專利名稱：具有亞硝酸鹽去除能力的非致病性工程菌及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了一種具有亞硝酸鹽去除功能的非致病性工程菌及其構(gòu)建方法，該工 程菌可用于水產(chǎn)養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽的去除。
背景技術(shù)：
水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)是指水生環(huán)境系統(tǒng)中生物體的生產(chǎn)、加工和銷售，已有數(shù)千年的歷史。 水產(chǎn)養(yǎng)殖是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要組成部分，在過去50年中取得了迅猛發(fā)展。近年來，傳統(tǒng)的水 產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)越來越趨向于集約化，在發(fā)展中存在的問題很多。在高投入、高產(chǎn)出的水產(chǎn)養(yǎng)殖系 統(tǒng)中，殘留在水體中的排泄物及餌料殘?jiān)h(yuǎn)遠(yuǎn)超出了水體自身的凈化能力，導(dǎo)致大量氮元 素滯留在養(yǎng)殖水體中。氮元素在養(yǎng)殖水體中主要以分子態(tài)氮(N2)、氨氮(NH3、NH4+-N)、亞硝酸鹽(NO2--N)、 硝酸鹽(NO3--N)及有機(jī)物氮(如尿素、氨基酸、蛋白質(zhì))等形式存在。養(yǎng)殖水體中的有機(jī)氮 首先在氨化作用下轉(zhuǎn)化為氨氮。產(chǎn)生的氨氮在亞硝酸細(xì)菌的作用下轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽，隨后 硝酸細(xì)菌將亞酸鹽轉(zhuǎn)化為硝酸鹽。最后再由反硝化細(xì)菌將硝酸鹽按亞硝酸鹽一一氧化氮一 一氧化二氮_ —氮?dú)獾捻樞蛞来芜€原，完成水體氮循環(huán)過程。硝化過程中，亞硝酸細(xì)菌生長 速率較快，較能適應(yīng)不利的環(huán)境條件。而硝化細(xì)菌的生長較慢，易受環(huán)境條件的影響，因此 當(dāng)硝化細(xì)菌受到抑制時(shí)，有可能出現(xiàn)亞硝酸鹽(NO2-)的積累。在反硝化過程中，由于反硝化 作用是一個(gè)生物耗能作用，而硝酸鹽還原酶所催化的NO3- — NO2-是整個(gè)過程的限速步驟，因 此當(dāng)環(huán)境中作為反硝化作用電子供體的能源物質(zhì)不足時(shí)，就易使反硝化作用停滯于NO”從 而導(dǎo)致亞硝酸鹽濃度的升高。由此可以看出，亞硝酸鹽作為硝化反應(yīng)和反硝化反應(yīng)過程中 的產(chǎn)物，在水體氮循環(huán)過程中是不可避免的。養(yǎng)殖水體中積累的亞硝酸鹽對于水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物具有強(qiáng)烈的毒性。當(dāng)魚類發(fā)生亞硝 酸鹽中毒時(shí)，其血液會(huì)變成棕色。研究表明，這是由于亞硝酸鹽氧化了生物體內(nèi)血紅蛋白 上的亞鐵離子所致。氧化生成的高鐵血紅蛋白失去了攜帶氧分子的能力，從而影響生物體 內(nèi)氧的運(yùn)輸造成生物死亡。魏泰莉等發(fā)現(xiàn)鯽血液中的高鐵血紅蛋白隨亞硝酸鹽濃度的增 加呈指數(shù)遞增關(guān)系；48h和96h毒性影響的臨界值分別為1.8mg/L和0. 8mg/L[魏態(tài)莉，余 瑞蘭，聶湘平，等.水中亞硝酸鹽對彭澤鯽血紅蛋白及高鐵血紅蛋白的影響.大連水產(chǎn)學(xué) 報(bào).2001. 16(1) :67-71.]。此外，亞硝酸鹽還能使生物體內(nèi)的一些重要酶的活性降低，導(dǎo)致 生物體代謝紊亂，生理功能失調(diào)等[吳中華，劉昌彬，劉存仁，等.中國對蝦慢性亞硝酸鹽和 氨中毒的組織病理學(xué)研究.華中師范大學(xué)學(xué)報(bào).1999. 33(1) :119-122.]。因此在水產(chǎn)養(yǎng)殖 過程中，對亞硝酸鹽的防治應(yīng)該是嚴(yán)格控制其在安全濃度以下。目前用于水體中亞硝酸鹽去除的方法主要包括物理法、化學(xué)法及生物法?；钚蕴?吸附法、離子交換法、滲透法等物理方法對于亞硝酸鹽具有較好的處理效果，但是處理成本 較高，因而不適宜于大規(guī)模的水體處理?；瘜W(xué)法主要通過添加一些還原劑、氧化劑及螯合劑 等將水體中的亞硝酸鹽去除?；瘜W(xué)法也存在著成本高的缺點(diǎn)，且還容易造成水體的二次污 染。目前，生物方法是研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)，其主要利用可降解亞硝酸鹽的微生物或其產(chǎn)生的
3亞硝酸鹽還原酶，降低亞硝酸鹽含量。目前報(bào)道的具有亞硝酸還原酶活性的微生物主要為反硝化細(xì)菌，包括假單胞菌 屬、產(chǎn)堿桿菌、節(jié)桿菌(Arthrobacter sp·)、糞產(chǎn)堿菌(Alcaligenesfaecalis)等。但許 多反硝化細(xì)菌為條件性致病菌，對于水產(chǎn)養(yǎng)殖生物具有一定的危害性，不能直接用于水體 的處理。因而亞硝酸還原酶編碼基因轉(zhuǎn)入非致病菌中構(gòu)建具有亞硝酸鹽還原活性的非致 病性工程菌株具有非常重要的意義。目前發(fā)現(xiàn)的亞硝酸還原酶有兩種，分別為血紅素cdl 型亞硝酸還原酶(cdl-NiRs)和銅型亞硝酸還原酶(Cu-NiRs)。其中，cdl_NiRs由nirS 基因編碼合成，而Cu-NiRs則由nirK基因編碼。2種亞硝酸還原酶的功能相同，每種反 硝化細(xì)菌只具有1種類型的亞硝酸還原酶。含有cdl-NiRs的反硝化細(xì)菌包括施氏假單 胞菌(Pseudomonas stutxeri)，銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、泛養(yǎng)琉球菌 (Thiosphaera pantotropha) >(Rhodobactersphaeroides) ·。胃gpilElii (Alcaligenes faecalis)、裂環(huán)無色桿菌(Achromobacter cycloclasters)、Pseudomonas aureofacien中含有的亞硝酸還原酶則為Cu-NiRs。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有亞硝酸鹽去除能力的非致病性工程菌及其構(gòu)建方 法，該工程菌能夠用于水產(chǎn)養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽的去除。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是該具有亞硝酸鹽去除能力的非致 病性工程菌的保藏編號(hào)為CGMCC No. 3626 ；該工程菌由重組質(zhì)粒和宿主菌組成，重組質(zhì)粒指 的是連有nirS基因的重組pET載體，宿主菌指的是pET系統(tǒng)非致病性宿主菌。本發(fā)明的具有亞硝酸鹽去除能力的非致病性工程菌的構(gòu)建方法包括如下步驟1)按如下方法進(jìn)行nirS基因的TA克隆設(shè)計(jì)nirS基因PCR反應(yīng)擴(kuò)增所需的引物，在上游引物和下游引物的5’端分別加 入限制性酶切位點(diǎn)；以含有Cdl-NiRs的條件性致病菌的基因組為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增得到目的片 段，該目的片段經(jīng)純化后首先與T克隆載體進(jìn)行連接，后再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入克隆宿主菌中 挑取陽性克隆子進(jìn)行測序以驗(yàn)證目的片段是否得到正確擴(kuò)增，對目的片段擴(kuò)增正確的陽性 克隆子進(jìn)行雙酶切，回收目的片段。2)按以下方法構(gòu)建連有nirS基因的重組PET表達(dá)載體將步驟1)回收得到的目的片段首先與含有限制性酶切位點(diǎn)的pET表達(dá)載體進(jìn)行 連接，后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入克隆宿主菌中挑取陽性重組子，從所述陽性重組子中提取重組質(zhì) 粒，該重組質(zhì)粒為連有nirS基因的重組PET表達(dá)載體。3)按以下方法構(gòu)建所述非致病性工程菌將步驟2)得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入pET系統(tǒng)非致病性宿主菌中，挑取陽性轉(zhuǎn)化子得到 重組菌株，該重組菌株為所述非致病性工程菌。本發(fā)明非致病性工程菌的分類命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)，具有亞 硝酸鹽去除能力，已于2010年2月3日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物 中心(簡稱CGMCC)，保藏編號(hào)為CGMCC No. 3626。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明提供一種新型的具有亞硝酸鹽去
