專利名稱：基因phyb在控制水稻干旱脅迫耐性中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種控制水稻干旱脅迫耐性的基因 PHYB的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
干旱已是世界性的問(wèn)題，世界干旱、半干旱地區(qū)已占陸地面積的1/3以上，干旱對(duì) 植物的影響在諸多自然逆境因素中占首位。旱災(zāi)造成的糧食損失要占全部自然災(zāi)害糧食 損失的一半以上。國(guó)務(wù)院第二次全國(guó)農(nóng)業(yè)普查領(lǐng)導(dǎo)小組辦公室、國(guó)土資源部和國(guó)家統(tǒng)計(jì)局 2008年2月29日發(fā)布第二次全國(guó)農(nóng)業(yè)普查主要數(shù)據(jù)公報(bào)(第六號(hào))顯示，截至2006年10 月31日，全國(guó)耕地面積一半以上是旱地。在自然條件下，干旱脅迫不僅嚴(yán)重影響了作物生 長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量，而且限制了植物的分布。因此培育高抗農(nóng)作物新品種成了一個(gè)高度緊迫的 重大問(wèn)題。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基因工程已成為當(dāng)今種質(zhì)資源創(chuàng)新和改良的強(qiáng)有 力的武器。水稻是世界第一大糧食作物，解決了全世界大約一半以上人口的吃飯問(wèn)題。然而 干旱也嚴(yán)重地影響著水稻的種植和生產(chǎn)，在我國(guó)，僅2001年華北、西北和東北地區(qū)的466. 7 萬(wàn)hm2稻田種植面積就因?yàn)槿彼鴾p少了 53. 3萬(wàn)hm2。此外，水稻生產(chǎn)直接受到水資源分 布的影響，我國(guó)大部分地區(qū)耕地是干旱和半干旱地區(qū)，因此水資源的缺乏和水稻需水量大 的矛盾嚴(yán)重影響水稻種植面積的推廣。目前用于抗旱基因工程的基因主要包括以下幾類。第一，參與滲透保護(hù)物質(zhì)(如 脯氨酸、甘露醇、甜菜堿、海藻糖等)合成的基因。這樣能夠使植物在水分脅迫下能合成 更多的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，以提高植物的滲透調(diào)節(jié)能力，從而增強(qiáng)植物的抗旱性。如在水稻中 過(guò)量表達(dá)脯氨酸生物合成途徑上的關(guān)鍵酶基因(P5CS，deltal-pyrroline-5-carboxylate synthase)提高了轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性(Zhu等，Plant Sci，1998，199 :41_48)；第二，與清 除活性氧相關(guān)的基因。這類基因的表達(dá)增強(qiáng)植物對(duì)活性氧自由基的清除能力，使植物在水 分脅迫下過(guò)量表達(dá)一些酶(如SOD，POD, CAT等)，以有效地排除有害的活性氧自由基，從 而提高細(xì)胞耐脫水的能力。這類基因在水稻中的應(yīng)用未見報(bào)道；第三，編碼晚期胚胎富含 蛋白(LEA)的基因。推測(cè)LEA蛋白可能有以下三方面的作用①作為脫水保護(hù)劑，由于LEA 蛋白在結(jié)構(gòu)上富含不帶電荷的親水氨基酸，它們既能像脯氨酸那樣，通過(guò)與細(xì)胞內(nèi)的其他 蛋白發(fā)生相互作用，使其結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定，又可能給細(xì)胞內(nèi)的束縛水提供了一個(gè)結(jié)合的襯質(zhì)， 從而使細(xì)胞結(jié)構(gòu)在脫水中不致遭受更大的破壞。②作為一種調(diào)節(jié)蛋白而參與植物滲透調(diào) 節(jié)。③通過(guò)與核酸結(jié)合而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)其它基因的表達(dá)。如在水稻中組成型地過(guò)量表達(dá)大麥 的HVAl基因，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株耐旱性增強(qiáng)(Xu等，Plant Physiol, 1996,110 249-257)；第 四，調(diào)控基因。這類基因包括與ABA途徑相關(guān)的基因，包括ABA生物代謝相關(guān)基因(如NCED 和ABAox)及ABA信號(hào)傳導(dǎo)途徑相關(guān)的基因(如編碼bZIP類、Myb類、zinc-finger類轉(zhuǎn) 錄因子的基因)。最近多個(gè)bZIP類轉(zhuǎn)錄因子被證明影響水稻干旱脅迫耐性，如0sbZIP23、 0sbZIP72 和 TRABl 等(Xiang 等，PlantPhysiol，2008，148 :1938_1952 ；Lu 等，Planta，2009， 229 :605-615 ;Hobo 等，Proc Natl AcadSci USA，1999，96 :15348_15353)。其它的調(diào)控基因
