專利名稱：一種鴨疫里默氏桿菌疫苗生產(chǎn)用培養(yǎng)基及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鴨疫里默氏桿菌疫苗生產(chǎn)用培養(yǎng)基及其制備方法。
背景技術(shù)：
鴨傳染性漿膜炎是發(fā)生于家鴨、鵝、火雞和多種禽類(lèi)的一種接觸性傳染病，又稱鴨 疫里默氏桿菌病、鴨疫巴氏桿菌病、鴨敗血癥、鴨疫綜合癥、鴨疫敗血癥和新鴨病，其病原為 鴨疫里默氏桿菌(Riemerella anatipestifer, RA)。該病呈急性敗血癥或慢性感染，臨床 上主要表現(xiàn)為咳嗽、喘氣、下痢、眼鼻分泌物增多、共濟(jì)失調(diào)和頭頸震顫，少數(shù)慢性病例出現(xiàn) 頭頸歪斜等癥狀；典型病變?yōu)槔w維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、腦膜炎和干酪性輸卵管炎。 該病一年四季均可發(fā)生，以冬季發(fā)病嚴(yán)重，主要經(jīng)污染的飼料、飲水、飛沫等傳播；1-8周齡 的鴨高度敏感，尤以2-3周齡的雛鴨發(fā)病率較高，可達(dá)90% ；死亡率受多種因素的影響，差 別較大，常為10-20%，但也有的高達(dá)60-75%。應(yīng)激因素如飼養(yǎng)密度過(guò)大、通風(fēng)不暢、衛(wèi)生 條件差、氣候突變等，可誘發(fā)該病的發(fā)生，死亡率大大提高；耐過(guò)鴨可表現(xiàn)神經(jīng)癥狀，生長(zhǎng)發(fā) 育緩慢、消瘦，飼料報(bào)酬下降，嚴(yán)重影響生產(chǎn)成績(jī)，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。鴨傳染性漿膜炎是目前對(duì)世界各國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)造成危害最為嚴(yán)重的傳染病之一，在世 界范圍內(nèi)分布，幾乎在所有采用集約化養(yǎng)鴨生產(chǎn)的國(guó)家都有發(fā)現(xiàn)，給世界養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨 大的經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)是一個(gè)養(yǎng)鴨大國(guó)，養(yǎng)鴨業(yè)在我國(guó)的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)中占有著重要的地位，也是 人們生活所需肉蛋的重要來(lái)源之一，鴨傳染性漿膜炎在我國(guó)各養(yǎng)鴨地區(qū)的流行較嚴(yán)重，是 我國(guó)養(yǎng)鴨場(chǎng)(特別是商品鴨場(chǎng))最難于對(duì)付、造成養(yǎng)鴨業(yè)經(jīng)濟(jì)損失的最主要傳染病之一，加 之RA的耐藥性逐漸增強(qiáng)，給我國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。由于鴨傳染性漿膜炎給養(yǎng)鴨業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，有關(guān)其免疫預(yù)防研究引起了 越來(lái)越多的關(guān)注。盡管RA血清型較多，各型之間基本無(wú)交叉保護(hù)作用，給疫苗的研制帶來(lái) 了較大的困難，但因疫苗接種是預(yù)防鴨疫里默氏菌的有效措施，因此RA疫苗的研究引起了 獸用生物制品領(lǐng)域科研人員的廣泛關(guān)注，目前研究報(bào)道的RA疫苗主要有RA滅活疫苗(只 有一種血清型的單價(jià)滅活疫苗、含多種血清型的多價(jià)滅活疫苗)、RA和E. coli 二聯(lián)滅活疫 苗、RA弱毒活疫苗、提取獲得RA亞單位成分的亞單位疫苗。但目前國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有政府批準(zhǔn) 生產(chǎn)使用鴨疫里默氏菌疫苗，多是自家場(chǎng)疫苗(即自己小量生產(chǎn)，自己使用)。