4除能力的非致病性工程菌，以該菌的亞硝酸鹽去除能力，可有效去除水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水中的亞 硝酸鹽。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于通過基因工程技術(shù)的方法將含有Cdl-NiRs的條件性治病菌的 nirS基因轉(zhuǎn)入pET系統(tǒng)非致病性宿主菌中，構(gòu)建的非致病性工程菌能夠用于水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水 的處理。該工程菌在對水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水的處理中，無需加入異丙基硫代-β-半乳糖苷(Isopr opyl β -D-1-Thiogalactopyranoside,簡稱IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)即可有很好的亞硝酸鹽去除效 果，大大簡化了操作的步驟和處理的成本，具有重要的實(shí)際意義和廣闊的開發(fā)前景。生物材料樣品的保藏信息保藏的生物材料樣品大腸埃希氏菌ZY-4(Escherichia coli ZY-4)；保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱CGMCC)；保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院中國科學(xué)院微生物研究所(郵編100101);保藏日期2010年2月3日；保藏登記號(hào)CGMCCNo. 3626。


圖1為表達(dá)載體pET-28a-c (+)的物理圖譜。圖2為nirS基因的電泳檢測圖。圖3為重組克隆載體pMD19-T-nirS的菌落PCR電泳檢測圖。圖4為重組克隆載體pMD19-T-nirS的酶切鑒定結(jié)果。圖5為重組表達(dá)載體pET-28a-nirS的菌落PCR電泳檢測圖。圖6為重組表達(dá)載體pET-28a-nirS的酶切鑒定結(jié)果。圖7為大腸埃希氏菌CGMCC No. 3626的菌落PCR電泳檢測圖。圖8為大腸埃希氏菌CGMCC No. 3626的酶切鑒定結(jié)果。圖9為大腸埃希氏菌CGMCC No. 3626表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳圖譜。圖10為大腸埃希氏菌CGMCC No. 3626的亞硝酸鹽去除能力測定結(jié)果。圖11為大腸埃希氏菌CGMCC No. 3626對模擬水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水的處理效果。圖12為大腸埃希氏菌CGMCC No. 3626對實(shí)際水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水的處理效果。圖13為nirS基因的電泳檢測圖。圖14為重組克隆載體pGEM-T-nirS的菌落PCR電泳檢測圖。圖15為重組克隆載體pGEM-T-nirS的酶切鑒定結(jié)果。圖16為重組表達(dá)載體pET-28a-nirS的菌落PCR電泳檢測圖。圖17為重組表達(dá)載體pET-28a-nirS的酶切鑒定結(jié)果。圖18為重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS_E. coli BL 21的菌落PCR電泳檢測圖。圖19為重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E. coli BL 21的酶切鑒定結(jié)果。圖20為重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E. coli BL 21表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電 泳圖。圖21為重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E. coli BL 21的亞硝酸鹽去除能力測
定結(jié)果。圖22為重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E. coli BL 21對模擬水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水的處理過程中氨氮(口 )、亞硝酸鹽(*)、硝酸鹽(+)、及上清中總氮(■)的變化曲線。圖23為重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS_E. coli BL 21對實(shí)際水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水的 處理過程中氨氮(口 )、亞硝酸鹽(*)、硝酸鹽(+)、及上清中總氮(■)的變化曲線。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明具有亞硝酸鹽去除能力的非致病性工程菌的構(gòu)建方法，是利用聚合酶鏈反 應(yīng)(Polymerase Chain Reaction，簡稱PCR)從含有cdl_NiRs的條件性致病菌中擴(kuò)增得 到nirS基因，將其進(jìn)行TA克隆(Original TA Cloning Kit)。挑取陽性克隆子測序，驗(yàn)證 目的片段是否得到正確擴(kuò)增。對目的片段擴(kuò)增正確的陽性克隆子進(jìn)行雙酶切，回收目的片 段。將目的片段連到PET表達(dá)載體中，所用的pET表達(dá)載體可從表1中選擇，例如，可選用 pET-28a-c (+)pET_28a_c (+)的物理圖譜如圖 1 所示、pET-23a_d(+)或 pET-24a_d(+)。 將目的片段連到PET表達(dá)載體后得到重組質(zhì)粒，即連有nirS基因的重組pET表達(dá)載體。將 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入PET系統(tǒng)非致病性宿主菌中，所用pET系統(tǒng)非致病性宿主菌可從表2中選擇， 例如，可選用大腸埃希式菌BL 21 (簡稱E. coli BL 21)、大腸埃希式菌BL21 (DE3)(簡稱 E. coli BL21(DE3))或大腸埃希式菌 BL21 (DE3) pLysS (簡稱 E. coli BL21 (DE3) pLysS)。接 著，挑取陽性轉(zhuǎn)化子得到重組菌株，所得重組菌株即為本發(fā)明的具有亞硝酸鹽去除能力的 非致病性工程菌。本發(fā)明構(gòu)建的具有亞硝酸鹽去除能力的非致病性工程菌由重組質(zhì)粒和宿 主菌組成，其中，重組質(zhì)粒指的是連有nirS基因的重組pET載體，宿主菌指的是pET系統(tǒng)非 致病性宿主菌。本發(fā)明構(gòu)建的具有亞硝酸鹽去除能力的非致病性工程菌命名為大腸埃希式 菌ZY-4 (Escherichia coli ZY_4)，已在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心 保藏，其保藏編號(hào)為CGMCC No. 3626。具體地說，本發(fā)明具有亞硝酸鹽去除能力的非致病性工程菌的構(gòu)建過程為(l)nirS 基因的 TA 克隆:根據(jù)基因庫(GenBank)中已報(bào)道的nirS基因開放閱讀框設(shè)計(jì)合成PCR所需的引 物。為了便于定向克隆和載體構(gòu)建，在上游引物和下游引物的5’端分別加入限制性內(nèi)切酶 位點(diǎn)。這兩個(gè)限制性酶切位點(diǎn)應(yīng)該存在于PET表達(dá)載體上，而nirS基因中不應(yīng)該具有這兩 個(gè)酶切位點(diǎn)。以含有cdl-NiRs的條件性致病菌的基因組(例如銅綠假單胞菌、斯氏假單胞菌 等)為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增得到目的片段。目的片段經(jīng)純化后首先與T克隆載體進(jìn)行 連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入克隆宿主菌如大腸埃希氏菌DH5 α (簡稱Ε. coli DH5 α )、JM109 (簡稱 Ε. coli JM109)或NovaBlue中。采用菌落PCR及雙酶切方法對克隆子進(jìn)行驗(yàn)證。挑取陽性 克隆子測序，驗(yàn)證目的片段是否得到正確擴(kuò)增。對目的片段擴(kuò)增正確的陽性克隆子進(jìn)行雙 酶切，回收目的片段。(2)連有nirS基因的重組PET表達(dá)載體的構(gòu)建將回收得到的目的片段首先與pET表達(dá)載體如pET-28a-c(+)、pET-23a-d(+)、 pET-24a-d(+)(可選擇的pET表達(dá)載體如表1所示)中進(jìn)行連接，后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入克隆宿 主菌如E. coli DH5a、JM109或NovaBlue中。采用菌落PCR及雙酶切方法對重組子進(jìn)行驗(yàn) 證，挑取陽性重組子。從陽性重組子中提取重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒即為連有nirS基因的重 組PET載體。
