專利名稱：稚鮑養(yǎng)殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及海水貝類養(yǎng)殖技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種提高稚鮑養(yǎng)殖成活率、節(jié)水節(jié) 能、綠色環(huán)保的養(yǎng)殖方法。
背景技術(shù)：
鮑作為海中八珍之一，歷來備受市場(chǎng)青睞，鮑的肉質(zhì)細(xì)嫩，味道鮮美，含有豐富的 蛋白質(zhì)，歷來是水產(chǎn)養(yǎng)殖的佳品。我國(guó)的鮑養(yǎng)殖研究從20世紀(jì)70年代開始起步，經(jīng)過近 三十年的發(fā)展，取得了巨大的成績(jī)和顯著的經(jīng)濟(jì)效益，但是在養(yǎng)殖模式上始終沒有大的突 破。近年來，隨著稚鮑人工養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，技術(shù)上的缺陷也逐漸凸顯出來，在養(yǎng)殖過程中， 特別是在稚鮑剝離后，容易引發(fā)一些稚鮑疾病，2010年在遼寧、山東等地繼2007年以來再 次爆發(fā)大規(guī)模的流行病，許多養(yǎng)殖場(chǎng)在稚鮑剝離后出現(xiàn)大批量的死亡，有些養(yǎng)殖場(chǎng)死亡率 甚至高達(dá)90%，給養(yǎng)殖戶帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。病原體感染是引起稚鮑死亡的主要原因， 人工養(yǎng)殖環(huán)境下主要是細(xì)菌性疾病和病毒性疾病。常見的潛在致病菌有副溶血弧菌、河流 弧菌、溶藻弧菌等。副溶血弧菌主要導(dǎo)致稚鮑肌肉萎縮病，死亡率可達(dá)50%左右，而河流弧 菌和副溶藻弧菌引發(fā)的感染導(dǎo)致的死亡率高達(dá)60-70%。目前常規(guī)的防治稚鮑掉板的方法主要是定期施用抗生素，抗生素雖然具有藥物直 接入水、濃度高、吸收快、療效好的優(yōu)點(diǎn)，但缺點(diǎn)是可能對(duì)稚鮑產(chǎn)生刺激性、引發(fā)新病癥。如 果長(zhǎng)期大量使用抗生素不僅會(huì)使?jié)撛谥虏【退幘暝黾樱矔?huì)使一些鮑病例變得難以治 愈。此外鮑體內(nèi)抗生素殘留會(huì)影響稚鮑品質(zhì)，不利于銷售，進(jìn)而造成養(yǎng)殖者的經(jīng)濟(jì)損失。中 草藥防治稚鮑掉板也是一種常見的辦法，具有無藥物殘留、經(jīng)濟(jì)效益高的優(yōu)點(diǎn)，但也有見效 慢的缺點(diǎn)，因而尋求一種更高效、經(jīng)濟(jì)的辦法顯得極為迫切。蛭弧菌為寄生性革蘭氏陰性菌，具有寄生、進(jìn)而裂解其它細(xì)菌的作用，是一種優(yōu)良 的微生物控菌液。蛭弧菌蛭質(zhì)體是蛭弧菌在特定宿主細(xì)菌的周質(zhì)空間內(nèi)進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖的形 式；蛭弧菌游泳體是蛭弧菌侵入宿主細(xì)菌前的生長(zhǎng)形式。“綠色養(yǎng)殖”成為近年來國(guó)家的重 大需求，引起水產(chǎn)界的廣泛關(guān)注。目前，用蛭弧菌混合菌液來進(jìn)行稚鮑養(yǎng)殖的養(yǎng)殖方式在國(guó) 內(nèi)外尚未報(bào)道。已有的研究表明，作為一種有益微生物制劑，無論是在食品工業(yè)還是在(海洋) 水產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng)域，蛭弧菌的應(yīng)用均是安全的。