不管生產(chǎn)鴨疫里默氏菌疫苗的何種類(lèi)型的疫苗，其基礎(chǔ)均涉及鴨疫里默氏菌的培 養(yǎng)，但鴨疫里默氏菌的培養(yǎng)條件要求極高，在普通的細(xì)菌培養(yǎng)配方或基質(zhì)上難以生長(zhǎng)，目前 鴨疫里默氏菌培養(yǎng)過(guò)程中所涉及的培養(yǎng)基質(zhì)主要有以下幾類(lèi)第一類(lèi)是商品化專用培養(yǎng) 基，如胰酶大豆肉湯、腦心肉湯等，這類(lèi)培養(yǎng)基價(jià)格較高；第二類(lèi)是在普通培養(yǎng)基中加入較 高比例的動(dòng)物血或血清(如10%犢牛血清或脫纖羊血的營(yíng)養(yǎng)肉湯)；第三類(lèi)是用動(dòng)物或活 胚進(jìn)行培養(yǎng)。上述三類(lèi)培養(yǎng)基質(zhì)中，動(dòng)物或活胚培養(yǎng)較繁瑣、工作量大，且不能用于工廠化 的大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)；第一類(lèi)商品化專用培養(yǎng)基和第二類(lèi)在普通培養(yǎng)基中加入較高比例動(dòng)物 血或血清的方法成本高且目前未有用于工廠化大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)的效果報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種鴨疫里默氏桿菌疫苗生產(chǎn)用的培養(yǎng)基(命名為N_J 合成培養(yǎng)基)，可用于鴨疫里默氏桿菌大規(guī)模發(fā)酵，并可降低鴨疫里默氏菌疫苗的生產(chǎn)中鴨 疫里默氏菌的大規(guī)模發(fā)酵這一生產(chǎn)環(huán)節(jié)的成本。本發(fā)明的鴨疫里默氏桿菌疫苗生產(chǎn)專用培養(yǎng)基(N-J合成培養(yǎng)基)極其適合鴨疫 里默氏桿菌大規(guī)模發(fā)酵，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分及配比、添加物及其預(yù)處理方法與比例、培養(yǎng) 基的制備程序。一種鴨疫里默氏桿菌疫苗生產(chǎn)用培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加物，所述基礎(chǔ)培 養(yǎng)基的組分及比例為胰蛋白胨，1. 5-1. 9%;酵母提取物，0. 2-0. 7%;牛肉浸膏，0. 2-0. 7%； 水解乳蛋白，0. 2-0. 7% ；葡萄糖，0. 1-0. 4% ；NaCl,0. 5% ；磷酸二氫鉀，0. 1-0. 7% ；磷酸氫 二鉀，0. 1-0. 7% ；Na2HPO4 · 12Η20，0· 5-0. 9% ； (NH4)2SO4jO. 1-0. 2% ；NH4Cl,0. 01-0. 03% ；其 中所述各組分的百分比為重量/體積百分比；所述添加物為采用頸靜脈采血或頸動(dòng)脈放血 的方法無(wú)菌采取非疫區(qū)健壯牛血并無(wú)菌脫纖，于-20°C和室溫凍融，反復(fù)凍融3次后，保存 于-20°C備用或采血并無(wú)菌脫纖后直接保存于-20°C，使用前取出反復(fù)凍融3次。所述的鴨疫里默氏桿菌疫苗生產(chǎn)用培養(yǎng)基，所述添加物的用量為裂解血球全血 按體積比0. 8-1. 5%加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。一種鴨疫里默氏桿菌疫苗生產(chǎn)用培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟，首先根據(jù)權(quán) 利要求1所述配比稱取所需基礎(chǔ)培養(yǎng)基組分后121°C滅菌15分鐘，待滅菌成分冷卻至低于 40_50°C時(shí)將所述添加物加入所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，搖勻后即得成品培養(yǎng)基。所述的鴨疫里默氏桿菌疫苗生產(chǎn)用培養(yǎng)基的制備方法，所述添加物的用量為按 體積比0. 8-1. 5%加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。例如配置IOOml基礎(chǔ)培養(yǎng)基的具體配方為胰蛋白胨，1. Sg ；酵母提取物，0. 4g ； 牛肉浸膏，0. 4g ；水解乳蛋白，0. 4g ；葡萄糖，0. 2g ；NaCl,0. 5g ；磷酸二氫鉀，0. 2g ；磷酸氫二 鉀，0. 2g ；Na2HPO4 · 12H20，0. 