3如 SNACl 和 OsSKIPa 也參與水稻干旱脅迫耐性(Hu 等，Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 35 12987-12992 ；Hou 等，Proc Natl AcadSci USA, 2009,106 :6410_6415)。特別是 OsSKIPa 過(guò) 量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因水稻植株不僅提高了清除活性氧的能力，而且許多脅迫相關(guān)基因(SNAC1、 CBF2、PP2C和RD22)轉(zhuǎn)錄水平也提高。由于人們對(duì)植物抗旱的分子機(jī)制缺乏了解，抗旱分子育種還有很大的盲目性。而 且水稻抗旱作用是眾多抗旱基因共同表達(dá)的結(jié)果，采用單基因策略提高植物的抗旱性在實(shí) 際生產(chǎn)應(yīng)用中效果不明顯，如果改變一個(gè)基因的表達(dá)能夠整體調(diào)控植物耐旱反應(yīng)能力，那 將是一個(gè)理想的選擇。光敏色素(phytochrome，phy)是植物體內(nèi)的一種重要光受體，主要感受紅光和遠(yuǎn) 紅光，參與調(diào)節(jié)植物生命循環(huán)中多個(gè)重要發(fā)育過(guò)程(Bae和Choi，Armu Rev Plant Biol, 2008,59 :281-311)。高等植物的光敏色素由一個(gè)小基因家族編碼，在擬南芥中光敏色素基 因家族由 5 個(gè)成員(PHYA-PHYE)組成(Sharrock 和 Quail，Genes Dev, 1989,3 :1745_1757 ； Clack等，PlantMol Biol，1994，25 :413_427·)。水稻光敏色素基因家族包括3個(gè)成員 PHYA、PHYB 和 PHYC (Kay 等，Nucleic Acids Res, 1989，17 :2865_2866 ；Dehesh 等，Mol Gen Genet, 1991,225 :305_313)。圖位克隆和全基因組序列檢索顯示，PHYA、PHYB和PHYC位于 水稻的第3染色體，其中PHYB基因位于短臂，在基因組中以單拷貝形式存在。Takano等人 的研究表明水稻PHYB感受紅光調(diào)節(jié)水稻幼苗去黃花、幼苗葉片與葉鞘之間的角度和花期 等水稻的生長(zhǎng)發(fā)育(Takano 等，Plant Cell, 2005，17 :3311_3325)。本發(fā)明在水稻日本晴中，降低編碼水稻光敏色素B的PHYB基因的表達(dá)水平，顯著 提高了水稻干旱脅迫耐性。因此，在水稻中抑制PHYB基因的表達(dá)對(duì)于提高水稻干旱脅迫耐 性具有重要意義，這為水稻的高抗旱性育種提供新的思路。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有的技術(shù)缺陷，提供了一種提高水稻干旱脅迫耐性的基 因PHYB的應(yīng)用。基因PHYB在提高水稻干旱脅迫耐性中的用途，在水稻中利用反義技術(shù)降 低PHYB基因的表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的干旱脅迫耐性提高。在干旱條件下，對(duì)照組 水稻幼苗的存活率為百分之五至百分之十，轉(zhuǎn)反義PHYB基因的轉(zhuǎn)基因植株的存活率為百 分之七十以上。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明利用水稻PHYB基因的cDNA片段作為應(yīng)用基因，將該基因反向轉(zhuǎn)入水稻日 本晴中，抑制水稻PHYB基因的表達(dá)，轉(zhuǎn)基因水稻植株表現(xiàn)出較強(qiáng)的干旱脅迫耐性。申請(qǐng)人:在 NCBI 網(wǎng)站(www. ncbi. nlm. nih. gov)上輸入“phytochrome B”和“Oryza sativa”，得到序列號(hào)為AB109892的編碼水稻光敏色素B的基因的信使RNA序列。