFU/g。進(jìn)一步，酪酸梭菌CGMCC No. 1925 菌濃度為 1 X 109CFU/g。本發(fā)明的獸用微生態(tài)制劑還可進(jìn)一步包含載體，載體為石粉、硫酸鉀鋁、玉米芯粉 中的任一種或兩種。本發(fā)明還提供了該獸用微生態(tài)制劑的制備方法，其制備過程如下(1)酪酸梭菌CGMCC No. 1925的菌種復(fù)壯；菌種的復(fù)壯代數(shù)可根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行，但申請(qǐng)人在發(fā)明過程中發(fā)現(xiàn)，酪酸梭菌CGMCC No. 1925經(jīng)過4代復(fù)壯，第4代發(fā)酵液芽孢率高且平板記數(shù)較高，因此申請(qǐng)人優(yōu)選第 四代作為復(fù)壯菌種；(2)酪酸梭菌CGMCC No. 1925的培養(yǎng)、發(fā)酵將復(fù)壯菌種接種于CBM液體培養(yǎng)基中， 37°C恒溫箱中培養(yǎng)24小時(shí)，芽孢率在75%以上后，接種于發(fā)酵罐中，接種量10%，37°C恒溫 培養(yǎng)24小時(shí)，芽孢率達(dá)到75%以上時(shí)，使發(fā)酵液降溫至20°C ；(3)連續(xù)離心收集菌體，將菌泥用保護(hù)液和載體調(diào)配至固型物濃度5-10%，以進(jìn) 口溫度115°C，出口溫度80°C的條件進(jìn)行噴霧干燥，收集菌粉，即得；菌粉的收集方法可為其它方法，如用45°C左右氣流干燥，干燥后制成菌粉，但申請(qǐng) 人發(fā)現(xiàn)噴霧干燥制備的菌粉活菌含量高，所以本發(fā)明優(yōu)選噴霧干燥。其中，CBM培養(yǎng)基配方葡萄糖1.0%、酪蛋白胨1.0%、酵母粉0.5%、牛肉膏 0. 5%, (NH4)2SO4O. 3%, NaCl 0. 3%, K2HPO4 · H2O 0. 4%, MnSO4 · H2O 0. 02%, MgSO4 · 7H20 0. 05%, CaCO3 0.2%、瓊脂2.0% (固體培養(yǎng)基用)，pH值7· 2，滅菌條件121°C，30分鐘。其中，所述的保護(hù)液為10%的脫脂奶。本發(fā)明還提供了該獸用微生態(tài)制劑用于制備飼料添加劑的用途。本發(fā)明的獸用微生態(tài)制劑活菌含量高，酪酸梭菌CGMCC No. 1925菌濃度可高達(dá) 1 X 1010CFU/g ；對(duì)抗生素有耐受性，在動(dòng)物的生長過程中，不可避免的要使用抗菌素對(duì)動(dòng)物 疾病進(jìn)行治療，為了防止疾病的發(fā)生和促進(jìn)生長，國內(nèi)的一些飼料生產(chǎn)企業(yè)和養(yǎng)殖企業(yè)在 飼料中添加亞劑量的抗菌素，這種養(yǎng)殖行為對(duì)動(dòng)物腸道微生態(tài)會(huì)產(chǎn)生很大的影響，很多微 生態(tài)制劑在此種情況下而不能發(fā)揮其原有的作用，但本發(fā)明的微生態(tài)制劑對(duì)某些抗生素不 敏感或敏感性弱，如對(duì)硫酸粘桿菌素不敏感，對(duì)諾氟沙星敏感性弱，因此本發(fā)明的微生態(tài)制 劑在制備及使用過程中，就可不受這些抗生素的影響，即使這些抗生素存在，也能發(fā)揮本發(fā) 明微生態(tài)制劑的活性成分——酪酸梭菌CGMCC No. 1925增強(qiáng)機(jī)體免疫力、促進(jìn)生長、增加體 重等益生作用；而且，微生態(tài)制劑因其綠色、環(huán)?？商娲股囟苋祟惽嗖A，本發(fā)明的微 生態(tài)制劑在研究中還發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的微生態(tài)制劑可真正替代一些抗生素，如黃霉素，二者抗 病能力相當(dāng)；本發(fā)明的微生態(tài)制劑耐胃酸、膽鹽、高溫等，菌株進(jìn)入腸道后仍具有活性，從而 發(fā)揮其作用；且該制劑在25°C、40°C溫度的保存條件下活性基本穩(wěn)定，隨存放時(shí)間的延長， 活性雖有下降，但活性損失不大；另外，本發(fā)明微生態(tài)制劑的制備方法簡單，各種實(shí)驗(yàn)條件 都經(jīng)過了申請(qǐng)人的實(shí)驗(yàn)研究，用本發(fā)明的制備方法制備出的微生態(tài)制劑，酪酸梭菌活菌含 量高，在制備過程中酪酸梭菌CGMCC No. 1925表現(xiàn)較好的抗機(jī)械加工性，造粒加工后，活性 基本沒有被破壞，在飼料中的穩(wěn)定性較好等。