例如在國(guó)外，Lenz and Hespell (1978) 研究發(fā)現(xiàn)，蛭弧菌及對(duì)動(dòng)物及人的細(xì)胞不具侵染性[Lenz R. W.，HespellR. B. Attempts to grow bedellovibrios micurgically-inj ected into animal cells.Archives of Microbiology, 1978,119(3) =245-248] 在國(guó)內(nèi)，林茂等(2006)研究了蛭弧菌對(duì)魚類細(xì) 胞的作用，發(fā)現(xiàn)它對(duì)魚類細(xì)菌沒有侵染作用[林茂，楊先樂，薛暉，曹海鵬，邱軍強(qiáng)。蛭弧菌 BDH21 02對(duì)魚類細(xì)胞及病原菌的作用。微生物學(xué)通報(bào)，2006，33(1) :7_11]。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種提高稚鮑免疫力、促進(jìn)稚
3鮑生長(zhǎng)、提高稚鮑成活率的養(yǎng)殖方法。本發(fā)明的目的通過下述方案實(shí)現(xiàn)稚鮑養(yǎng)殖方法，其特征在于，養(yǎng)殖過程如下(1)在養(yǎng)殖池內(nèi)鋪磚，然后注入海水；(2)稚鮑下池，同時(shí)開始曝氣；(3)定期投喂餌料，并在養(yǎng)殖水體中和/或投喂的餌料中添加蛭弧菌游泳體和蛭 質(zhì)體的混合菌液；且每5-30天換水一次，每次全池?fù)Q；(4)當(dāng)稚鮑體長(zhǎng)達(dá)到1. 0-1. 6cm時(shí)，即可采收稚鮑；所述蛭弧菌菌株為蛭弧菌(Bdellovibrio sp. ) BDFM05，由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏 中心保藏，其簡(jiǎn)稱為CCTCC，保藏編號(hào)為CCTCC NO :M209172，保藏日期為2009年8月7日。 BDFM05呈單細(xì)胞，橢圓形，大小為1. 43X0. 53 μ m,端生鞭毛，鞭毛長(zhǎng)度至少2 μ m ；所述蛭弧 菌(Bdellovibrio sp. )BDFM05以雙層平板法于28°C培養(yǎng)三天可形成直徑2 3mm的透明 圓形噬菌斑，將得到的圓形噬菌斑接種后，分別將蛭弧菌蛭質(zhì)體和游泳體分開發(fā)酵，然后等 濃度混合。優(yōu)選地，所述鋪磚是先將磚洗刷干凈并用高錳酸鉀溶液消毒，消毒后再采取騎疊 式擺磚。優(yōu)選地，所述海水在注入前經(jīng)過砂濾和沉淀處理。所投喂的餌料為人工合成餌料，優(yōu)選地，所述投喂餌料時(shí)要先停止曝氣，投餌 0. 5-lh后再開始曝氣。優(yōu)選地，所述稚鮑下池后，曝氣量10-100L/h/m3，光照控制在50-200lux，水溫控制 在 15-28 0C ο優(yōu)選地，所述在投喂的餌料中添加蛭弧菌混合菌液是指用濃度為10-107pfU/mL的 蛭弧菌混合菌液浸泡餌料20 40分鐘。優(yōu)選地，所述在養(yǎng)殖水體中添加的蛭弧菌混合菌液，使蛭弧菌混合菌在水體中的 濃度至少達(dá)到10pfu/mL。優(yōu)選地，所述每次換水后都立即添加蛭弧菌混合菌液，并使蛭弧菌混合菌在水體 中的濃度至少達(dá)到10pfu/mL。優(yōu)選地，所述蛭弧菌混合菌在水體中的濃度為10_107pfu/mL。