水稻PHYB 基因信使RNA序列為4223個(gè)堿基，編碼1171個(gè)氨基酸。本發(fā)明是通過(guò)PCR方法，擴(kuò)增出水 稻PHYB基因的全長(zhǎng)編碼區(qū)，包含3516個(gè)堿基，反向連接在植物表達(dá)載體ρIGl2 lHm-8上。再 進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化至水稻品種日本晴中，抑制水稻內(nèi)源PHYB基因的表達(dá)，得到水稻PHYB基因表 達(dá)受到抑制的轉(zhuǎn)基因植株。在轉(zhuǎn)基因的T3代植株中發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)性水稻植株的干旱脅迫耐性明 顯高于陰性植株。 本發(fā)明用于構(gòu)建反義PHYB基因植物表達(dá)載體、能夠抑制內(nèi)源PHYB基因表達(dá)的DNA序列如SEQ ID NO 1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于(1)本發(fā)明提供了一種提高水稻干旱脅迫耐性的基因PHYB的應(yīng)用。申請(qǐng)人在水 稻品種日本晴中，抑制水稻PHYB基因表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的干旱脅迫耐性明顯提 高。在同樣條件下失水和復(fù)水處理后，發(fā)現(xiàn)70%以上轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株能夠恢復(fù)正常生長(zhǎng)，而 對(duì)應(yīng)的野生型植株僅僅5% -10%恢復(fù)正常生長(zhǎng)。(2)本發(fā)明首次在水稻中抑制表達(dá)水稻PHYB基因。為培育高抗旱水稻品種提供了 新的思路，也為其它作物利用同源基因技術(shù)提高抗旱性提供了理論支持。(3)本發(fā)明中應(yīng)用的基因可以為水稻等禾谷類作物以及其它作物抗旱性研究提供 支持。


圖1為本發(fā)明的反義PHYB基因表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖。具體為把pIG121Hm 植物表達(dá)載體上的SacI位點(diǎn)替換成KpnI酶切位點(diǎn)，構(gòu)建成pIG121Hm-8植物表達(dá)載 體。將克隆在PMD18-T載體上的PHYB基因利用KpnI和XbaI酶切，替換pIG121Hm-8植 物表達(dá)載體上KpnI和XbaI之間的DNA片段，這樣PHYB基因反向插入35S啟動(dòng)子后，即 pIG121Hm-anti-PHYB 植物表達(dá)載體。圖2為用Western blot檢測(cè)T3代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株中PHYB蛋白質(zhì)的表達(dá)水平結(jié) 果圖。其中anti-PHYB表示轉(zhuǎn)反義PHYB基因的植株；1_6代表不同陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系。圖3為轉(zhuǎn)反義PHYB基因植株和野生植株的干旱脅迫耐性比較圖。其中anti-PHYB 表示轉(zhuǎn)反義PHYB基因的植株。圖4為轉(zhuǎn)反義PHYB基因植株和野生植株的根系長(zhǎng)度比較圖。其中anti-PHYB表 示轉(zhuǎn)反義PHYB基因的植株。圖5為轉(zhuǎn)反義PHYB基因植株和野生植株的氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率比較圖。其中 anti-PHYB表示轉(zhuǎn)反義PHYB基因的植株。A圖表示氣孔導(dǎo)度，B圖表示蒸騰速率。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例定義了本發(fā)明，并描述了本發(fā)明在分離克隆用于構(gòu)建反義PHYB基因 植物表達(dá)載體的DNA片段，以及驗(yàn)證功能的方法。根據(jù)以下的描述和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域技 術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對(duì)本 發(fā)明做出各種改變和修改，以使其使用不同的用途和條件。