專利名稱：一種檢測mlh1基因突變的方法及其試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于分子生物學和醫(yī)學領域。涉及人MLHl基因的突變及其用途。具體涉及人MLHl基因(MLHlgene)的突變(Mutations)及其與遺傳性非息肉性結直腸癌(HNPCC) 相關性的檢測。
背景技術：
“結直腸癌"(CRC)在腫瘤中向來有"富貴病"之稱，表明其與人們的生活習慣有著密切的聯(lián)系。在上海，隨著生活水平的提高，結直腸癌的發(fā)病率已躍居常見惡性腫瘤的第二位，僅次于肺癌。據(jù)復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院資料統(tǒng)計，近幾年結直腸癌手術量連年攀升，2007年該院結直腸癌手術量近900例，2008年已突破千例，達到了 1027例。遺傳性非息肉性結直腸癌(HNPCC)，又稱為林奇綜合癥，是一種常染色體顯性遺傳性疾病，約占結直腸癌的 5% [Umar A, Risinger JI, Hawk ET, Barrett JC. Testing guidelines for hereditary non-polyposis colorectal cancer[J]. Nat Rev Cancer 2004；4 :153-8], 外顯率高達80%-90%。HNPCC是由DNA錯配修復基因(MMR)突變引起的，主要發(fā)生在 MLHl, MSH2 和 MSH6,比較少的發(fā)生在 PMSl 和 PMS2 中[Peltomaki P, Vasen HF. Mutations predisposing to hereditary nonpolyposis colorectal cancer :Database and results of a collaborative study—The International Collaborative Group on Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer [J]. Gastroenterology 113:1146-1158,1997]。目前， 用于篩選HNPCC的方法盡管較多，但只有檢測出胚系(germline)的MMR基因病理性突變才能確診為 HNPCC 患者[Cai Q, Sun MH, Fu G, et al. Mutation investigation of h MLHl and hMSH2 genes in hereditary nonpolyposis colon cancer families from China[J]. J Chin Pathol，2003，32 :323-328.]。HNPCC無論是在治療措施上還是在隨訪方案上均與散發(fā)性結直腸癌者不同， Syngal S等研究發(fā)現(xiàn)，HNPCC腫瘤對常用化療藥如5-氟尿嘧啶(5-FU)等有耐藥反應[De Vos Tot NederveenCappel WH, Meulenbeld HJ, Kleibeuker JH et al. Survival after adjuvant 5-FU treatment for stage III colon cancer in hereditary nonpolyposis colorectal cancer [J], Internal J Cancer 2004:109:468-471·]。因此 HNPCC 患者的確診對于選擇合適的治療方案、確定隨訪時間及間隔、判斷預后，以及對家族成員進行二級預防等具有重要意義[Liu SR, Zhao B, Wang Z J, et al. Cl inical features and mismatch repair gene mutation screening in Chinese patients with hereditary nonpolyposis colorectal carcinoma. World J Gastroenterol，2004，10 :2647-2651.]。對于已發(fā)現(xiàn)存在遺傳性錯配修復基因突變的患者，可以密切監(jiān)測異時多原發(fā)癌和其他HNPCC相關腫瘤的發(fā)生，并對其家族中的其他成員，特別是尚未出現(xiàn)腫瘤的年輕成員進行相應檢測，確認突變基因攜帶者，不但有助于對癌癥易感個體重點進行臨床監(jiān)測和臨床癥狀出現(xiàn)前的早期診斷， 也可為遺傳咨詢和基因治療提供依據(jù)，并可使非突變攜帶者免除不必要的精神和經濟負擔，對基因突變攜帶者，可以進行密切隨訪，以做到早期診斷，早期治療。
與HNPCC致病密切相關的錯配修復基因中，MLHl基因位于3p21_23，其突變率是所有相關基因中最高的。全球范圍內對于MMR突變的研究很多，可是中國對此的研究很少。 在所有的突變研究中，迄今為止，尚沒有與本發(fā)明內容相似的報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供檢測HNPCC易感基因突變情況的方法、試劑盒及其用途。尤其是人 MLHl 基因(c. -64G > T, c. 157_160delGAGG, c. 2159insG)在檢測 HNPCC 及早期診斷 HNPCC家系中的用途。本發(fā)明中，MLHl基因c. 157_160delGAGG(蛋白質氨基酸位置52Glu/Ala并在一個氨基酸之后終止)，c. 2159insG (蛋白質氨基酸位置720Vla/Gly并在兩個氨基酸之后終止) 均為移碼突變，為病理性突變可導致HNPCC的發(fā)生。