專利名稱：中國黃連懸浮細胞培養(yǎng)生產(chǎn)小檗堿的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中國黃連懸浮細胞培養(yǎng)生產(chǎn)小檗堿的方法。
背景技術(shù)：
植物細胞不僅具有形態(tài)建成全能性，同時還具有物質(zhì)代謝全能性。利用植物細胞全能性發(fā)展起來的細胞培養(yǎng)技術(shù)是解決藥用植物資源日益匱乏，實現(xiàn)藥用次生代謝產(chǎn)物工業(yè)化的有效手段。植物細胞懸浮培養(yǎng)由于其分散性好，細胞形狀及細胞團大小較均勻，而且生長迅速，重復(fù)性好，易于控制等有利因素，已被應(yīng)用于植物次生代謝物的大規(guī)模生產(chǎn)。增加植物細胞培養(yǎng)物中次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法可通過改變培養(yǎng)基成分及其濃度、生長調(diào)節(jié)劑的優(yōu)化、細胞克隆的選擇等手段來實現(xiàn)。植物細胞在一定培養(yǎng)條件下，可提高目標次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率，不受自然資源的限制，易于工業(yè)化生產(chǎn)并且降低提取物中的雜質(zhì)成分，便于分離純化，降低產(chǎn)品成本。黃連是中國及其他亞洲國家常用的重要藥材。中國黃連(Coptis chinensis Franch)為毛莨科多年生草本植物，其根莖含多種生物堿，主要為小檗堿(Berberine)，又名黃連素。小檗堿具有抗病原微生物、止瀉、抗心律失常、降壓、改善心力衰竭、改善胰島素抵抗、降血脂、抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用。中國黃連生境較為嚴格，且生長緩慢，一般4 6年才能采集入藥。由于長期缺少有計劃的采挖致使野生黃連瀕危，已造成該植物資源枯竭，雖有引種栽培，卻要占用大量農(nóng)田，而且中國黃連的生長周期長，加之受環(huán)境的制約，使得小檗堿含量和質(zhì)量不穩(wěn)定；少量采用化學(xué)合成的方法，則存在工藝流程復(fù)雜、成本高、污染環(huán)境等諸多問題。二十世紀七十年代，日本研究人員對日本黃連(Coptis japonica)進行了大量的誘導(dǎo)愈傷組織和細胞培養(yǎng)工作，已篩選出穩(wěn)定高產(chǎn)的細胞系，用于工業(yè)化生產(chǎn)小檗堿。我國雖已建立了中國黃連的人工擴繁種植體系，并進行相關(guān)的組織培養(yǎng)研究，目前尚未能夠通過細胞培養(yǎng)實現(xiàn)小檗堿的工業(yè)化生產(chǎn)。在當今人類面臨日益嚴重的資源短缺、能源危機、環(huán)境污染情況下，通過大規(guī)模中國黃連細胞的懸浮培養(yǎng)進行小檗堿的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要的開發(fā)應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對目前由中國黃連制備小檗堿所存在的資源與生產(chǎn)技術(shù)問題，提供一種中國黃連懸浮細胞培養(yǎng)生產(chǎn)小檗堿的方法，利用該方法生產(chǎn)小檗堿具有工藝流程簡單，生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)能耗低且無污染，生產(chǎn)過程不受地域、土壤、水質(zhì)、季節(jié)、氣候等自然環(huán)境因素影響等優(yōu)點。本發(fā)明是建立適于中國黃連懸浮細胞培養(yǎng)生產(chǎn)小檗堿的方法包括外植體制備、從外植體誘導(dǎo)愈傷組織、繼代培養(yǎng)愈傷組織、懸浮培養(yǎng)中國黃連細胞、優(yōu)良高產(chǎn)細胞系的篩選、細胞懸浮培養(yǎng)條件的優(yōu)化等步驟。(—)、外植體的制備取中國黃連莖段、葉片、葉柄作為外植體，常規(guī)清洗和消毒
3后，在無菌條件下將莖切成厚0. 2cm薄片，葉片切成0. 5X0. 5cm小塊，葉柄切成0. 5cm小段。( 二)、愈傷組織的誘導(dǎo)選用MS、B5、6，7_V作為黃連愈傷組織誘導(dǎo)的基本培養(yǎng)基，將步驟(一)制備好的外植體接種于基本培養(yǎng)基附加0. 5 3. Omg/L 2,4-D和0. 1 0. 5mg/L KT的固體培養(yǎng)基上，所有培養(yǎng)基的pH均為5. O 6. 0，蔗糖1 8%，瓊脂0. 6 0.7%。培養(yǎng)溫度21 士 1°C，暗培養(yǎng)。