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(3)亞硝酸鹽去除能力的非致病性工程菌的構(gòu)建將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入pET系統(tǒng)非致病性宿主菌如E. coli BL 21、E. coli BL21(DE3)或 Ε. coliBL21 (DE3) pLysS (可選擇的pET非致病性宿主菌如表2所示)中，涂布含抗生素的牛 肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(Luria-Bertani，簡稱LB培養(yǎng)基)平板。采用菌落PCR及雙酶切方法篩 選陽性轉(zhuǎn)化子，即可得到具有亞硝酸鹽去除能力的非致病性工程菌。上述含有Cdl-NiRs的條件性致病菌如銅綠假單胞菌、斯氏假單胞菌等可從中國 微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心購買得到。構(gòu)建本發(fā)明具有亞硝酸鹽去除 能力的非致病性工程菌中所涉及到的T克隆載體、pET表達(dá)載體、E. coli DH5 α、JM109、 NovaBlue,pET系統(tǒng)非致病性宿主菌、限制性內(nèi)切酶和PCR所用的DNA聚合酶等均可從市場 購得。表1 構(gòu)建本發(fā)明非致病性工程菌可選用的pET表達(dá)載體 注I =內(nèi)部標(biāo)簽，N = N-端標(biāo)簽，C =可選的C-端標(biāo)簽；蛋白酶酶切位點(diǎn)T =凝 血酶，E =腸激酶，X = Xa因子續(xù)表1
X 注I =內(nèi)部標(biāo)簽，N = N-端標(biāo)簽，C =可選的C-端標(biāo)簽；蛋白酶酶切位點(diǎn)T =凝 血酶，E =腸激酶，X = Xa因子表2 構(gòu)建本發(fā)明非致病性工程菌可選用的pET系統(tǒng)非致病性宿主菌及其特性 續(xù)表2 續(xù)表2 續(xù)表 2
實(shí)施例1(一)nirS基因的TA克隆1.以銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)為材料，采用十六烷基三乙基溴 化銨(cetyltrimethylammonium bromide，簡稱 CTAB)法進(jìn)行基因組 DNA 的提取。2.引物設(shè)計(jì)在GenBank已報(bào)道的銅綠假單胞菌中，銅綠假單胞菌 PAOl(Pseudomonasaeruginosa PA01)、銅綠假單胞菌 UCBPP-PA14(Pseudomonas aeruginosaUCBPP-PA14)(Pseudomonas aeruginosa LESB58)白勺 nirS 基因核苷酸序列的序列登錄號(hào)分別對應(yīng)為AE004091. 2、CP000438. 1、FM209186. 1)，其中， Pseudomonas aeruginosa PAOl 的 nirS 基因核昔酸序列如 SEQ ID NO. 1 所示，Pseudomonas aeruginosa UCBPP-PA14 的 nirS 基因核苷酸序列如 SEQ ID N0. 2 所示，Pseudomonas aeruginosa LESB58的nirS基因核苷酸序列如SEQ ID N0. 3所示。
在本實(shí)施例中，可依據(jù)銅綠假單胞菌PAOl、銅綠假單胞菌UCBPP-PA14或銅綠假單 胞菌LESB58的nirS基因核苷酸序列，應(yīng)用Primer premier 5. 0軟件設(shè)計(jì)一對特異性引物 nirS-Ι和nirS-2。為了便于定向克隆和載體構(gòu)建，在上游引物nirS_l和下游引物nirS_2 的5’端分別加入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。設(shè)計(jì)的上游引物nirS-1的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4 所示，其中，畫線部分為加入的Nde I酶切位點(diǎn)；設(shè)計(jì)的下游引物nirS-2的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 5所示，其中，畫線部分為加入的EcoR I酶切位點(diǎn)。該引物預(yù)計(jì)擴(kuò)增得到的片段 長度為1707bp。設(shè)計(jì)的上游弓I物:ggaattccatatKatgccatttggcaagccactg設(shè)計(jì)的下游弓I物:ccggaattctcagtacacgtcgtgctgggtg3. nirS基因的PCR擴(kuò)增以銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)基因組為模板，通過PCR擴(kuò)增目的片 段。PCR 反應(yīng)體系(50uL)為10XPCR 緩沖液 5. 0uL，MgCl2(25mmol/L)4. 0uL，dNTP 1. 5uL, 引物 nirS-1 和 nirS-2 各 1. OuL,模板 DNA 1. OuL, Taq 酶(10000U/mL,由 TaKaRa 公司生 產(chǎn))0. 5uL，重蒸水36. OuL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C熱變性5min，然后94°C lmin，58°C退火 lmin，72°C延伸lmin50s，共35個(gè)循環(huán)，最后進(jìn)行72°C延伸lOmin。反應(yīng)結(jié)束，用瓊脂糖凝 膠電泳分離檢測PCR產(chǎn)物。PCR反應(yīng)結(jié)束后，采用的普通瓊脂糖電泳，檢查PCR產(chǎn)物，結(jié) 果如圖2所示圖2為nirS基因電泳檢測圖(泳道1為PCR產(chǎn)物，泳道M為DNA分子量標(biāo) 準(zhǔn))，其中，泳道1在1707bp處有一條清晰條帶，所得結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相符。4.重組克隆載體pMD19-T_nirS的構(gòu)建PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，采用AxyGEN公司的AxyPr印PCRCleanup Kit 回收目的片段。將回收的目的片段克隆到PMD19-T Vector上，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。目的片段 (割膠回收產(chǎn)物)與pMD19-vecter載體連接采用Takara公司的連接試劑盒。反應(yīng)體系為 (IOuL) :PCR 回收產(chǎn)物 4. 5uL，pMD19-vecter 0. 5uL, Solution I 5uL。離心混勻，4°C放置 16h (以上均在冰上操作)。取連接產(chǎn)物8uL加于IOOuL E. coli DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中，用移 液槍吹打均勻，冰浴30min。42°C下熱激90s，立即放回冰浴中5min。加入LB液體lmL，混 勻，37°C下200rpm培養(yǎng)lh，使細(xì)胞復(fù)蘇。取200uL轉(zhuǎn)化的細(xì)菌液涂布于含有50mg/ml氨芐 (Ampici 11 in，簡稱Amp)的LB抗性平板上37°C下培養(yǎng)過夜進(jìn)行篩選。5.重組克隆載體pMD19-T_nirS的鑒定挑取上述抗生素平板上的白色單菌落接入5mL含50mg/ml Amp的LB液體培養(yǎng)基 中，37°C、200rpm培養(yǎng)過夜。次日，直接以菌液為模板，M13-47為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反 應(yīng)體系(50uL)為10 X PCR 緩沖液 5. OuL, MgCl2 (25mmol/L) 4. 0 μ L, dNTP L 5 μ L，M13-47 通用引物各 l.OyL，模板 DNA 1. 0μ L, Taq 酶(10000U/mL，TaKaRa 公司)0. 5yL，重蒸水 36. OyL0 PCR反應(yīng)程序同上。反應(yīng)結(jié)束，用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，結(jié)果如圖3所 示圖3為重組克隆載體pMD19-T-nirS的菌落PCR電泳檢測圖(泳道M為DNA分子量標(biāo) 準(zhǔn))，泳道1、2在1707bp處未顯示出條帶，證明這兩個(gè)克隆子中未插入目的片段。而泳道 3、4、5、6在1707bp處各有一條清晰條帶，初步證明這4個(gè)克隆子中插入了目的片段。采用AxyGEN公司的AxyPr印Plasmid Miniprep Kit對PCR檢測中初步證明插入 目的片段的克隆子進(jìn)行質(zhì)粒提取。對質(zhì)粒DNA作限制性內(nèi)切酶雙酶切(Nde I和EcoRI)，酶 切體系20uL，混合液置于37°C反應(yīng)3h。反應(yīng)結(jié)束后，對酶切產(chǎn)物進(jìn)行的瓊脂糖凝膠電泳，觀察酶切片段的位置和大小。結(jié)果如圖4所示圖4為重組克隆載體pMD19-T-nirS的 酶切鑒定結(jié)果(泳道1為酶切產(chǎn)物，泳道M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn))，其中，泳道1在1707bp和 2700bp處各有一條清晰條帶，分別對應(yīng)于目的片段nirS和克隆載體pMD19-vecter，進(jìn)一步 證明這一克隆子中插入了目的片段。