實(shí)施例1 分離克隆用于構(gòu)建反義PHYB基因植物表達(dá)載體的DNA片段采用TRIZOL試劑(Invitrogen)從水稻品種日本晴(公開報(bào)道的一個(gè)品種)的葉 片中提取總RNA。具體步驟如下將20毫克葉片放至液氮預(yù)冷的研缽中，加入液氮快速磨成 粉末，將粉術(shù)裝入1. 5ml離心管中，迅速加入Iml Trizol (Invitrogen)顛倒混勻，室溫靜置 5分鐘。在4°C，12000rpm離心10分鐘，取上清液移至新的1. 5ml離心管中。加入200 μ 1 氯仿，用手劇烈搖動(dòng)15秒鐘，室溫靜置2-3分鐘。4°C，12000rpm離心15分鐘。取無(wú)色水相 至一新的1. 5ml離心管中，加入250 μ 1異丙醇，250 μ 1高鹽溶液，顛倒混勻，室溫靜置10分 鐘。40C，12000rpm離心10分鐘，吸除上清液。加入Iml冰冷的75%乙醇，上下倒置幾次，然后4°C，7500rpm離心5分鐘，棄上清，在室溫干燥至沉淀變透明。加入適量的DEPC水(一 般為60 μ 1)溶解沉淀，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度。利用反轉(zhuǎn)錄酶SuperScript II (Invitrogen)將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，具體步驟如下 依次加入 1 μ 1 500 μ g/ml oligo (dT) 12-18,2μ g 總 RNA、1 μ 1 IOmM dNTP 混合物和 DEPC 水至12μ 1，在65°C水浴中5分鐘，迅速冰浴5分鐘，稍微離心收集樣品于管底。然后依次 加入 4μ1 5 X 第一鏈緩沖液、2 μ 1 0. IM DTTiPlyl RNaseOUT (40U/μ 1)，42°C，2 分鐘。 然后加入1 μ ISuperScript II，輕微混合均勻，42°C反應(yīng)50分鐘，然后70°C水浴15分鐘 使酶失活，這樣就合成了第一鏈cDNA，以第一鏈cDNA為模板擴(kuò)增目的基因。用帶有酶切 位點(diǎn)的上游引物 PHYBF(5’ -ATG GTA CCA TGG CCT CGG GTA GCC-3，(SEQ ID N0:3)，序列 特異引物外加KpnI位點(diǎn)和兩個(gè)保護(hù)堿基)和下游引物PHYBR(5’ -ATT CTA GAT CAG CTT GTC CCCCTAC-3，(SEQ ID NO :4)，序列特異引物外加X(jué)baI位點(diǎn)和兩個(gè)保護(hù)堿基)。利用 PrimerSTARHS DNA polymerase with GC buffer (TaKaRa)進(jìn)行擴(kuò)增目的片段，PCR 反應(yīng)條 件是94°C預(yù)變性1分鐘；98°C 10秒，68°C 4分鐘，30個(gè)循環(huán)。利用TArget Clone -Plus 試劑盒(Τ0Υ0Β0)在PCR產(chǎn)物末端加Α。然后連接到pMDIS-T載體(TaKaRa)。篩選陽(yáng)性克隆 并測(cè)序，獲得所需DNA片段(序列如SEQ ID NO 1所示)，將該克隆命名為pMD18_PHYBcDNA。實(shí)施例2 反義PHYB基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化為了能更好地分析PHYB的功能，申請(qǐng)人通過(guò)反義技術(shù)使PHYB基因在水稻中的表 達(dá)水平降低。根據(jù)轉(zhuǎn)基因植株的表型和生理特征研究該基因的功能。反義PHYB基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法如下首先將實(shí)施例1中得到的陽(yáng) 性克隆PMD18-PHYB cDNA用KpnI和XbaI雙酶切，回收插入片段；同樣，用同樣的方法 酶切pIG121Hm-8的植物表達(dá)載體，回收載體片段。用回收的插入片段和載體片段做連 接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLl-Blue。通過(guò)酶切篩選陽(yáng)性克隆，獲得植物表達(dá)載體，命名為 pIG121Hm-anti-PHYB(見圖1)。pIG121Hm_8是在國(guó)際常用的植物遺傳轉(zhuǎn)化載體pIG121Hm 基礎(chǔ)上，用KpnI酶切位點(diǎn)取代⑶S基因編碼區(qū)和終止區(qū)之間的SacI位點(diǎn)所得到的(見圖 1)。將 pIG121Hm-anti-PHYB 轉(zhuǎn)化至 EHA105 宿主菌。