(三)繼代培養(yǎng)愈傷組織在步驟(二)所述的培養(yǎng)基上，2 4周進行一次愈傷組織的繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同步驟(二)；(四)、細胞的懸浮培養(yǎng)經(jīng)3 5次繼代后，選取較松散的愈傷組織分散均勻，接種于步驟(二)所述不加瓊脂的液體培養(yǎng)基內(nèi)，置于恒溫振蕩器上進行液體懸浮培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速 100 130轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)溫度23士 1°C。(五)、小檗堿的提取培養(yǎng)細胞收獲后，稱取鮮重與干重，計算產(chǎn)率和生長速率。 精密稱取于60°c下干燥至恒重的樣品粉末，甲醇回流提取，定容過濾后，測定小檗堿含量， 如《中國藥典》2005年版用HPLC方法檢測小檗堿含量。(六)、優(yōu)良高產(chǎn)細胞系的篩選；在步驟(三)所述的中國黃連細胞懸浮培養(yǎng)物中， 獲得游離細胞和細胞聚集體；將細胞聚集體分別經(jīng)由500 μ m、250 μ m和100 μ m網(wǎng)篩的濾過，然后混懸于液體培養(yǎng)基，再與熔化的固體培養(yǎng)基混均，置于平板中進行培養(yǎng)，接種中國黃連細胞的濃度為IO3 5細胞/ml ；挑取細胞克隆再轉(zhuǎn)代進行液體懸浮培養(yǎng)，取其培養(yǎng)物分析小檗堿含量，篩選出單位小檗堿含量高的中國黃連細胞株。(七)、中國黃連細胞懸浮培養(yǎng)條件的優(yōu)化1)碳源培養(yǎng)基中較為適合中國黃連細胞生長且提高小檗堿含量的蔗糖濃度為 1 8% ；2)氮源為促進中國黃連細胞生長和提高小檗堿含量，在基本培養(yǎng)基中補加 0. 1 1. 0g/LNH4N03 ；3)激素配比培養(yǎng)基中既適合中國黃連細胞生長又提高小檗堿含量的激素配比組合分別為 0. 5 3. Omg/L 2,4-D和 0. 1 0. 5mg/L KT、NAA 0. 1 2mg/L和 0. 1 0. 5mg/ L KT0本發(fā)明具有以下有益效果(1)懸浮細胞生長周期短，生長條件易于調(diào)控，可進行標準化與規(guī)?；囵B(yǎng)?？朔酥袊S連生長緩慢、受環(huán)境制約而使得小檗堿的含量和質(zhì)量不穩(wěn)定、人工種植占用耕田和耗費人力資源的缺點；(2)通過優(yōu)良高產(chǎn)細胞系的篩選和細胞懸浮培養(yǎng)中碳源、氮源及激素配比條件的優(yōu)化，進一步提高小檗堿的產(chǎn)量。(3)利用懸浮細胞培養(yǎng)生產(chǎn)小檗堿的方法具有工藝流程簡單，生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)能耗低且無污染，生產(chǎn)過程不受地域、土壤、水質(zhì)、蟲害、季節(jié)、氣候等自然環(huán)境因素影響，易于工業(yè)化生產(chǎn)并且減少提取過程中的雜質(zhì)成分，便于小檗堿的分離純化，生產(chǎn)成本低廉等優(yōu)
點ο具體的實施方式以下實施例僅對本發(fā)明作進一步的說明，但不應(yīng)當也不會限制權(quán)利要求書中所描
4述的本發(fā)明。實施例1 外植體的準備。選用中國黃連的幼葉作外植體，先用70%酒精中浸泡1分鐘，再用2%次氯酸鈉處理10分鐘，然后用無菌水清洗3次。在無菌條件下將葉片切成0. 5X0. 5cm小塊。實施例2 愈傷組織的誘導(dǎo)。將按照實施例1制備的外植體接種在含有1. 5mg/L2，4-D、0. lmg/LKT、蔗糖3%、瓊脂0. 65%的B5培養(yǎng)基上，于21°C的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。四周左右形成愈傷組織。實施例3 繼代培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)在實施例2所述的培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，分別將2，4-D和KT調(diào)整為0. 5mg/L、 0. lmg/L，培養(yǎng)五周繼代一次。實施例4 細胞的懸浮培養(yǎng)。經(jīng)5次繼代后，選取較松散的愈傷組織分散均勻，接種于含有1.5mg/L 2,4-D, 0. lmg/L KT、蔗糖3%的Β5液體培養(yǎng)基內(nèi)，置于恒溫振蕩器上進行懸浮培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速115轉(zhuǎn)/ 分鐘，培養(yǎng)溫度23 °C ；實施例5 小檗堿的提取培養(yǎng)細胞收獲后，稱取鮮重與干重，計算產(chǎn)率和生長速率。精密稱取于60°C下干燥至恒重的樣品粉末，甲醇回流提取，定容過濾后，測定小檗堿含量，如《中國藥典》2005年版用HPLC方法檢測小檗堿含量。實施例6 篩選優(yōu)良高產(chǎn)細胞系。在按照實施例4所制備的懸浮細胞培養(yǎng)物中，獲得游離細胞和細胞聚集體。將細胞聚集體分別經(jīng)500 μ m、250 μ m和100 μ m的網(wǎng)篩濾過，然后混懸于液體培養(yǎng)基，再與熔化的固體培養(yǎng)基混均，置于平板中進行培養(yǎng)，接種細胞濃度為IO4細胞/ml。挑取細胞克隆再轉(zhuǎn)代進行液體懸浮培養(yǎng)，取其培養(yǎng)物分析小檗堿含量，篩選出單位小檗堿含量高的中國黃連細胞株。實施例7 細胞懸浮培養(yǎng)條件的優(yōu)化。既適于中國黃連細胞生長又可提高小檗堿含量的懸浮培養(yǎng)條件是液體培養(yǎng)基中蔗糖濃度為 3. 7%，補加 0. 5g/L NH4NO3,激素為 2. 5mg/L 的 2，4_D 和 0. lmg/L 的 KT。