PCR和酶切鑒定都正確的克隆子鑒定為陽性克隆子，命名為大腸埃希氏菌 pMD19-T-nirS DH5 α。保存的甘油菌液采用Sanger雙脫氧鏈終止法或Maxam-Gilbert化 學(xué)降解法進(jìn)行測序，測序引物為M13-47。測序結(jié)果顯示陽性重組克隆載體中插入的目的 片段序列如SEQ ID NO. 3所示。將該序列通過NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih. S2DBlast程序與GenBank數(shù)據(jù)庫中的核苷酸序列進(jìn)行比對。結(jié)果顯示，該序列與銅綠 假單胞菌 PAOl (Pseudomonasaeruginosa PA01)、銅綠假單胞菌 UCBPP-PA14 (Pseudomonas aeruginosaUCBPP-PA14)(Pseudomonas aeruginosa LESB58)白勺 nirS 基因核苷酸序列(序列登錄號(hào)分別為AE004091. 2、CP000438. UFM209186. 1) (Pseudomonas aeruginosa PAOl 的 nirS 基因核昔酸序列如 SEQ ID NO. 1 所示；Pseudomonas aeruginosa UCBPP-PA14 的 nirS 基因核苷酸序列如 SEQ ID NO. 2 所示；Pseudomonas aeruginosa LESB58的nirS基因核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示)的相似性均達(dá)到100%。表明本發(fā) 明重組克隆載體中所插入的目的片段含有正確的nirS基因序列，達(dá)到預(yù)期目的。( 二 )重組表達(dá)載體pET_28a-nirS的構(gòu)建1、重組表達(dá)載體pET-28a_nirS的構(gòu)建采用AxyGEN公司的AxyPr印Plasmid Miniprep Kit提取大腸埃希氏菌 pMD19-T-nirS DH5 α的質(zhì)粒DNA。然后采用限制性內(nèi)切酶Nde I和EcoR I分別對質(zhì)粒DNA 和表達(dá)載體pET-28a-c (+)(購自Novagen生物公司)進(jìn)行雙酶切。酶切體系20uL，混合液 置于37°C反應(yīng)3h。反應(yīng)結(jié)束后，對酶切產(chǎn)物進(jìn)行的瓊脂糖凝膠電泳。采用AxyGEN公司 的 AxyPr印 DNA Gel Extraction Kit 回收酶切產(chǎn)物。采用T4 DNA連接酶將經(jīng)雙酶切后割膠回收得到的目的片段與同樣經(jīng)雙酶切處理 的表達(dá)載體pET-28a-c (+)進(jìn)行連接。反應(yīng)體系10uL，混勻，16°C反應(yīng)16h。取連接產(chǎn)物8uL 加于IOOuL E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，用移液槍吹打均勻，冰浴30min。42°C下熱激90s， 立即放回冰浴中5min。加入LB液體lmL，混勻，37°C下200rpm培養(yǎng)lh，使細(xì)胞復(fù)蘇。取 200uL轉(zhuǎn)化的細(xì)菌液涂布于含有50mg/L卡那霉素(Kanamycin，簡稱Kna)的LB抗性平板上 37 °C下培養(yǎng)過夜進(jìn)行篩選。2、重組表達(dá)載體pET-28a_nirS的鑒定挑取上述抗生素平板上的單菌落接入5mL含50mg/L Kna的LB液體培養(yǎng)基中， 37°C、200rpm培養(yǎng)過夜。次日，直接以菌液為模板，T7為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系 (50uL)為10XPCR 緩沖液 5. OuL，MgCl2 (25mmol/L) 4. O μ L, dNTP L 5 μ L，Τ7 通用引物各 1· O μ L，模板 DNA 1· O μ L，Taq 酶(lOOOOU/mL, TaKaRa 公司)0· 5 μ L，重蒸水 36. O μ L。PCR 反應(yīng)程序同上。反應(yīng)結(jié)束，用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，結(jié)果如圖5所示圖5為重組 表達(dá)載體pET-28a-nirS的菌落PCR電泳檢測圖(泳道M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn))，泳道1、2、5、 6、8在1707bp處無條帶，證明這5個(gè)重組子中未插入目的片段。而泳道3、4、7在1707bp處 各有一條清晰條帶，初步證明這4個(gè)重組子中插入了 nirS片段。采用AxyGEN公司的AxyPr印Plasmid Miniprep Kit對PCR檢測中初步證明插入
16目的片段的重組子進(jìn)行質(zhì)粒提取。對質(zhì)粒DNA作限制性內(nèi)切酶雙酶切(Nde I和EcoRI)， 酶切體系20uL，混合液置于37°C反應(yīng)3h。反應(yīng)結(jié)束后，對酶切產(chǎn)物進(jìn)行的瓊脂糖凝膠 電泳，觀察酶切片段的位置和大小。結(jié)果如圖6所示，圖6為重組表達(dá)載體pET-28a-nirS 的酶切鑒定結(jié)果，其中，泳道1、2、3、4為酶切產(chǎn)物，泳道Ml、M2為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1、 2、3、4在1707bp和5000bp處各有一條清晰條帶，分別對應(yīng)于目的片段nirS和表達(dá)載體 pET-28a-c (+)，進(jìn)一步證明這四個(gè)重組子中插入目的片段，表達(dá)載體pET-28a-nirS構(gòu)建成 功。PCR和酶切鑒定都正確的重組子鑒定為陽性重組子，該陽性重組子被命名為大腸埃希 氏菌 pET-28a-nirS DH5 α 0(三)重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS_E. coll BL 21的構(gòu)建采用AxyGEN公司的AxyPr印Plasmid Miniprep Kit提取大腸埃希氏菌 pET-28a-nirS DH5 α 的質(zhì)粒 DNA。取質(zhì)粒 DNA 8uL 加于 IOOuL E. coli BL 21 感受態(tài)細(xì)胞 中，用移液槍吹打均勻，冰浴30min。42°C下熱激90s，立即放回冰浴中5min。加入LB液體 lmL，混勻，37°C下200rpm培養(yǎng)lh，使細(xì)胞復(fù)蘇。取200uL轉(zhuǎn)化的細(xì)菌液涂布于50mg/L含有 Kna的LB抗性平板上37°C下培養(yǎng)過夜進(jìn)行篩選。挑取抗生素平板上的單菌落接入5mL含 50mg/L Kna的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、200rpm培養(yǎng)過夜。次日，采用上述相同的菌落PCR及 酶切驗(yàn)證方法鑒定陽性轉(zhuǎn)化子。圖7為大腸埃希氏菌CGMCC No. 3626的菌落PCR電泳檢測圖 (泳道M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn))。圖7中，泳道1在1707bp處沒有出現(xiàn)條帶，說明該轉(zhuǎn)化子中 未轉(zhuǎn)入重組表達(dá)載體pET-28a-nirS。而泳道2在1707bp出有一條清晰條帶，初步證明這個(gè) 轉(zhuǎn)化子中轉(zhuǎn)入了重組表達(dá)載體pET-28a-nirS。圖8為大腸埃希氏菌CGMCC No. 3626的酶切 鑒定結(jié)果(泳道1為酶切產(chǎn)物，泳道M1、M2為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn))。圖8中，泳道1在1707bp 和5000bp處各有一條清晰條帶，分別對應(yīng)于目的片段nirS和表達(dá)載體pET-28a-c (+)，進(jìn) 一步證明該轉(zhuǎn)化子中轉(zhuǎn)入了重組表達(dá)載體pET-28a-nirS。PCR和酶切結(jié)果都正確的轉(zhuǎn)化子 鑒定為重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E. coli BL 21，即為本發(fā)明的大腸埃希氏菌CGMCC No.3626。(四)nirS基因在大腸埃希氏菌CGMCCNo. 3626中表達(dá)的檢測1、目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)從含有50mg/l Kna的LB固體平板上挑取大腸埃希氏菌CGMCC No. 3626菌落接 入5mL含有50mg/L Kna的LB液體培養(yǎng)基中，200rpm、37°C培養(yǎng)12_16h后，4°C靜置過夜， 接入新鮮的50mg/L Kna的LB培養(yǎng)基中，200rpm振蕩培養(yǎng)。當(dāng)菌體生長至對數(shù)期時(shí)加入 異丙基硫代-β-半乳糖苷(IPTG)至終濃度為0. 7mmol/L，然后繼續(xù)培養(yǎng)2. 5h，離心收集 菌體。