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系(參見本發(fā)明后面的實(shí)施例)將其導(dǎo)入到水 稻品種日本晴中，經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)、侵染、共培養(yǎng)、篩選具有潮霉素抗性的愈傷、分化、生根、移苗 得到轉(zhuǎn)基因植株。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系在Hiei等人報(bào)道的方法基礎(chǔ)上改良進(jìn) 行(Hiei等，Plant J，1994，6 :271_282)。轉(zhuǎn)化共獲得30株獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因水稻植株。具體步驟(1)愈傷誘導(dǎo)去殼的野生型日本晴水稻種子，用70%乙醇表面消毒1分鐘；5% (活性氯含量)NaClO溶液表面消毒20分鐘；無(wú)菌水沖洗4-5次；播種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基 (成分見后)，于25-26°C暗培養(yǎng)4-7天后，將從成熟胚盾片處誘導(dǎo)出初生愈傷組織，用鑷子 去掉胚上長(zhǎng)出的胚芽，繼代于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2周，直至長(zhǎng)出色澤淡黃，質(zhì)地堅(jiān)硬 呈顆粒狀的胚性愈傷組織。(2)愈傷組織的預(yù)培養(yǎng)將愈傷組織轉(zhuǎn)至新鮮的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基，于25-26°C暗培 養(yǎng)4天。(3)農(nóng)桿菌培養(yǎng)挑取農(nóng)桿菌單克隆接種到5ml YEP液體培養(yǎng)基中(含有50mg/L 卡那霉素、25mg/L鏈霉素和50mg/L潮霉素)，28°C，220rpm,培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)晚期(大約培養(yǎng)18-24小時(shí))。將獲得的菌液按接種量轉(zhuǎn)接到50ml新鮮的、含抗生素的AB液體培養(yǎng) 基中(成分見后)，28°C，220rpm,培養(yǎng)至0D600值為0. 5左右(大約培養(yǎng)5_6小時(shí))。(4)農(nóng)桿菌侵染把50ml菌液轉(zhuǎn)入離心管，4°C，4000g離心10分鐘，棄上清。加入 等體積的AAM培養(yǎng)基(成分見后)重懸菌體。把(2)的日本晴胚性愈傷組織浸入上述AAM 菌液，侵染2分鐘，緩慢搖動(dòng)。用無(wú)菌吸水紙將愈傷組織吸干，置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基(成分見 后)上(培養(yǎng)基上鋪一層無(wú)菌濾紙)，26°C，黑暗共培養(yǎng)2-3天。(5)愈傷洗滌和選擇培養(yǎng)共培養(yǎng)后的愈傷組織用無(wú)菌水洗4次，然后再用含 500mg/L羧芐青霉素Cb的無(wú)菌水洗2次，再用無(wú)菌吸水紙吸干后置于工作臺(tái)吹30分鐘。將 愈傷組織置于含有25mg/L潮霉素，400mg/L羧芐青霉素的固體篩選培養(yǎng)基(成分見后)上， 26°C暗培養(yǎng)2周。然后轉(zhuǎn)移到含有30mg/L潮霉素，300mg/L羧芐青霉素的固體篩選培養(yǎng)基 (成分見后)上，26°C暗培養(yǎng)，每2周繼代一次，篩選4周。(6)分化培養(yǎng)把抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基(成分見后)上，28°C光照培養(yǎng) 7天，轉(zhuǎn)接一次后，培養(yǎng)至產(chǎn)生再生苗。(7)壯苗、移栽將再生的小植株轉(zhuǎn)至新鮮的1/2MS培養(yǎng)基(成分見后)上，于培養(yǎng) 瓶中生根壯苗。待小苗長(zhǎng)至IOcm左右，打開封口膜，煉苗2-3天，將再生苗移至土中培養(yǎng)。試劑配方(1)試劑和溶液縮寫本發(fā)明中作用到的植物激素的縮寫表示如下 Cb (Cabenici 11 in，羧節(jié)青霉素)；KT(Kinetin，激動(dòng)素)；NAA (Napthalene acetic acid,萘乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid, 2,4- 二氯苯氧乙酸)； AS(Acetosyringone，乙酰丁香酮)；DMSO (Dimethyl sulfoxide，二甲基亞砜)。