優(yōu)選地，所述蛭弧菌混合菌液的制備方法為在含副溶血弧菌的DNB液體培養(yǎng)基中接入蛭弧菌BDFM05 (CCTCCM209172)，恒溫?fù)u 床150rpm 300rpm、20 35°C培養(yǎng)24 48h ；培養(yǎng)液于4°C 6000 8000rpm離心15 20min，去除含蛭弧菌游泳體的上清，得到的沉淀即是蛭弧菌蛭質(zhì)體；將含蛭弧菌游泳體的 上清液經(jīng)16000 18000rpm離心15 20min后，得到的沉淀即是蛭弧菌游泳體；將上述得到的蛭弧菌蛭質(zhì)體和游泳體分別用DNB液體培養(yǎng)基進(jìn)行懸浮，得到兩種 菌液，兩種菌液按游泳體和蛭質(zhì)體細(xì)菌數(shù)1 1的比例混合，即得到蛭弧菌混合菌液。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果1、本發(fā)明所述的蛭弧菌混合菌液能顯著提高稚鮑體質(zhì)，增強(qiáng)免疫力。。本發(fā)明中所述的蛭弧菌混合菌液在控制稚鮑養(yǎng)殖環(huán)境、餌料、水體中細(xì)菌的效果 顯著，能夠明顯改善稚鮑體質(zhì)，增強(qiáng)免疫力。
2、本發(fā)明所述的蛭弧菌混合菌液在控制和消除稚鮑潛在致病菌應(yīng)用中安全性好。蛭弧菌混合菌液通過裂解潛在致病菌的方法是生物方法。用蛭弧菌游泳體和蛭質(zhì) 體制成的混合菌液作為控制稚鮑育稚鮑水體細(xì)菌的蛭弧菌混合菌液，兼具游泳體起效快， 活力強(qiáng)和蛭質(zhì)體制備、保存容易，殺菌時(shí)間久、環(huán)境耐受力強(qiáng)的雙重優(yōu)點(diǎn)。這些優(yōu)點(diǎn)使得蛭 弧菌混合菌液非常適合作為抑止或清除生物體及其環(huán)境中潛在致病菌的生物凈化因子，且 其在裂解完宿主細(xì)菌后，會(huì)因饑餓而自動(dòng)消亡，從而克服了抗生素濫用帶來的副作用和常 規(guī)消毒劑對(duì)稚鮑的不利影響，同時(shí)已有研究證明蛭弧菌對(duì)人等無毒。3、所述的蛭弧菌混合菌液能凈化水質(zhì)并促進(jìn)稚鮑生長(zhǎng)。 蛭弧菌混合菌液對(duì)水質(zhì)有凈化作用，能改善養(yǎng)殖生物腸道環(huán)境，增強(qiáng)食欲，促進(jìn)生長(zhǎng)。4、含有本發(fā)明所述的蛭弧菌混合菌液適合推廣應(yīng)用于鮑魚養(yǎng)殖過程。蛭弧菌混合菌液對(duì)人和鮑魚無毒副作用，適合于鮑魚大規(guī)模工廠化養(yǎng)殖，可以為 鮑魚的綠色加工生產(chǎn)提供保障并且為控制和消除鮑魚潛在致病菌提供了一種新方法。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步具體詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此，對(duì)于未特別注明的工藝參數(shù)，可參照常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。本發(fā)明的實(shí)施地位于山東某養(yǎng)殖 場(chǎng)，本發(fā)明的稚鮑為皺紋盤鮑，由該養(yǎng)殖場(chǎng)提供。實(shí)施例1蛭弧菌混合菌液的制備蛭弧菌蛭質(zhì)體的制備所述蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDFM05以雙層平板法于 28°C培養(yǎng)三天可形成直徑2 3mm的透明圓形噬菌斑，所用的蛭弧菌混合菌液通過以下方 法發(fā)酵在裝有IOOmL營(yíng)養(yǎng)肉湯Nutrient Broth (蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化鈉5g，pH 7. 4士0.2)的錐形瓶中接種 0. 5mL 107cfu/mL副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus，購(gòu)于 美國(guó)典型微生物菌種保藏中心American Type Culture Collection，編號(hào)ATCC 17802)， 200rpm、28°C搖床培養(yǎng)18小時(shí)，培養(yǎng)液于4°C、5000rpm離心15min，棄上清。