5g ； (NH4)2S04,0. Ig ；NH4Cl,0. Olg ；水，加至 IOOmL ；將上述各組 分121°C滅菌15分鐘，待滅菌成分冷卻至低于50°C時(shí)，然后向上述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入添加 物裂解血球全血Iml ；搖勻后即得成品N-J合成培養(yǎng)基。由于本發(fā)明的鴨疫里默氏桿菌培養(yǎng)基采用多種成分的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和裂解血球預(yù) 處理的全血作為添加物，可以用于鴨疫里默氏桿菌大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)鴨疫里默氏桿菌疫苗， 同時(shí)可降低培養(yǎng)基成本、克服用活體動(dòng)物或胚胎培養(yǎng)操作復(fù)雜和人工成本高等問(wèn)題，在鴨 疫里默氏桿菌的培養(yǎng)、大規(guī)模發(fā)酵及生產(chǎn)鴨疫里默氏桿菌疫苗中具有極大的優(yōu)勢(shì)或不可替 代的作用。一、降低成本。由于基礎(chǔ)培養(yǎng)基的成分是價(jià)格低的常規(guī)試劑，而添加物裂解血球全 血經(jīng)過(guò)預(yù)處理，血球所包含的營(yíng)養(yǎng)物充分的釋放，加入血的比例大大降低，所以成本比商品 化專用培養(yǎng)基(胰酶大豆肉湯、腦心肉湯等)和加入10%犢牛血清或脫纖羊血的營(yíng)養(yǎng)肉湯 培養(yǎng)基的成本大大降低。二、增加了營(yíng)養(yǎng)，縮短了培養(yǎng)時(shí)間。由于對(duì)添加的血球進(jìn)行多次裂解的預(yù)處理，血 球裂解后，營(yíng)養(yǎng)成分完全釋放到培養(yǎng)基中，一方面大大增加了營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)使細(xì)菌盡快接觸和 利用到所需的必須營(yíng)養(yǎng)物，因此縮短了培養(yǎng)時(shí)間。三、克服用活體動(dòng)物或胚胎培養(yǎng)操作復(fù)雜和人工成本高的不足。用活體動(dòng)物或胚
4胎培養(yǎng)需要對(duì)一個(gè)一個(gè)的體動(dòng)物或胚胎進(jìn)行接種，收獲菌體時(shí)也是對(duì)一個(gè)一個(gè)的體動(dòng)物或 胚胎進(jìn)行收集，因此操作復(fù)雜，花費(fèi)大量的人力，人工成本高。而采用本培養(yǎng)基可用于鴨疫 里默氏桿菌大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)鴨疫里默氏桿菌菌體，操作簡(jiǎn)便，省時(shí)省力，人工成本低。四、可以用于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)鴨疫里默氏桿菌疫苗。目前的各種培養(yǎng)基質(zhì)都是在 實(shí)驗(yàn)室研究或小規(guī)模生產(chǎn)條件下，未有采用發(fā)酵罐用于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)鴨疫里默氏桿菌疫 苗的實(shí)例，而本發(fā)明可以用于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)鴨疫里默氏桿菌疫苗。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例10.8%裂解血球全血N-J合成培養(yǎng)基制備配置IOOml的0. 8%裂解血球全血N-J合成培養(yǎng)基胰蛋白胨1. 5g ；酵母提取物 0. 4g ；牛肉浸膏0. 5g ；水解乳蛋白0. 6g ；葡萄糖0. 2g ；NaCl 0. 5g ；磷酸二氫鉀0. 18g ； 磷酸氫二鉀0. 18g ；Na2HPO4 · 12H20 0. 7g ； (NH4)2SO4 0. 12g ；NH4Cl 0. 02g ；水加至 IOOmL ； 將上述各組分121°C滅菌15分鐘，待滅菌成分冷卻至低于50°C時(shí)，然后向上述基礎(chǔ)培養(yǎng)基 中加入添加物裂解血球全血0. 8ml ；搖勻后即得成品N-J合成培養(yǎng)基。所述添加物裂解血球全血為采用頸靜脈采血或頸動(dòng)脈放血的方法無(wú)菌采取非疫 區(qū)健壯牛血并無(wú)菌脫纖，于-20°C和室溫凍融，反復(fù)凍融3次后，保存于-20°C備用或采血并 無(wú)菌脫纖后直接保存于-20°C，使用前取出反復(fù)凍融3次制得。