權(quán)利要求
1.中國黃連懸浮細胞培養(yǎng)生產(chǎn)小檗堿的方法，其特征在于包括以下步驟(1)取中國黃連莖段、葉片、葉柄作為誘導(dǎo)愈傷組織的外植體；(2)常規(guī)清洗和消毒后，在無菌條件下將莖切成厚0.2cm薄片，葉片切成0. 5X0. 5cm小塊，葉柄切成0. 5cm小段；(3)選用MS、B5、6，7-V作為黃連愈傷組織誘導(dǎo)的基本培養(yǎng)基；(4)將步驟(2)所述備好的外植體接種于基本培養(yǎng)基附加0.5 3. Omg/L 2，4_D和 0. 1 0. 5mg/L KT的固體培養(yǎng)基上，所有培養(yǎng)基的pH均為5. 0 6. 0，蔗糖1 8%，瓊脂 0.6 0.7%。培養(yǎng)溫度21 士 1°C，暗培養(yǎng)；(5)在步驟(4)所述的培養(yǎng)基上，2 4周進行一次愈傷組織的繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同步驟⑷；(6)中國黃連細胞的懸浮培養(yǎng)，經(jīng)3 5次繼代后，選取較松散的愈傷組織分散均勻，接種于步驟(4)所述不加瓊脂的液體培養(yǎng)基內(nèi)，置于恒溫振蕩器上進行液體懸浮培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速 100 130轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)溫度23士 1°C ；(7)小檗堿提取培養(yǎng)細胞收獲后，稱取鮮重與干重，計算產(chǎn)率和生長速率。精密稱取于60°C下干燥至恒重的樣品，甲醇回流提取，定容過濾后，測定小檗堿含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，還包括篩選優(yōu)良高產(chǎn)細胞系的步驟；在步驟(6)所述的中國黃連細胞懸浮培養(yǎng)物中，獲得游離細胞和細胞聚集體；將細胞聚集體分別經(jīng)由 500 μ m、250 μ m和100 μ m網(wǎng)篩的濾過，然后混懸于液體培養(yǎng)基，再與熔化的固體培養(yǎng)基混均，置于平板中進行培養(yǎng)，接種中國黃連細胞的濃度為IO3 5細胞/ml ；挑取細胞克隆再轉(zhuǎn)代進行液體懸浮培養(yǎng)，取其培養(yǎng)物分析小檗堿含量，篩選出單位小檗堿含量高的中國黃連細胞株。
3.根據(jù)權(quán)利要求1與2所述的方法，還進一步包括優(yōu)化中國黃連細胞懸浮培養(yǎng)條件的步驟1)碳源從權(quán)利要求1與2步驟中，培養(yǎng)基中較為適合中國黃連細胞生長且提高小檗堿含量的蔗糖濃度為1 8% ；2)氮源從權(quán)利要求1與2步驟中，為促進中國黃連細胞生長和提高小檗堿含量，在基本培養(yǎng)基中補加0. 1 1. 0g/LNH4N03 ；3)激素配比從權(quán)利要求1與2步驟中，培養(yǎng)基中既適合中國黃連細胞生長又提高小檗堿含量的激素配比組合分別為0. 5 3. Omg/L 2,4-D和0. 1 0. 5mg/L KT、NAA 0. 1 2mg/L 禾口 0. 1 0. 5mg/L KT。
全文摘要
本發(fā)明涉及中國黃連懸浮細胞培養(yǎng)生產(chǎn)小檗堿的方法，包括從中國黃連外植體誘導(dǎo)愈傷組織、繼代培養(yǎng)愈傷組織、懸浮培養(yǎng)中國黃連細胞、優(yōu)良高產(chǎn)細胞系的篩選、細胞懸浮培養(yǎng)條件的優(yōu)化、小檗堿的提取等步驟。本發(fā)明具有工藝流程簡單，生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)能耗低且無污染，生產(chǎn)過程不受地域、季節(jié)和氣候等自然環(huán)境因素影響等優(yōu)點。本發(fā)明有助于解決中國黃連資源短缺和保護中國黃連種質(zhì)資源的可持續(xù)生長，并且有利于建立中國黃連懸浮細胞的大規(guī)模工廠化生產(chǎn)，為小檗堿生產(chǎn)提供新的途徑。
文檔編號C12N5/04GK102399217SQ20101027611
公開日2012年4月4日 申請日期2010年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月9日
發(fā)明者宋長征 申請人:宋長征