沉淀用5mL生 理鹽水懸浮后，加入到一個(gè)裝有IOOmL DNB (dilute nutrient broth)液體培養(yǎng)基(營(yíng)養(yǎng)肉 湯0. 8g，酪蛋白酸水解物0. 5g，酵母精提物0. lg，海水晶28g，溶于IOOOmL蒸餾水，pH值為 7. 2 7. 6)的錐形瓶中，再加入ImL含103pfu/mL的蛭弧菌BDFM05 (CCTCC M209172)。恒溫 搖床250rpm、28°C培養(yǎng)36h。培養(yǎng)液于4°C 6000rpm離心20min，得到上清液和沉淀，保留沉 淀，加入IOmLDNB液體培養(yǎng)基(營(yíng)養(yǎng)肉湯0. 8g，酪蛋白酸水解物0. 5g，酵母精提物0. lg，海 水晶28g，溶于IOOOmL蒸餾水中，pH值為7. 2 7. 6)重新懸浮沉淀物，得到濃度為109pfu/ mL的蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液。蛭弧菌游泳體的制備將上述蛭弧菌蛭質(zhì)體制備方法中的上清液于4°C 6000rpm 離心20min后的、含蛭弧菌游泳體上清液，16000rpm離心20min，得到的沉淀即是蛭弧菌游 泳體。加入IOmL DNB液體培養(yǎng)基(營(yíng)養(yǎng)肉湯0. 8g，酪蛋白酸水解物0. 5g，酵母精提物0. Ig, 溶于IOOOmL蒸餾水中，pH值為7. 2 7. 6)懸浮蛭弧菌游泳體，得到濃度為109pfu/mL蛭弧 菌游泳體菌液。將同濃度的游泳體和蛭質(zhì)體按1 1體積混合，得到109pfU/mL的蛭弧菌混合菌液。 實(shí)施例2 1、蛭弧菌混合菌液在養(yǎng)殖中應(yīng)用。本發(fā)明實(shí)施地的養(yǎng)殖池建在養(yǎng)殖大棚內(nèi)，每個(gè)水池規(guī)格為2X2X0. 75m，水深為 0.45m。每池放置曝氣管8條。水池上方蓋上遮光度為60%的遮光布，避免光照過強(qiáng)。光照 強(qiáng)弱可以調(diào)節(jié)，光照強(qiáng)度一般控制在(50-200) Iux0實(shí)施地海域的具體水質(zhì)條件為水溫15_28°C，鹽度27-33%。，pH 6. 8-7. 2，海水經(jīng) 過砂濾、沉淀處理，并在進(jìn)入養(yǎng)殖池前，在池進(jìn)水管口包扎一個(gè)200目的網(wǎng)袋，防止細(xì)砂入 池。水源水質(zhì)符合中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)(GB11607-89)要求，符合農(nóng)業(yè)部 《無公害食品海水養(yǎng)殖用水水質(zhì)》(NY5052-2001)要求。鋪磚前，將四角水泥方磚洗刷干凈并用高錳酸鉀溶液消毒，消毒后再放入池底，池 底共放60塊四腳水泥磚，兩側(cè)對(duì)稱、騎疊式放置，每列6塊，每側(cè)5列。放磚后各池均用高 錳酸鉀溶液消毒，反復(fù)沖洗干凈，然后注入經(jīng)過砂濾和沉淀處理的海水。稚鮑下池，所選取 的附稚鮑波紋板附稚鮑量在30-2000粒/板，稚鮑體長(zhǎng)在2. 0-4. 5mm，稚鮑健康、活力好，每 池稚鮑剝離量為10000粒，投鮑后即開始曝氣，曝氣量為50L/h/m3，本發(fā)明設(shè)置一個(gè)生產(chǎn)對(duì) 照組_正常流水，日換水量為池水量的2倍，每天早上6:00用高壓水沖洗池子，晚上18:00 正常投餌，期間不加蛭弧菌混合菌液，完全的工廠養(yǎng)殖方式，將其編為A組。