實(shí)施例21 %裂解血球全血N-J合成培養(yǎng)基制備配置IOOml的裂解血球全血N-J合成培養(yǎng)基胰蛋白胨1. 9g ；酵母提取物 0. 7g;牛肉浸膏0. 7g;水解乳蛋白0. 7g;葡萄糖0. 4g ；NaCl 0. 5g ；磷酸二氫鉀0. 3g ； 磷酸氫二鉀0. 3g ；Na2HPO4 · 12H20 0. 9g ； (NH4)2SO4 0. 2g ；NH4Cl 0. 03g ；水加至 IOOmL ；將 上述各組分121°C滅菌15分鐘，待滅菌成分冷卻至低于40°C時(shí)，然后向上述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中 加入添加物裂解血球全血Iml ；搖勻后即得成品N-J合成培養(yǎng)基。所述添加物裂解血球全血為采用頸靜脈采血或頸動(dòng)脈放血的方法無(wú)菌采取非疫 區(qū)健壯牛血并無(wú)菌脫纖，于-20°C和室溫凍融，反復(fù)凍融3次后，保存于-20°C備用或采血并 無(wú)菌脫纖后直接保存于-20°C，使用前取出反復(fù)凍融3次制得。實(shí)施例3驗(yàn)證試驗(yàn)1試驗(yàn)?zāi)康暮Y選出鴨傳染性漿膜炎滅活疫苗發(fā)酵用的最優(yōu)培養(yǎng)基。2試驗(yàn)設(shè)計(jì)通過(guò)不同的培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)血清I型鴨疫里默氏桿菌后，測(cè)定其培養(yǎng)物中的菌數(shù) 并比較其成本。3 材料3. 1菌種血清I型鴨疫里默氏桿菌RA-CH-I株。3. 2雞胚購(gòu)自雞場(chǎng)孵化至10日齡的雞胚。
3. 3試劑普通肉湯、牛肉膏購(gòu)自杭州微生物試劑公司；胰酶大豆肉湯、蛋白胨、胰 蛋白胨、水解乳蛋白、酵母提取物購(gòu)自BD公司；NaCl、MgS04. 7H20、葡萄糖、磷酸二氫鉀、磷酸 氫二鉀、Na2HPO4 · 12H20、(NH4)2S04、NH4Cl、維生素Bl為國(guó)產(chǎn)分析純，新生牛血清為國(guó)產(chǎn)。3. 4培養(yǎng)基10%血清的普通肉湯、胰酶大豆肉湯、10%血清的胰酶大豆肉湯、 裂解血球全血N-J合成培養(yǎng)基及檢驗(yàn)用培養(yǎng)基均嚴(yán)格按《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行生產(chǎn)和檢 驗(yàn)合格后備用；裂解血球全血N-J合成培養(yǎng)基配方采用實(shí)施例2所列配方。4 方法RA經(jīng)血平板活化培養(yǎng)后，接種于含10%犢牛血清的普通肉湯，置37°C培養(yǎng)24小 時(shí)，取樣作純粹檢驗(yàn)合格后，按2%的接種量分別接種于10%血清的普通肉湯、胰酶大豆肉 湯、10%血清的胰酶大豆肉湯、P-L肉湯、10%血清P-L肉湯和裂解血球全血N-J合成培 養(yǎng)基中，培養(yǎng)罐中培養(yǎng)，雞胚按常規(guī)方法絨毛尿囊腔接種和收取胚液/胚體，測(cè)定并比較幾 種培養(yǎng)物及胚液/胚體混合物中細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果和培養(yǎng)基的價(jià)格，產(chǎn)量高、性價(jià)比好的作為 定型生產(chǎn)工藝。5結(jié)果評(píng)估5. 1結(jié)果判定根據(jù)細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果判定各種培養(yǎng)基的生產(chǎn)菌量，根據(jù)各種培養(yǎng)基的 生產(chǎn)菌量和培養(yǎng)基價(jià)格判定選用何種培養(yǎng)基。5. 2試驗(yàn)的有效性本實(shí)驗(yàn)使用的理論和技術(shù)成熟，結(jié)果判定指標(biāo)客觀，整個(gè)實(shí)驗(yàn) 的各個(gè)環(huán)節(jié)嚴(yán)格操作、正確評(píng)估實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)果如有疑議至少重復(fù)操作2次。每一次試驗(yàn)規(guī) 模穩(wěn)定，由此認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效。6 結(jié)果見(jiàn)下表1 表1不同培養(yǎng)基培養(yǎng)物中細(xì)菌計(jì)數(shù)、培養(yǎng)基價(jià)格及性價(jià)比