通過下列實(shí)施例將更具體的說明本發(fā)明，但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是為了說明本 發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1酪酸梭菌的分離、鑒定樣品采集菌種分離的樣品來自動(dòng)物腸道中。菌體為直或彎曲，端圓，單個(gè)或成對(duì)、短鏈偶見長絲狀菌體，周生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)；革 蘭氏陽性，在老培養(yǎng)物中能變?yōu)殛幮?；菌體中常有圓形或橢圓形芽孢，使菌體中部膨大成梭 形，孢子偏心或次端生、無孢子外壁或附屬絲；表面菌落圓形或不規(guī)則，直徑1-3毫米，稍凸，白色至奶油色，表面有光澤至無光澤；該菌為厭氧菌，在合適的培養(yǎng)基中生長良好，并產(chǎn) 氣。經(jīng)中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心鑒定為酪酸梭菌(Clostridium Butyricum)。實(shí)施例2酪酸梭菌的培養(yǎng)1.材料與方法(1)菌種酪酸梭菌 CGMCC No. 1925(2)器材光學(xué)顯微鏡，厭氧罐，恒溫培養(yǎng)箱等。(3)藥品結(jié)晶紫染液，石炭酸復(fù)紅染液。(4)培養(yǎng)方式三角瓶液體深層靜置培養(yǎng)(非嚴(yán)格厭氧條件)。平皿固體培養(yǎng)需置 于厭氧罐中進(jìn)行。(5)檢測方法菌數(shù)測定可用平板傾注法和血球記數(shù)法。菌體形態(tài)用結(jié)晶紫染液 及石炭酸復(fù)紅染液染色后于顯微鏡下觀察。2.結(jié)果(1)碳氮源配比試驗(yàn)以葡萄糖為碳源，氮源選用蛋白胨、酵母粉及牛肉浸膏組成復(fù)合氮源提供菌體生 長所需的生長因子。實(shí)驗(yàn)中固定培養(yǎng)基其他組分用量，分別以碳氮源為變量進(jìn)行對(duì)比培養(yǎng)， 以下是不同碳氮源用量及比例的培養(yǎng)結(jié)果。①碳源用量試驗(yàn)以葡萄糖為碳源，分為6個(gè)用量水平進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果見表1。表1.葡萄糖用量對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果
試驗(yàn)組1234S6葡萄糖(％)0.10.51.01.52.03.024hr 菌濃 cfu/ml1.2 XIO62.5 XIO77.5 XIO86.0 XIO84.8 XIO83.0x10s結(jié)果表明碳源在1. 0%水平時(shí)，菌體生長較好，菌數(shù)較高。②氮源配比試驗(yàn)鑒于酪酸梭菌菌株的生長要求，參考幾種現(xiàn)有培養(yǎng)基的組成，試 驗(yàn)以酪蛋白胨、酵母浸膏粉和牛肉浸膏為復(fù)合氮源，分別做不同配比的培養(yǎng)試驗(yàn)，結(jié)果見表2。表2.氮源配比試驗(yàn)結(jié)果
試驗(yàn)組12345678mm (X)0.51.01.02.00.51.01.02.0酵母粉(%)0.50.51.02.00.50.51.02.0ω00000.50.50.50.524hr 菌濃 cfivinlX IO83.93.84.03.85.57.56.55.0結(jié)果表明氮源組成和比例對(duì)菌數(shù)有明顯影響，其中6、7組的培養(yǎng)結(jié)果較好。③碳氮綜合試驗(yàn)結(jié)合以上兩個(gè)試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行不同碳氮比下菌體得率和芽孢生 成率的試驗(yàn)。結(jié)果見表3。