其他具體編排 方案如下(1)在養(yǎng)殖水體中蛭弧菌混合菌液，但餌料中不加。每次換水后立即在養(yǎng)殖水體中添加蛭弧菌混合制劑，所需48個(gè)水池分為B-1、 B-2、B-3、B-4, C-I、C_2、C_3、C_4，D_l、D_2、D_3、D_4，E_l、E_2、E_3、E—4，F(xiàn)_l、F_2、F—3、 F-4，G-l、G-2、G-3、G-4，每組2個(gè)重復(fù)。各組的換水周期及加菌液濃度如下B 組(B-1、B-2、B_3、B-4) 5 天換(全池)水一次；C 組(C-l、C-2、C-3、C-4) 10 天換(全池)一次；D 組(D-l、D-2、D_3、D-4) 15 天換(全池)一次水E 組(E-l、E-2、E_3、E-4) 20 天換(全池)一次水F 組(F-l、F-2、F_3、F-4) 25 天換(全池)一次水G 組(G-l、G-2、G_3、G-4) 30 天換(全池)水一次B-I、C-I、D-I、E-I、F-I、G-I組每次換水后立即往水池中潑灑蛭弧菌混合制劑，使 水體中蛭弧菌混合制劑菌體濃度達(dá)到IO1PfuAiL ；B-2、C-2、D-2、E-2、F-2、G-2組每次換水后立即往水池中潑灑蛭弧菌混合制劑，使 水體中蛭弧菌混合制劑菌體濃度達(dá)到103pfU/mL ；B-3、C-3、D-3、E_3、F_3、G_3組為每次換水后立即往水池中潑灑蛭弧菌混合制劑， 使水體中蛭弧菌混合制劑菌體濃度達(dá)到105pfU/mL ；B-4、C-4、D-4，E_4、F_4、G_4組為每次換水后立即往水池中潑灑蛭弧菌混合制劑， 使水體中蛭弧菌混合制劑菌體濃度達(dá)到107pfu/mL。(2)在餌料中加蛭弧菌混合菌液，但在養(yǎng)殖水體中不加。每天投餌前用蛭弧菌混合菌液浸泡餌料半小時(shí)，而每次換水后養(yǎng)殖水體都不加蛭 弧菌混合菌液。所需 48 個(gè)水池分為 b-1、b-2、b-3、b-4 ；c-l、c-2、c-3、c-4 ；d_l、d_2、d_3、d-4 ;e-l、e-2、e-3、e-4 ；f_l、f_2、f_3、f_4 ；g_l、g_2、g_3、g_4 每組 2 個(gè)重復(fù)。各組的換水 周期及加菌液濃度如下b 組(b-1、b-2、b-3、b-4) 5 天換(全池)水一次；c 組(c-1、c-2、c-3、c_4) 10 天換(全池)水一次；d 組(d-1、d-2、d-3、d-4) 15 天換(全池)水一次；e 組(e-1、e-2、e_3、e_4) 20 天換(全池)水一次；f 組(f-1、f-2、f-3、f-4) 25 天換(全池)水一次；g 組(g-1、g_2、g_3、g-4) 30 天換(全池)水一次；b-1、c-1、d-1、e-1、f-1、g-Ι組投的餌料經(jīng)過濃度為IO1PfuAiL的蛭弧菌混合制劑 菌液浸泡過的餌料；每次換水不在水體加蛭弧菌混合制劑。b-2、c-2、d-2、e-2、f-2、g-2組投的餌料經(jīng)過濃度為103pfu/mL的蛭弧菌混合制劑 菌液浸泡過的餌料；每次換水不在水體加蛭弧菌混合制劑。b-3、c-3、d-3、e-3、f-3、g-3組投的餌料經(jīng)過濃度為105pfu/mL的蛭弧菌混合制劑 菌液浸泡過的餌料；每次換水不在水體加蛭弧菌混合制劑。b-4、c-4、d-4、e-4、f-4、g-4組投的餌料經(jīng)過濃度為107pfu/mL的蛭弧菌混合制劑 菌液浸泡過的餌料；每次換水不在水體加蛭弧菌混合制劑。(3)在養(yǎng)殖水體和餌料中均添加蛭弧菌混合制劑每次投餌前用蛭弧菌混合制劑浸泡餌料半小時(shí)，每次換水后養(yǎng)殖水體也添加蛭弧 菌混合制劑。所需 48 個(gè)水池分為 Bb-I、Bb-2、Bb_3、Bb_4 ；Cc-U Cc_2、Cc_3、Cc_4 ；Dd-U Dd-2、Dd-3、Dd-4 ；Ee_l、Ee_2、Ee_3、Ee_4 ；Ff_l、Ff_2、Ff_3、Ff_4 ；Gg_l、Gg_2、Gg_3、Gg_4 每組2個(gè)重復(fù)。