權(quán)利要求
一種鴨疫里默氏桿菌疫苗生產(chǎn)用培養(yǎng)基，其特征在于，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加物，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組分及比例為胰蛋白胨，1.5 1.9％；酵母提取物，0.2 0.7％；牛肉浸膏，0.2 0.7％；水解乳蛋白，0.2 0.7％；葡萄糖，0.1 0.4％；NaCl，0.5％；磷酸二氫鉀，0.1 0.7％；磷酸氫二鉀，0.1 0.7％；Na2HPO4·12H2O，0.5 0.9％；(NH4)2SO4，0.1 0.2％；NH4Cl，0.01 0.03％；其中所述各組分的百分比為重量/體積百分比；所述添加物為采用頸靜脈采血或頸動(dòng)脈放血的方法無(wú)菌采取非疫區(qū)健壯牛血并無(wú)菌脫纖，于 20℃和室溫凍融，反復(fù)凍融3次后，保存于 20℃?zhèn)溆没虿裳o(wú)菌脫纖后直接保存于 20℃，使用前取出反復(fù)凍融3次。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴨疫里默氏桿菌疫苗生產(chǎn)用培養(yǎng)基，其特征在于，所述添加 物的用量為裂解血球全血按體積比0. 8-1. 5%加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。
3.—種權(quán)利要求1所述的鴨疫里默氏桿菌疫苗生產(chǎn)用培養(yǎng)基的制備方法，其特征在 于，包括以下步驟，首先根據(jù)權(quán)利要求1所述配比稱取所需基礎(chǔ)培養(yǎng)基組分混合后121°C滅 菌15分鐘，待滅菌成分冷卻至低于40-50°C時(shí)將所述添加物加入所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，搖勻 后即得成品培養(yǎng)基。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的鴨疫里默氏桿菌疫苗生產(chǎn)用培養(yǎng)基的制備方法，其特征在 于，所述添加物的用量為按體積比0. 8-1. 5%加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種鴨疫里默氏桿菌疫苗生產(chǎn)用培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加物，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組分及比例為胰蛋白胨1.5-1.9％；酵母提取物0.2-0.7％；牛肉浸膏0.2-0.7％；水解乳蛋白0.2-0.7％；葡萄糖0.1-0.4％；NaCl 0.5％；磷酸二氫鉀0.1-0.7％；磷酸氫二鉀0.1-0.7％；Na2HPO4·12H2O，0.5-0.9％；(NH4)2SO4，0.1-0.2％；NH4Cl 0.01-0.03％；其中所述各組分的百分比為重量/體積百分比；所述添加物為采用頸靜脈采血或頸動(dòng)脈放血的方法無(wú)菌采取非疫區(qū)健壯牛血并無(wú)菌脫纖，于-20℃和室溫凍融，反復(fù)凍融3次后，保存于-20℃?zhèn)溆没虿裳o(wú)菌脫纖后直接保存于-20℃，使用前取出反復(fù)凍融3次。該培養(yǎng)基可降低成本；增加了營(yíng)養(yǎng)；克服用活體動(dòng)物或胚胎培養(yǎng)操作復(fù)雜和人工成本高的不足；可以用于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)鴨疫里默氏桿菌疫苗。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101948781SQ201010268808
公開(kāi)日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2010年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月1日
發(fā)明者朱德康, 汪銘書(shū), 程安春, 陳孝躍 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物工程技術(shù)中心