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表3.碳氮綜合試驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
一種獸用微生態(tài)制劑，其特征在于活性成分為酪酸梭菌CGMCC No.1925菌粉。
2.權(quán)1所述的獸用微生態(tài)制劑，其特征在于酪酸梭菌CGMCCNo. 1925菌濃度為 1 X 106CFU/g 1 X 10lclCFU/g。
3.權(quán)2所述的獸用微生態(tài)制劑，其特征在于酪酸梭菌CGMCCNo. 1925菌濃度為 lX109CFU/g。
4.權(quán)1 3任一項(xiàng)所述的獸用微生態(tài)制劑，其特征在于進(jìn)一步包含載體，載體為石粉、 硫酸鉀鋁、玉米芯粉中的任一種或兩種。
5.如權(quán)1 4任一項(xiàng)所述的獸用微生態(tài)制劑的制備方法，其特征在于制備過程如下(1)酪酸梭菌CGMCCNo. 1925的菌種復(fù)壯；(2)酪酸梭菌CGMCCNo. 1925的培養(yǎng)、發(fā)酵將復(fù)壯菌種接種于CBM液體培養(yǎng)基中，37°C 恒溫箱中培養(yǎng)24小時(shí)，芽孢率在75%以上后，接種于發(fā)酵罐中，接種量10%，37°C恒溫培養(yǎng) 24小時(shí)，芽孢率達(dá)到75%以上時(shí)，使發(fā)酵液降溫至20°C ；(3)連續(xù)離心收集菌體，將菌泥用保護(hù)液和載體調(diào)配至固型物濃度5-10%，以進(jìn)口溫 度115°C，出口溫度80°C的條件進(jìn)行噴霧干燥，收集菌粉，即得；CBM培養(yǎng)基配方葡萄糖1.0%、酪蛋白胨1.0%、酵母粉0.5%、牛肉膏0.5%、 (NH4)2SO4O. 3%, NaCl 0. 3%, K2HPO4 · H2O 0. 4%, MnSO4 · H2O 0. 02%, MgSO4 · 7Η200· 05%, CaCO3O. 2%、瓊脂2. 0% (固體培養(yǎng)基用)，ρΗ值7. 2，滅菌條件:121°C，30分鐘。
6.權(quán)5所述的獸用微生態(tài)制劑的制備方法，其特征在于所述的保護(hù)液為10%的脫脂奶。
7.如權(quán)1 4任一項(xiàng)所述的獸用微生態(tài)制劑在制備飼料添加劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種獸用微生態(tài)制劑及其制備方法與用途，屬于微生態(tài)制劑技術(shù)領(lǐng)域。該微生態(tài)制劑的活性成分為酪酸梭菌CGMCC No.1925菌粉。本發(fā)明的獸用微生態(tài)制劑活菌含量高；對(duì)抗生素有耐受性，對(duì)一些抗生素不敏感或敏感性弱；而且，該微生態(tài)制劑可替代一些抗生素；可耐胃酸、膽鹽、高溫等。另外，本發(fā)明微生態(tài)制劑的制備方法簡單，用本發(fā)明的制備方法制備出的微生態(tài)制劑，酪酸梭菌活菌含量高。本發(fā)明的獸用微生態(tài)制劑有較好的市場前景。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101982089SQ20101028196
公開日2011年3月2日 申請(qǐng)日期2010年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月15日
發(fā)明者宋維平, 聶實(shí)踐 申請(qǐng)人:北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司;北京百林康源生物技術(shù)有限責(zé)任公司