裂解細(xì)胞后，以十二烷基磺酸納-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，簡稱 SDS—PAGE)分析胞內(nèi)總蛋白。2、SDS-PAGE 分析將上述所提蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測，方法如下1)配制10%的分離膠，5%的濃縮膠；2)待測樣品于99°C加熱處理5min ；3)各取 20ul樣品上樣；4)起始電壓80V，待樣品跑過濃縮膠后，加壓至150V，溴酚蘭到達(dá)底部邊緣 停止電泳；5)剝下膠塊，于10%三氯乙酸中固定Ih ；6)將膠塊置于0. 05%卡馬斯亮藍(lán)染色 液中染色過夜；7)用脫色液輕微震蕩脫色至背景干凈，條帶清晰。結(jié)果如圖9所示圖9大腸埃希氏菌CGMCC No. 3626表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳圖譜(泳道1為未誘導(dǎo)時(shí)的大腸埃希氏菌CGMCC No. 3626蛋白，泳道2為誘導(dǎo)2h的大腸埃希 氏菌CGMCC No. 3626蛋白，泳道3為誘導(dǎo)4h的大腸埃希氏菌CGMCC No. 3626蛋白，泳道M 為蛋白電泳標(biāo)準(zhǔn)分子量)，在泳道2和3中，在約65kDa附近處有一非常明顯的特異性蛋白 條帶，其分子量大小與nirS基因分子量的理論預(yù)測值相符，說明nirS基因在大腸埃希氏菌 CGMCC No. 3626中得到了表達(dá)。3、大腸埃希氏菌CGMCC No. 3626的亞硝酸鹽去除能力測定亞硝酸鹽去除能力測試培養(yǎng)基(g/L)=NaNO2 0. 097g, NH4Cl 0. 246g，MgS04 · 7H20 0. 039g, CaCl2 0. 055g, FeSO4 · 7H20 0. OlOg, CuSO4 · 5H20 0. 000024g, K2HPO413. 908g, KH2P045. 304g，瓊脂20g(固體培養(yǎng)基中)。以上各化合物溶于IL蒸餾水中，用NaOH或HCl 調(diào)節(jié)溶液PH值至7. 0-7. 5，分裝后滅菌。冷卻后在無菌條件下加入適量的滅菌葡萄糖母液， 使得葡萄糖終濃度為3. 96g/L。將大腸埃希氏菌CGMCC No. 3626接入含有50mg/L Kna的LB液體培養(yǎng)基中，30°C振 蕩培養(yǎng)過夜。菌株生長至對數(shù)期時(shí)，取出適量菌液，12000rpm離心5min，收集菌體。從每個(gè) 管中取出適量菌液，12000rpm離心5min，收集菌體。用無菌水清洗3次后再離心收集菌體。 取適量菌體接入IOOmL亞硝酸鹽去除能力測試培養(yǎng)基中，使0D_ = 0. 9左右。同時(shí)在培養(yǎng) 基內(nèi)加入異丙基硫代-β-半乳糖苷(IPTG)至濃度0. 7mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)，200rpm、37°C培養(yǎng) 16h。每隔Ih取樣，測定樣品中亞硝酸鹽含量。亞硝酸鹽含量測試方法為N-(1-萘基)-乙 二胺光度法(參見國家環(huán)境保護(hù)總局，《水和廢水監(jiān)測分析方法》編委會(huì)編(2002)，水和廢 水監(jiān)測分析方法(第四版)，中國環(huán)境科學(xué)出版社)。本測試中設(shè)置5個(gè)對照組，對照1為野生菌株P(guān)seudomonas aeruginosa,對照2 為未加入IPTG誘導(dǎo)的大腸埃希氏菌CGMCC No. 3626，對照3為含有空的載體質(zhì)粒pET_28a Ε. coli BL 21菌株，對照4為不攜帶質(zhì)粒的表達(dá)宿主菌株E. coli BL 21，對照5不投加任 何菌體。分別測試了上述5個(gè)對照組的亞硝酸鹽去除效果，測試方法與上述基本相同，不同 之處培養(yǎng)基中不用加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。此外，除未加入IPTG誘導(dǎo)的大腸埃希氏菌CGMCC No. 3626及含有空的載體質(zhì)粒pET-28aE. coli BL 21菌株的培養(yǎng)基中要加入Kna至終濃度 50mg/L外，其他菌株的培養(yǎng)基中均不用加入Kna。測定結(jié)果如圖10所示圖10為大腸埃希氏菌CGMCC No. 3626的亞硝酸鹽去除能 力測定結(jié)果(圖10中，■為誘導(dǎo)的大腸埃希氏菌CGMCC No. 3626樣品中亞硝酸鹽含量變 化曲線， 為未誘導(dǎo)的大腸埃希氏菌CGMCC No. 3626樣品中亞硝酸鹽含量變化曲線，*為 野生菌株樣品中亞硝酸鹽含量變化曲線，▲為未插入目標(biāo)片段的表達(dá)宿主菌BL 21樣品中 亞硝酸鹽含量變化曲線，+為未投加菌株的樣品中亞硝酸鹽含量變化曲線)可以看出，誘 導(dǎo)的大腸埃希氏菌CGMCCNo. 3626、未誘導(dǎo)的大腸埃希氏菌CGMCC No. 3626樣品中亞硝酸鹽 含量均大幅度的下降。表明誘導(dǎo)的大腸埃希氏菌CGMCC No. 3626、未誘導(dǎo)的大腸埃希氏菌 CGMCCNo. 3626具有非常好的亞硝酸鹽去除能力。(五)大腸埃希氏菌CGMCCNo. 3626對實(shí)際水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水及模擬水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水的 處理效果1)將大腸埃希氏菌CGMCC No. 3626菌株活化；2)將活化后的菌株接入含有卡那霉 素的LB液體培養(yǎng)基中，30°C振蕩培養(yǎng)過夜；3)從管中取出適量菌液，12000rpm離心5min， 收集菌體。用無菌水清洗3次后重懸。將菌株懸液接入IOOmL實(shí)際及模擬的水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水
18中，使OD6tltl = 0.9左右；4)每隔Ih取樣，測定樣品中亞硝酸鹽、氨氮、硝酸鹽含量及上清中 總氮含量。所有樣品均設(shè)置3個(gè)重復(fù)，以不接菌的培養(yǎng)基為空白對照。實(shí)際水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水中氨氮含量為4. 517mg/L，亞硝酸鹽含量為1. 126mg/L，硝酸鹽含 量為9. 016mg/L,總氮含量為19. 145mg/L。外源添加葡萄糖調(diào)整高錳酸鉀指數(shù)(potassium permanganate index,簡稱 CODtfa)至 80mg/L 左右，加入 IPTG 至濃度 0. 7mmol/L。模擬水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水中含有的氨氮、亞硝酸鹽和硝酸鹽，總氮含量為實(shí)際水產(chǎn)養(yǎng)殖 廢水的4倍左右，具體為氨氮16. 817mg/L、亞硝酸鹽5. 018mg/L、硝酸鹽46. 167mg/L,總氮 73. 817mg/L。外源添加添加葡萄糖調(diào)整CODtfa至320mg/L左右，加入IPTG至濃度0. 7mmol/L。結(jié)果見圖11、12所示，圖11為大腸埃希氏菌CGMCC No. 3626對模擬水產(chǎn)養(yǎng)殖廢 水的處理過程中氨氮(口 )、亞硝酸鹽(*)、硝酸鹽(+)、及上清中總氮(■)含量的變化曲 線，圖12為大腸埃希氏菌CGMCC No. 3626對實(shí)際水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水的處理過程中氨氮(□)、 亞硝酸鹽(*)、硝酸鹽(+)、及上清中總氮(■)含量的變化曲線?？梢钥闯?，投放了大腸埃 希氏菌CGMCC No. 3626的養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽濃度呈下降趨勢，說明大腸埃希氏菌CGMCC No. 3626對含有高濃度亞硝酸鹽的模擬和實(shí)際水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水具有較好的處理效果。實(shí)施例2(一)nirS基因的TA克隆1.以施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)為材料，采用CTAB法進(jìn)行基因組DNA 的提取。2.引物設(shè)計(jì)依據(jù)GenBank中已報(bào)道的施氏假單胞菌A151 (Pseudomonas stutzeri A151)或 施氏假單胞菌LYS-86 (Pseudomonas stutzeri LYS-86)的nirS基因核苷酸序列(序列登 錄號(hào)分別為 AY957388. 1 和 GU474546. 1) (Pseudomonas stutzeriA151 的 nirS 基因核苷酸 序列如SEQ ID N0. 7所示；Pseudomonas stutzeri LYS-86的nirS基因核苷酸序列如SEQ ID N0. 8所示)，應(yīng)用Primer premier 5. 0軟件設(shè)計(jì)一對特異性引物。為了便于定向克隆 和載體構(gòu)建，在上游引物和下游引物的5’端分別加入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。設(shè)計(jì)的上游引物 nirS-Ι的核苷酸序列如SEQ ID N0. 