c. -64G > T處于MLHl基因的啟動區(qū)域，為HNPCC易感位點。本發(fā)明所述的MLHl基因的詳細信息可參見OMIM號為*120436的基因(可參見網址http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)，該基因的詳細序列可參見GenBank號為27805154的基因(可參見網址 http //www. ncbi. nlm. nih. gov/)，全長是 60250bp。本發(fā)明對MLHl基因中的全19個外顯子及其接合位點，還有部分啟動區(qū)域進行了測序。圖1顯示了 MLHlc. -64G > T的測序結果，圖2顯示MLHlc. 157_160delGAGG的測序結果，圖3顯示MLHlc. 2159insG的測序結果。本發(fā)明提供了檢測樣品中是否存在MLHl基因突變方法，其思路為(a)用MLHl基因特異性引物擴增樣品的MLH119個外顯子及其接合位點，還有部分啟動區(qū)域；(b)檢測擴增產物中是否存在突變，包括堿基改變，插入及缺失。以及突變的類型和致病性分析。本發(fā)明提出了一種檢測MLHl基因突變的方法，首先，獲得樣品中MLHl基因的啟動區(qū)或者編碼區(qū)的DNA序列或者氨基酸序列，然后與正常MLHl基因的相應序列對比確定樣品中MLHl基因是否存在基因突變情況。所述的編碼區(qū)包括MLHl基因的第1號、第2號或者第19號外顯子。所述的突變即樣品MLHl基因與正常MLHl基因的相應序列不同。所述的突變包括 MLHlc. -64G > T、c. 157_160delGAGG 或者 c. 2159insG。所述的突變可以是 MLHlc. -64G > T、c. 157_160delGAGG 或者 c. 2159insG。所述的突變可以是 p. Glu53AlafsXl 或者 p.Val720GlyfsX2o本發(fā)明中，所述的c. -64G > T是指MLHl基因64位G — T，所述的 c. 157_160delGAGG 是指 157_160 位的 GAGG 缺失 4bp，所述的 c. 2159insG 是指 2159 位插入1個G ；所述的p. Glu53AlafsXl是指蛋白質氨基酸位置52Glu/Ala并在一個氨基酸之后終止，所述的P. Val720GlyfsX2是指蛋白質氨基酸位置720/VdGly并在兩個氨基酸之后終止。檢測時通常需要先獲得樣品的DNA。例如抽取待檢測者的血樣，提取DNA，然后，通過PCR (聚合酶鏈反應)大量擴增，再進行相應檢測。相應的，本發(fā)明還提供了一種檢測MLHl基因突變的試劑盒，該試劑盒含有下列三對引物序列中的一對或者幾對(1)擴增MLHl基因的第1號外顯子區(qū)的DNA序列的引物；(2)擴增MLHl基因的第2號外顯子區(qū)的DNA序列的引物；(3)擴增MLHl基因的第19號外顯子區(qū)的DNA序列的引物。擴增方法可以采用PCR(聚合酶鏈反應)。除非特別提出，可采用常規(guī)的試劑、設備和操作方法進行擴增。通過測序可以明確擴增產物的DNA序列，即樣品中MLHl基因相應位置的DNA序列。具體而言，該試劑盒含有如SEQ ID NO 1_6中任意一條或者幾條的引物。其中， SEQ IDNO 1和SEQ ID NO 2可用于擴增含有MLHl基因的第1號外顯子區(qū)的DNA序列；SEQ ID NO 3和SEQID NO 4可用于擴增含有MLHl基因的第2號外顯子區(qū)的DNA序列；SEQ ID NO 5和SEQID NO 6可用于擴增含有MLHl基因的第19號外顯子區(qū)的DNA序列。例如，該試劑盒含有序列如SEQ ID NO 5和6所示的引物；或者該試劑盒含有序列如SEQ ID NO 3和4所示的引物；或者該試劑盒含有序列如SEQ ID NO 1和2所示的引物。除了上述引物外，試劑盒中通常還可以含有緩沖液、PCR所需試劑、標準對照和說明書等。本發(fā)明還提供了上述檢測MLHl基因突變的方法的應用，即將該方法用于遺傳性非息肉性結直腸癌致病性分析，將該方法用于確定遺傳性非息肉性結直腸癌的患病風險。本發(fā)明中，檢測MLHl基因的三個突變的基因型也可用于診斷HNPCC。檢測針對基因組DNA。MLHl基因的以上三種基因型可用已有的技術如DNA序列分析、PCR、變性高效液相色譜分析(DHPLC)等檢測突變。本發(fā)明提供的檢測樣品中是否存在MLHl基因突變的方法，可用于對個體的HNPCC 易感性進行診斷，它包括步驟檢測該個體的MLHl基因編碼區(qū)、接合位點和部分啟動區(qū)域是否與普通人群存有差異，以此判斷該個體患HNPCC的風險是否高于普通人群，發(fā)生突變基因型的個體患HNPCC的風險顯著高于普通人群，應當進一步對其真?zhèn)€家族進行檢測以及保持隨訪監(jiān)測。本發(fā)明MLHl基因的突變可用于結直腸癌的個性化治療時的參考。使用本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的攜帶基因突變患者，即被判定為HNPCC患者，治療方案及用藥均與散發(fā)性結直腸癌患者不同。在使用本發(fā)明MLHl基因突變位點的同時，還可參考使用其他治療結直腸癌癥的藥劑。本發(fā)明的檢測方法簡便易行，成本低廉，高效快速，結果明了?？梢源蟠鬁p輕患者的負擔，盡早排除非HNPCC患者，為結直腸癌患者的用藥方案提供了參考。


圖1顯示了 MLHl基因啟動區(qū)域_64為G/T基因型的檢測結果。圖2顯示了 MLHl基因第2號外顯子157_160為缺失GAGG基因型的檢測結果。圖3顯示了 MLHl基因第19號外顯子2159插入1個G的基因型的檢測結果。