各組的換水周期及加菌液濃度如下Bb 組(Bb-1、Bb-2、Bb_3、Bb_4) 5 天換(全池)水一次；Cc 組(Cc-1、Cc-2、Cc_3、Cc_4) 10 天換(全池)水一次；Dd 組(Dd-1、Dd-2、Dd_3、Dd_4) 15 天換(全池)水一次；Ee 組(Ee-1、Ee_2、Ee_3、Ee_4) 20 天換(全池)水一次；Ff 組(Ff-U Ff-2, Ff_3、Ff-4) 25 天換(全池)水一次；Gg 組(Gg-1、Gg-2、Gg_3、Gg-4) 30 天換(全池)水一次；Bb-O、Cc-O、Dd-O、Ee_0、Ff-O、Gg-O組每次換水后，不添加混合制劑；Bb-U Cc-U Dd-1、Ee-U Ff-I、Gg-I組為每次換水后立即往水池中潑灑蛭弧菌 混合制劑，使水體中蛭弧菌混合制劑菌體濃度達(dá)到IO1PfuAiL ；每次投餌的餌料用濃度為 IO1PfuAiL的蛭弧菌混合制劑浸泡半小時(shí)；Bb-2、Cc-2、Dd-2, Ee_2、Ff_2、Gg-2組為每次換水后立即往水池中潑灑蛭弧菌 混合制劑，使水體中蛭弧菌混合制劑菌體濃度達(dá)到103pfU/mL ；每次投餌的餌料用濃度為 103pfu/mL的蛭弧菌混合制劑浸泡半小時(shí)。Bb-3、Cc-3、Dd-3、Ee_3、Ff_3、Gg-3組為每次換水后立即往水池中潑灑蛭弧菌 混合制劑，使水體中蛭弧菌混合制劑菌體濃度達(dá)到105pfU/mL ；每次投餌的餌料用濃度為 105pfu/mL的蛭弧菌混合制劑浸泡半小時(shí)。Bb-4、Cc-4、Dd-4、Ee_4、Ff-4, Gg-4組為每次換水后立即往水池中潑灑蛭弧菌 混合制劑，使水體中蛭弧菌混合制劑菌體濃度達(dá)到107pfU/mL ；每次投餌的餌料用濃度為
7107pfu/mL的蛭弧菌混合制劑浸泡半小時(shí)。本發(fā)明的各組池中，所投喂的餌料為人工合成餌料，餌料量隨稚鮑大小而變化，當(dāng) 要投喂餌料時(shí)，要先停止曝氣，投餌0. 5h后再開始曝氣。為了減少殘餌對(duì)水質(zhì)的破壞，需要 每天對(duì)除A組外各組池底和四角方磚上的殘餌進(jìn)行虹吸，也可間隔5天對(duì)殘餌進(jìn)行虹吸。除 此之外，每晚需要觀察稚鮑活動(dòng)情況，吃食狀況等。從下板到統(tǒng)計(jì)，時(shí)間為60天，為了了解蛭弧菌混合菌液對(duì)稚鮑的成活率的影響與 促生長(zhǎng)能力，需要對(duì)活稚鮑進(jìn)行計(jì)數(shù)，并按一定指標(biāo)統(tǒng)計(jì)稚鮑。(4)養(yǎng)殖指標(biāo)與測(cè)量①稚鮑初始量，每池1萬稚鮑。②收稚鮑平均殼長(zhǎng)，隨機(jī)抽取50粒稚鮑，測(cè)量殼長(zhǎng)，取平均值。③稚鮑平均重量，隨機(jī)抽取50粒稚鮑，稱其總重后取平均④收稚鮑總量，稱取IOg稚鮑，計(jì)算其粒數(shù)，將稚鮑稱總重估算粒數(shù)。⑤成活率，某階段結(jié)束時(shí)稚鮑量占該階段投稚鮑量的百分率。(5)稚鮑免疫指標(biāo)測(cè)定試驗(yàn)結(jié)束每組取樣18個(gè)去殼，3個(gè)/管放于6個(gè)分別盛有l(wèi)mLHank’ s緩沖液(pH 值7-8)的2mL-Eppendorf管中，貯于-80°C以備抗免疫指標(biāo)的測(cè)定。測(cè)定時(shí)取出樣品，使其 在冰上融化。進(jìn)行勻漿，然后6000r/min，-4°C離心5min.取上清用于免疫指標(biāo)的測(cè)定。①酚氧化物酶的測(cè)定酚氧化物酶的活性測(cè)定是通過測(cè)定和左旋多巴胺反應(yīng)生成的多巴胺的吸光值來 計(jì)算的。把每個(gè)樣品100 μ L到1. 5mL的Eppendorf管中，每個(gè)樣品重復(fù)三次。再加入用 PBS液配制的0. 5mg/mL均海藻酸鈉在26-27°C下反應(yīng)30min。加入50 μ L的用PBS液配制 的3mg/mL的左旋多巴胺，IOmin后，在490nm處讀取吸光值。對(duì)照液用相應(yīng)的PBS液代替海