9所示，其中，畫線部分為加入的Nde I酶切位點(diǎn)；設(shè)計(jì) 的下游引物nirS-2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 10所示，其中，畫線部分為加入的BamHI酶 切位點(diǎn)。該引物預(yù)計(jì)擴(kuò)增得到的片段長度為257bp。設(shè)計(jì)的上游弓I物ggaattccatatgcgcctggagaacatcattgc設(shè)計(jì)的下游弓丨物:cgcggatcccttcagtgtcttgtcgtcat3. nirS基因的PCR擴(kuò)增以施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)基因組為模板，通過PCR擴(kuò)增目的片 段。PCR 反應(yīng)體系(50uL)為10XPCR 緩沖液 5. 0uL，MgCl2(25mmol/L)4. 0uL，dNTP 1. 5uL, 引物 nirS-1 和 nirS-2 各 1. OuL,模板 DNA 1. OuL, Taq 酶(10000U/mL, TaKaRa 公司)0. 5uL， 重蒸水36. OuL0 PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C熱變性5min，然后94°C lmin，58°C退火lmin，72°C延 伸lmin50s，共35個(gè)循環(huán)，最后進(jìn)行72°C延伸lOmin。反應(yīng)結(jié)束，用瓊脂糖凝膠電泳分離檢 測PCR產(chǎn)物。PCR反應(yīng)結(jié)束后，采用的普通瓊脂糖電泳，檢查PCR產(chǎn)物，結(jié)果如圖13所 示圖13為nirS基因電泳檢測圖(泳道1為PCR產(chǎn)物，泳道M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn))泳道1 在257bp處有一條清晰條帶，所得結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相符。
4.重組克隆載體pMD8-T_nirS的構(gòu)建PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，采用AxyGEN公司的AxyPr印PCRCleanup Kit 回收目的片段。將回收的目的片段克隆到PGEM-T Vector上，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。目的片段 (割膠回收產(chǎn)物)與pGEM-vecter載體連接采用Takara公司的連接試劑盒。反應(yīng)體系為 (IOuL) :PCR 回收產(chǎn)物 4. 5uL，pGEM-vecter 0. 5uL, Solution I 5uL。離心混勻，4°C放置 16h (以上均在冰上操作)。取連接產(chǎn)物8uL加于IOOuL E. coli JM109感受態(tài)細(xì)胞中，用移 液槍吹打均勻，冰浴30min。42°C下熱激90s，立即放回冰浴中5min。加入LB液體lmL，混 勻，37°C下200rpm培養(yǎng)lh，使細(xì)胞復(fù)蘇。取200uL轉(zhuǎn)化的細(xì)菌液涂布于含有50mg/ml氨芐 (Ampici 11 in，簡稱Amp)的LB抗性平板上37°C下培養(yǎng)過夜進(jìn)行篩選。5.重組克隆載體pGEM-T-nirS的鑒定挑取上述抗生素平板上的白色單菌落接入5mL含50mg/ml Amp的LB液體培養(yǎng)基 中，37°C、200rpm培養(yǎng)過夜。次日，直接以菌液為模板，M13/pUC (-29) back和M13/pUC (40) for為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(50uL)為:10XPCR緩沖液5. 0uL，MgCl2(25mmol/ L)4. 0μ L, dNTP 1. 5μ L, M13/pUC (-29) back 和 M13/pUC (40) for 引物各 1· 0 μ L，模板 DNA 1. 0μ L, Taq 酶(10000U/mL，TaKaRa 公司)0. 5 μ L，重蒸水 36. 0 μ L。PCR 反應(yīng)程序同上。 反應(yīng)結(jié)束，用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，結(jié)果如圖14所示圖14為重組克隆載體 pGEM-T-nirS的菌落PCR電泳檢測圖(泳道M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn))泳道1、2在257bp處未 顯示出條帶，證明這兩個(gè)克隆子中未插入目的片段。而泳道3、4、5、6在257bp處各有一條 清晰條帶，初步證明這4個(gè)克隆子中插入了目的片段。采用AxyGEN公司的AxyPr印Plasmid Miniprep Kit對PCR檢測中初步證明插入 目的片段的克隆子進(jìn)行質(zhì)粒提取。對質(zhì)粒DNA作限制性內(nèi)切酶雙酶切(Nde I和BamHI)，酶 切體系20uL，混合液置于37°C反應(yīng)3h。反應(yīng)結(jié)束后，對酶切產(chǎn)物進(jìn)行的瓊脂糖凝膠電 泳，觀察酶切片段的位置和大小。結(jié)果如圖15所示圖15為重組克隆載體pGEM-T-nirS的 酶切鑒定結(jié)果(泳道1為酶切產(chǎn)物，泳道M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn))泳道1在257bp和2692bp 處各有一條清晰條帶，分別對應(yīng)于目的片段nirS和克隆載體pGEM-T vecter,進(jìn)一步證明 這一克隆子中插入了目的片段。PCR和酶切鑒定都正確的克隆子鑒定為陽性克隆子，命名為大腸埃希氏菌 pGEM-T-nirS JM109。保存的甘油菌液采用Sanger雙脫氧鏈終止法或Maxam-Gilbert化 學(xué)降解法進(jìn)行測序，測序引物為M13-47。測序結(jié)果顯示重組克隆載體中插入的目的片段 序列如 SEQ ID NO. 11 所示。將該序列通過 NCBI 網(wǎng)站(http//www, ncbi. nlm. nih. rov) Blast程序與GenBank數(shù)據(jù)庫中的核苷酸序列進(jìn)行比對。結(jié)果顯示，該序列與施氏假單 胞菌 A151 (Pseudomonas stutzeriA151)、施氏假單胞菌 LYS-86 (Pseudomonas stutzeri LYS-86)的nirS基因核苷酸序列(序列登錄號(hào)分別為AY957388. 1和⑶474546. 1)的相似 性均為100% (AY957388. 1的nirS基因核苷酸序列如SEQ ID N0. 7所示；GU474546. 1的 nirS基因核苷酸序列如SEQ ID N0. 8所示)。表明重組克隆載體中所插入的目的片段含有 正確的nirS基因序列，達(dá)到預(yù)期目的。( 二 )重組表達(dá)載體pET_28a-nirS的構(gòu)建1、重組表達(dá)載體pET-28a_nirS的構(gòu)建采用AxyGEN公司的AxyPr印Plasmid Miniprep Kit提取大腸埃希氏菌
20pGEM-T-nirS JM109的質(zhì)粒DNA。然后采用限制性內(nèi)切酶Nde I和BamHI分別對質(zhì)粒DNA 和表達(dá)載體pET-28a-c (+)(購自Novagen生物公司)進(jìn)行雙酶切。酶切體系20uL，混合液 置于37°C反應(yīng)3h。反應(yīng)結(jié)束后，對酶切產(chǎn)物進(jìn)行的瓊脂糖凝膠電泳。采用AxyGEN公司 的 AxyPr印 DNA Gel Extraction Kit 回收酶切產(chǎn)物。采用T4 DNA連接酶將經(jīng)雙酶切后割膠回收得到的目的片段與同樣經(jīng)雙酶切處理 的表達(dá)載體pET-28a-c (+)進(jìn)行連接。反應(yīng)體系10uL，混勻，16°C反應(yīng)16h。取連接產(chǎn)物8uL 加于IOOuL E. coli JM109感受態(tài)細(xì)胞中，用移液槍吹打均勻，冰浴30min。42°C下熱激90s， 立即放回冰浴中5min。加入LB液體lmL，混勻，37°C下200rpm培養(yǎng)lh，使細(xì)胞復(fù)蘇。取 200uL轉(zhuǎn)化的細(xì)菌液涂布于含有50mg/L Kna的LB抗性平板上37°C下培養(yǎng)過夜進(jìn)行篩選。2、重組表達(dá)載體pET-28a_nirS的鑒定挑取上述抗生素平板上的單菌落接入5mL含50mg/L Kna的LB液體培養(yǎng)基中， 37°C、200rpm培養(yǎng)過夜。次日，直接以菌液為模板，T7為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系 (50uL)為10XPCR 緩沖液 5. OuL，MgCl2 (25mmol/L) 4. O μ L, dNTP L 5 μ L，Τ7 通用引物各 1· O μ L，模板 DNA 1· O μ L，Taq 酶(lOOOOU/mL, TaKaRa 公司)0· 5 μ L，重蒸水 36. O μ L。PCR 反應(yīng)程序同上。