具體實施例方式實施例IMLHl基因突變檢測一、實驗材料
(一)·主要試劑PCR相關試劑=TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司高效，包括PCR擴增用 Taq DNA Polymerase, TaKaRa Code :DRR001A， TaKaRa Ex Taq(5U/μ 1)，10XEx Taq Buffer (Mg2+Plus)，dNTP Mixture (各2. 5mM)。引物上海生工生物工程技術服務有限公司合成。Marker 天根生化科技有限公司(Marker I)。純化試劑盒北京博大泰克生物基因技術有限責任公司，B型小量DNA片段快速膠回收試劑盒(100次)。(二)·重要儀器1. PCR 儀Eppendorf AG 2233 IHamburgeppendorf Mastercycler epgradient S220-240V 50_60Hz 800W2.離心機Eppendorf AG 2233IHamburgeppendorf Centrifuge 5415D230V 0. 8A 50-60Hz 180WMax speed 13200min_1Kinetic energy :3100Nm Max density of liquid
1. 2kg/dm33.漩渦振蕩混勻器其林貝爾儀器制造公司QL-901VorteX4.掌式離心機其林貝爾儀器制造公司LX-2005.微量加樣器印pendorf Research (0. 1-2. 5，1-10，2-20，10-100，20-200， 50-1000 μ 1)6.電子天平北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司TE212-L Max 210g d = 0. Olg7.電泳儀上海申能博彩生物科技有限公司PowerBC 300H1A二、引物設計與合成以MLHl基因19個外顯子全序列為模板，使用I^rimer Permier 5.0軟件分析引物， 并由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。具體引物信息見表1。表 權利要求
1.一種檢測MLHl基因突變的方法，其特征在于，該方法是獲得樣品中MLHl基因的啟動區(qū)或者第2號或者第19號外顯子的DNA序列或者氨基酸序列，然后與正常MLHl基因的相應序列對比確定樣品中MLHl基因是否存在基因突變情況。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的突變是樣品MLHl基因與正常MLHl基因的DNA序列中64、157-160或者2159位不同。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的突變是c.15716_0delGAGG或者 c.2159insG。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的突變是樣品MLHl基因與正常MLHl基因的相應氨基酸序列中53或者720位不同。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的突變是p.Glu53AlafSXl或者 p.Val720GlyfsX2o
6.一種檢測檢測MLHl基因突變的試劑盒，其特征在于，該試劑盒含有下列三對引物序列中的一對或者幾對(1)擴增MLHl基因的第1號外顯子區(qū)的DNA序列的引物；(2)擴增MLHl基因的第2號外顯子區(qū)的DNA序列的引物；(3)擴增MLHl基因的第19號外顯子區(qū)的DNA序列的引物。
7.如權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒含有序列如SEQID NO 5和6所示的引物。
8.如權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒含有序列如SEQID NO 3和4所示的引物。
9.權利要求1所述的方法的應用，其特征在于，將該方法用于遺傳性非息肉性結直腸癌的致病性分析。
10.權利要求1所述的方法的應用，其特征在于，將該方法用于確定遺傳性非息肉性結直腸癌的患病風險。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學和醫(yī)學領域。本發(fā)明提供了一種檢測MLH1基因突變的方法首先，獲得樣品中MLH1基因的啟動區(qū)或者編碼區(qū)的DNA序列或者氨基酸序列，然后與正常MLH1基因的相應序列對比確定樣品中MLH1基因是否存在基因突變情況；所述的編碼區(qū)是MLH1基因的第1號、第2號或者第19號外顯子。本發(fā)明還提供了相應的檢測MLH1基因突變的試劑盒以及該方法在確定遺傳性非息肉性結直腸癌致病患者方面的應用。本發(fā)明的檢測方法簡便易行，成本低廉，高效快速，結果明了?？梢源蟠鬁p輕患者的負擔，盡早排除非HNPCC患者，為結直腸癌患者的用藥方案提供了參考。
文檔編號C12Q1/68GK102296105SQ201010212048
公開日2011年12月28日 申請日期2010年6月25日 優(yōu)先權日2010年6月25日
發(fā)明者劉方奇, 劉雷, 南蓬, 徐燁, 韋雯倩 申請人:復旦大學, 復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院