藻酸鈉。②溶菌酶活力測(cè)定以溶壁微球菌凍干粉為底物。用0. lmol/L,pH = 6.4的磷酸鹽緩沖液配成底物懸 液(OD57tlnm 0. 3)，取3. OmL該懸液于試管內(nèi)置冰浴中，再加入50 μ L待測(cè)血清，混合，測(cè)Atl 值。然后將試液移入37°C溫浴中置30min，取出后再置于冰浴中l(wèi)Omin，以終止反應(yīng)，測(cè)其A 值。溶菌活力Ul按(A。-A) /A式計(jì)算。③感染實(shí)驗(yàn)感染試驗(yàn)于預(yù)先消毒的盛有15L砂濾海水(鹽度29 30%。)的透明水族箱中進(jìn)
行，從A，B-U B-2.....Gg-4各個(gè)組隨機(jī)取稚鮑200顆，設(shè)兩個(gè)重復(fù)。向各組水體中添加副
溶血弧菌液，使水體中副溶血弧菌菌體濃度達(dá)到108cfu/mL。實(shí)驗(yàn)期間不流水養(yǎng)殖，正常投 餌，以5L/h/m3連續(xù)曝氣，水溫為22°C，pH控制在7. 2。人工感染后，連續(xù)觀察5天，最終計(jì) 算成活率，采用相對(duì)存活率(Relative Percentage Survival, RPS)計(jì)算式RPS (% ) = (1-免疫組死亡率/對(duì)照組死亡率)X 100%此種方法對(duì)稚鮑養(yǎng)殖的各項(xiàng)指標(biāo)影響具體見下表表15天換水對(duì)稚鮑生長(zhǎng)情況和免疫力的影響
表210天換水對(duì)稚Ι ■生長(zhǎng)情況和免疫力的影響
權(quán)利要求
稚鮑養(yǎng)殖方法，其特征在于，養(yǎng)殖過程如下(1)在養(yǎng)殖池內(nèi)鋪磚，然后注入海水；(2)稚鮑下池，同時(shí)開始曝氣；(3)定期投喂餌料，并在養(yǎng)殖水體中和/或投喂的餌料中添加蛭弧菌游泳體和蛭質(zhì)體的混合菌液；且每5 30天換水一次，每次全池?fù)Q水；(4)當(dāng)稚鮑體長(zhǎng)到1.0 1.6cm時(shí)，即可采收稚鮑；所述蛭弧菌菌株為蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDFM05，由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，其簡(jiǎn)稱為CCTCC，保藏編號(hào)為CCTCC NOM209172，保藏日期為2009年8月7日。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的養(yǎng)殖方法，其特征在于，所述鋪磚是先將磚洗刷干凈并用高 錳酸鉀溶液消毒，消毒后再采取騎疊式擺磚。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的養(yǎng)殖方法，其特征在于，所述海水在注入前經(jīng)過砂濾和沉淀 處理。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的養(yǎng)殖方法，其特征在于，所述投喂餌料時(shí)要先停止曝氣，投餌 0. 5-lh后再開始曝氣。