反應(yīng)結(jié)束，用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，結(jié)果如圖16所示圖16為重 組表達(dá)載體pET-28a-nirS的菌落PCR電泳檢測圖(泳道M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn))泳道1、3、 6、8在257bp處無條帶，證明這4個(gè)重組子中未插入目的片段。而泳道2、4、5、7在257bp處 各有一條清晰條帶，初步證明這4個(gè)重組子中插入了 nirS片段。采用AxyGEN公司的AxyPr印Plasmid Miniprep Kit對PCR檢測中初步證明插入 目的片段的重組子進(jìn)行質(zhì)粒提取。對質(zhì)粒DNA作限制性內(nèi)切酶雙酶切(Nde I和BamHI)，酶 切體系20uL，混合液置于37°C反應(yīng)3h。反應(yīng)結(jié)束后，對酶切產(chǎn)物進(jìn)行的瓊脂糖凝膠電 泳，觀察酶切片段的位置和大小。結(jié)果如圖17所示圖17為重組表達(dá)載體pET-28a-nirS 的酶切鑒定結(jié)果(泳道1、2為酶切產(chǎn)物，泳道Ml、M2為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn))泳道2在257bp 和5000bp處各有一條清晰條帶，分別對應(yīng)于目的片段nirS和表達(dá)載體pET-28a-c (+)，進(jìn)一 步證明這個(gè)重組子中插入目的片段，表達(dá)載體pET-28a-nirS構(gòu)建成功。PCR和酶切鑒定都 正確的重組子鑒定為陽性重組子，命名為大腸埃希氏菌pET-28a-nirSJM109。(三)重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS_E. coli BL 21的構(gòu)建采用AxyGEN公司的AxyPr印Plasmid Miniprep Kit提取大腸埃希氏菌 pET-28a-nirS JM109 的質(zhì)粒 DNA。取質(zhì)粒 DNA 8uL 加于 IOOuL E. coli BL 21 感受態(tài)細(xì)胞 中，用移液槍吹打均勻，冰浴30min。42°C下熱激90s，立即放回冰浴中5min。加入LB液體 lmL，混勻，37°C下200rpm培養(yǎng)lh，使細(xì)胞復(fù)蘇。取200uL轉(zhuǎn)化的細(xì)菌液涂布于50mg/L含有 Kna的LB抗性平板上37°C下培養(yǎng)過夜進(jìn)行篩選。挑取抗生素平板上的單菌落接入5mL含 50mg/L Kna的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、200rpm培養(yǎng)過夜。次日，采用上述相同的菌落PCR 及酶切驗(yàn)證方法鑒定陽性轉(zhuǎn)化子。圖18為重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E. coliBL 21 的菌落PCR電泳檢測圖(泳道M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn))。泳道7在257bp出沒有出現(xiàn)條帶， 說明該轉(zhuǎn)化子中未轉(zhuǎn)入重組表達(dá)載體pET-28a-nirS。而泳道1、2、3、4、5、6在257bp出有 一條清晰條帶，初步證明這6個(gè)轉(zhuǎn)化子中轉(zhuǎn)入了重組表達(dá)載體pET-28a-nirS。圖19為重 組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E. coli BL21的酶切鑒定結(jié)果(泳道1、2為酶切產(chǎn)物，泳 道M1、M2為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn))。泳道1在257bp和5000bp處各有一條清晰條帶，分別對應(yīng)于目的片段nirS和表達(dá)載體pET-28a-c (+)，進(jìn)一步證明該轉(zhuǎn)化子中轉(zhuǎn)入了重組表達(dá)載體 pET-28a-nirS。PCR和酶切結(jié)果都正確的轉(zhuǎn)化子鑒定重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS_E. coli BL 21，即具有亞硝酸鹽去除功能的非致病性工程菌。(四)nirS基因在E.coli BL 21中表達(dá)的檢測1、目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)從含有50mg/l Kna的LB固體平板上挑取重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS_E. coli BL 21菌落接入5mL含有50mg/L Kna的LB液體培養(yǎng)基中，200rpm、37°C培養(yǎng)12_16h 后，4°C靜置過夜，接入新鮮的50mg/L Kna的LB培養(yǎng)基中，200rpm振蕩培養(yǎng)。當(dāng)菌體生長至 對數(shù)期時(shí)加入IPTG至終濃度為0. 7mmol/L,然后繼續(xù)培養(yǎng)2. 5h，離心收集菌體。裂解細(xì)胞 后，以SDS-PAGE分析胞內(nèi)總蛋白。2、SDS-PAGE 分析將上述所提蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測，方法如下1)配制10%的分離膠，5%的濃縮膠；2)待測樣品于99°C加熱處理5min ；3)各取 20ul樣品上樣；4)起始電壓80V，待樣品跑過濃縮膠后，加壓至150V，溴酚蘭到達(dá)底部邊緣 停止電泳；5)剝下膠塊，于10%三氯乙酸中固定Ih ；6)將膠塊置于0. 05%卡馬斯亮藍(lán)染色 液中染色過夜；7)用脫色液輕微震蕩脫色至背景干凈，條帶清晰。結(jié)果如圖20所示圖20為重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E. coli BL 21表 達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳圖(泳道1為未誘導(dǎo)時(shí)的重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E. coli BL 21蛋白，泳道2為誘導(dǎo)2h的重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E. coli BL 21蛋 白，泳道3為誘導(dǎo)4h的重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E. coli BL 21蛋白，泳道M為蛋 白電泳標(biāo)準(zhǔn)分子量)泳道2和3中，在約58kDa附近處有一非常明顯的特異性蛋白條帶， 其分子量大小與nirS基因分子量的理論預(yù)測值相符，說明nirS基因在重組大腸埃希氏菌 pET-28a-nirS-E. coli BL 21 中的到了表達(dá)。3、重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E. coli BL 21的亞硝酸鹽去除能力測定亞硝酸鹽去除能力測試培養(yǎng)基(g/L)=NaNO2 0. 097g, NH4Cl 0. 246g，MgS04 · 7H20 0. 039g, CaCl2 0. 055g，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0. 010g，CuSO4 · 5H20 0. 000024g, K2HPO4 13. 908g, KH2PO4 5. 304g，瓊脂20g(固體培養(yǎng)基中)。以上各化合物溶于IL蒸餾水中，用NaOH或HCl調(diào)節(jié)溶 液PH值至7. 0-7. 5，分裝后滅菌。冷卻后在無菌條件下加入適量的滅菌葡萄糖母液，使得葡 萄糖終濃度為3. 96g/L。將重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E. coli BL 21接入含有50mg/L Kna的LB 液體培養(yǎng)基中，30°C振蕩培養(yǎng)過夜。菌株生長至對數(shù)期時(shí)，取出適量菌液，12000rpm離心 5min，收集菌體。從每個(gè)管中取出適量菌液，12000rpm離心5min，收集菌體。用無菌水清洗 3次后再離心收集菌體。取適量菌體接入IOOmL亞硝酸鹽去除能力測試培養(yǎng)基中，使OD6tltl = 0. 9左右。同時(shí)在培養(yǎng)基內(nèi)加入IPTG至濃度0. 7mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)，200rpm、37°C培養(yǎng)16h。 每隔ih取樣，測定樣品中亞硝酸鹽含量。亞硝酸鹽含量測試方法為Ν-α-萘基)-乙二胺 光度法(國家環(huán)境保護(hù)總局，《水和廢水監(jiān)測分析方法》編委會(huì)編(2002)，水和廢水監(jiān)測分 析方法(第四版)，中國環(huán)境科學(xué)出版社)。本測試中設(shè)置5個(gè)對照組，對照1為施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)，對照 2為未加入IPTG誘導(dǎo)的重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E. coli BL 21，對照3為含有空的
22載體質(zhì)粒pET-28a(+)E. coli BL 21菌株，對照4為不攜帶質(zhì)粒的表達(dá)宿主菌株Ε. coli BL 21，對照5不投加任何菌體。分別測試了上述5個(gè)對照組的亞硝酸鹽去除效果，測試方法與 上述基本相同，不同之處培養(yǎng)基中不用加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。此外，除未加入IPTG誘導(dǎo)的重 組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E. coli BL 21及含有空的載體質(zhì)粒pET_28a(+)Ε. coli BL 21菌株的培養(yǎng)基中要加入Kna至終濃度50mg/L外，其他菌株的培養(yǎng)基中均不用加入Kna。測定結(jié)果如圖21所示圖21為重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E. coli BL21的 亞硝酸鹽去除能力測定結(jié)果(■為誘導(dǎo)的重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E. coli BL 21 樣品中亞硝酸鹽含量變化曲線， 為未誘導(dǎo)的重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E. coli BL 21樣品中亞硝酸鹽含量變化曲線，*為施氏假單胞菌樣品中亞硝酸鹽含量變化曲線，▲為 未插入目標(biāo)片段的表達(dá)宿主菌BL 21樣品中亞硝酸鹽含量變化曲線，-為未投加菌株樣品 中亞硝酸鹽含量變化曲線)可以看出，誘導(dǎo)的重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E.C0li BL 21、未誘導(dǎo)的重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E. coli BL 21均表現(xiàn)出非常好的亞硝酸鹽 去除能力。(五)重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-Ecoli BL 21對實(shí)際水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水及模 擬水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水的處理效果1)將重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E. coli BL 21菌株活化；2)將活化后的 菌株接入含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，30°C振蕩培養(yǎng)過夜；3)從管中取出適量菌液， 12000rpm離心5min，收集菌體。用無菌水清洗3次后重懸。將菌株懸液接入IOOmL實(shí)際及模 擬的水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水中，使0D_ = 0. 9左右；4)每隔Ih取樣，測定樣品中亞硝酸鹽、氨氮、硝酸 鹽含量及上清中總氮含量。所有樣品均設(shè)置3個(gè)重復(fù)，以不接菌的培養(yǎng)基為空白對照。實(shí)際水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水中氨氮含量為4. 517mg/L,亞硝酸鹽含量為1. 126mg/L,硝酸鹽含 量為9. 016mg/L,總氮含量為19. 145mg/L。外源添加葡萄糖調(diào)整高錳酸鉀指數(shù)(potassium permanganate index,簡稱 CODtfa)至 80mg/L 左右，加入 IPTG 至濃度 0. 7mmol/L。模擬水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水中含有的氨氮，亞硝酸鹽，硝酸鹽，總氮含量為實(shí)際水產(chǎn)養(yǎng)殖 廢水的4倍左右，具體為氨氮16. 817mg/L,亞硝酸鹽5. 018mg/L,硝酸鹽46. 167mg/L,總氮 73. 817mg/L。外源添加添加葡萄糖調(diào)整CODtfa至320mg/L左右，加入IPTG至濃度0. 7mmol/L。結(jié)果見圖22、23所示，圖22為重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E. coli BL21對模 擬水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水的處理過程中氨氮(口 )、亞硝酸鹽(*)、硝酸鹽(+)、及上清中總氮(■) 含量的變化曲線，圖23為重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E. coli BL 21對實(shí)際水產(chǎn)養(yǎng)殖 廢水的處理過程中氨氮(口)、亞硝酸鹽(*)、硝酸鹽(+)、及上清中總氮(■)含量的變化 曲線?？梢钥闯觯斗帕酥亟M大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E. coli BL 21的養(yǎng)殖水體中亞 硝酸鹽濃度呈下降趨勢，說明重組大腸埃希氏菌pET-28a-nirS-E. coli BL 21對含有高濃 度亞硝酸鹽的模擬和實(shí)際水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水具有較好的處理效果。
權(quán)利要求
一種具有亞硝酸鹽去除能力的非致病性工程菌，其特征在于所述工程菌的保藏編號(hào)為CGMCC No.3626；所述工程菌由重組質(zhì)粒和宿主菌組成，重組質(zhì)粒指的是連有nirS基因的重組pET載體，宿主菌指的是pET系統(tǒng)非致病性宿主菌。
2.一種權(quán)利要求1所述的具有亞硝酸鹽去除能力的非致病性工程菌的構(gòu)建方法，包括 如下步驟1)按如下方法進(jìn)行nirS基因的TA克隆設(shè)計(jì)nirS基因PCR反應(yīng)擴(kuò)增所需的引物，在上游引物和下游引物的5’端分別加入限 制性酶切位點(diǎn)；以含有cdl-NiRs的條件性致病菌的基因組為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增得到目的片段， 該目的片段經(jīng)純化后首先與T克隆載體進(jìn)行連接，后再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入克隆宿主菌中挑取 陽性克隆子進(jìn)行測序以驗(yàn)證目的片段是否得到正確擴(kuò)增，對目的片段擴(kuò)增正確的陽性克隆 子進(jìn)行雙酶切，回收目的片段；2)按以下方法構(gòu)建連有nirS基因的重組PET表達(dá)載體將步驟1)回收得到的目的片段首先與含有限制性酶切位點(diǎn)的PET表達(dá)載體進(jìn)行連接， 后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入克隆宿主菌中挑取陽性重組子，從所述陽性重組子中提取重組質(zhì)粒，該 重組質(zhì)粒為連有nirS基因的重組PET表達(dá)載體；3)按以下方法構(gòu)建所述非致病性工程菌將步驟2)得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入pET系統(tǒng)非致病性宿主菌中，挑取陽性轉(zhuǎn)化子得到重組 菌株，該重組菌株為所述非致病性工程菌。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種具有亞硝酸鹽去除功能的非致病性工程菌及其構(gòu)建方法。所述工程菌由重組質(zhì)粒和宿主菌組成，重組質(zhì)粒指的是連有nirS基因的重組pET載體，宿主菌指的是pET系統(tǒng)非致病性宿主菌。本發(fā)明是將含有cd1-NiRs的條件性致病菌中的nirS基因插入pET表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)處，將構(gòu)建的重組質(zhì)粒導(dǎo)入pET系統(tǒng)非致病性宿主菌中獲得重組菌株，培養(yǎng)重組菌株使nirS基因得到表達(dá)。本發(fā)明構(gòu)建的非致病性工程菌對于水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水中的亞硝酸鹽具有非常好的處理效果。該工程菌在對水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水的處理中，無需加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)即可有很好的亞硝酸鹽去除效果，大大簡化了操作的步驟和處理的成本，具有重要的實(shí)際意義和廣闊的開發(fā)前景。
文檔編號(hào)C12N1/21GK101914480SQ20101022495
公開日2010年12月15日 申請日期2010年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月9日
發(fā)明者呂鎮(zhèn)梅, 趙詣, 閔航 申請人:浙江大學(xué)