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的養(yǎng)殖方法，其特征在于，所述稚鮑下池后，曝氣量控制在 10-100L/h/m3，光照控制在 50-2001ux，水溫控制在 15_28°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的養(yǎng)殖方法，其特征在于，所述在投喂的餌料中添加蛭弧菌混 合菌液是指用濃度為10-107pfu/mL的蛭弧菌混合菌液浸泡餌料20 40分鐘。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的養(yǎng)殖方法，其特征在于，所述在養(yǎng)殖水體中添加的蛭弧菌混 合菌液，使蛭弧菌混合菌在水體中的濃度至少達(dá)到10pfU/mL。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的養(yǎng)殖方法，其特征在于，所述每次換水后都立即添加蛭弧菌 混合菌液，并使蛭弧菌混合菌在水體中的濃度至少達(dá)到10pfU/mL。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的養(yǎng)殖方法，其特征在于，所述蛭弧菌混合菌在水體中的濃 度為 10-107pfu/mL。
10.根據(jù)權(quán)利要求1 8任意一項(xiàng)所述的養(yǎng)殖方法，其特征在于，所述蛭弧菌混合菌液 的制備方法為在含副溶血弧菌的DNB液體培養(yǎng)基中接入蛭弧菌BDFM05，恒溫?fù)u床150rpm 300rpm、 20 35°C培養(yǎng)24 48h ；培養(yǎng)液于4°C 6000 8000rpm離心15 20min，去除含蛭弧 菌游泳體的上清，得到的沉淀即是蛭弧菌蛭質(zhì)體；將含蛭弧菌游泳體的上清液經(jīng)16000 18000rpm離心15 20min后，得到的沉淀即是蛭弧菌游泳體；將上述得到的蛭弧菌蛭質(zhì)體和游泳體分別用DNB液體培養(yǎng)基進(jìn)行懸浮，得到兩種菌 液，兩種菌液按游泳體和蛭質(zhì)體細(xì)菌數(shù)1 1的比例混合，即得到蛭弧菌混合菌液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種稚鮑養(yǎng)殖方法，養(yǎng)殖過程如下(1)在養(yǎng)殖池內(nèi)鋪磚，然后注入海水；(2)稚鮑下池，同時(shí)開始曝氣；(3)定期投喂餌料，并在養(yǎng)殖水體中和/或投喂的餌料中添加蛭弧菌混合菌液；且每5-30天換水一次，每次換水量為一個(gè)量程；(4)當(dāng)稚鮑體長(zhǎng)達(dá)到1.0-1.6cm時(shí)，即可收稚鮑；所述蛭弧菌菌株為蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDFM05，由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號(hào)為CCTCC NOM209172，保藏日期為2009年8月7日。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)有(1)能節(jié)能減排，更環(huán)保；(2)蛭弧菌混合菌液起效快、活力強(qiáng)且制備方便、殺菌時(shí)間久；(3)能夠明顯改善稚鮑體質(zhì)，增強(qiáng)免疫力。
文檔編號(hào)C12R1/01GK101953315SQ20101027083
公開日2011年1月26日 申請(qǐng)日期2010年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月31日
發(fā)明者蔣小平, 蔡俊鵬 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)