(2)用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基配方1)YEP液體培養(yǎng)基2g Bacto-蛋白胨，2g酵母粉，Ig NaCl，加水定容至200ml，用 5N NaOH 調(diào) PH 至 7. 0。2)愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基N6大量，N6微量，鐵鹽，N6維生素，0. 5g/L酸水解酪蛋白， 30g/L 蔗糖，2mg/L 2,4-D, Gelrite (Sigma) 4g/L, pH 5.8。3)AB 液體培養(yǎng)基3g/L K2HPO4, lg/L NaH2PO4, lg/L NH4Cl, 300mg/L MgSO4 · 7H20， 150mg/L KCl, lOmg/L CaCl2 · 2H20, 2. 5mg/L FeSO4 · 7Hx0，5g/L 葡萄糖，pH 7. 0。4) AAM培養(yǎng)基AA大量，AA微量，0. 9g/L L-谷氨酰胺，0. 3g天冬氨酸，MS維生素， 0. 5g/L 酸水解酪蛋白，36g/L 葡萄糖，68. 5g/L 蔗糖，20mg/L AS, pH 5.2。5)共培養(yǎng)培養(yǎng)基N6大量，N6微量，鐵鹽，N6維生素，30g/L蔗糖，10g/L葡萄糖， 0. 5g/L 酸水解酪蛋白，2mg/L 2,4-D, 20mg/LAS, Gelrite (Sigma) 4g/L, pH 5.8。6)固體篩選培養(yǎng)基N6大量、N6微量和N6維生素，0. 5g/L酸水解酪蛋白，30g/L 蔗糖，2mg/L 2,4-D, Gelrite (Sigma) 4g/L, pH 5. 8，合適濃度的潮霉素和羧芐青霉素。7)分化培養(yǎng)基MS大量，MS微量，鐵鹽和MS維生素，2g/L酸水解酪蛋白，30g/L蔗 糖，30g/L 山梨醇，2mg/L KT, 0. 2mg/L NAA, pH 5. 8，30mg/L 潮霉素 B，200mg/L 羧芐青霉素。8) 1/2MS 培養(yǎng)基:1/2MS 大量，1/2MS 微量，MS 維生素，30g/L 蔗糖，4g/L Gelrite， 30mg/L潮霉素B，200mg/L羧芐青霉素，pH 5. 8.(3)主要溶液配方1)N6 大量元素(IOX)
7
KNO328. 3gKH2PO44. OgMgSO4 · 7H201. 85gCaCl2 · 2H201. 66g(NH4) 2S044. 63g用水定容IL2)N6 微量(1000X)MnSO4 · 4H204. 400gZnSO4 · 7H201. 500gH3BO31. 600gKI0. 800gNaMoO4 · 2H200. 250g用水定容IL3) N6 維生素(1000 X)甘氨酸200mg鹽酸硫胺素BlIOOmg鹽酸吡哆素B650mg煙酸50mg肌醇IOg用水定容IOOml3)MS 大量元素(IOX)KNO319. OgNH4NO316. 5gKH2PO41. 7gMgSO4 · 7H203. 7gCaCl2 · 2H204. 4g用水定容IL4)MS 微量(1000X)MnSO4 · 4H2022. 300gZnSO4 · 7H208. 600gH3BO36. 200gKI0. 830gNaMoO4 · 2H200. 250gCuSO4 · 5H200. 025gCoCl2 · 6H200. 025g用水定容IL5) MS 維生素(1000X)甘氨酸2OOmg鹽酸硫胺素BlIOmg
80089]鹽酸吡哆素B650mg
0090]煙酸50mg
0091]肌醇IOg
0092]用水定容IOOml
0093]6)鐵鹽(200 X)
0094]FeSO4. 7H205. 56g
0095]Na2EDTA. 2H207. 46g
0096]7) AA 大量(200 X)
0097]MgSO4. 7H205g
0098]CaCl2 · 2H203g
0099]NaH2PO43g
0100]KCl60g
0101]8)AA 微量(1000X)
0102]MnSO4 ‘ H2O10. Og
0103]ZnSO4 · 7H202. Og
0104]H3BO33. Og
0105]KI0. 75g
0106]NaMoO4 ‘ H2O0. 250g
0107]CuSO4 · 5H200. 025g
0108]CoCl2 · 6H200. 025g
0109]用水定容IL9)2，4-0儲(chǔ)存液(211^/1111)稱取2，4-D lOOmg，溶于Iml DMSO，加入蒸餾水定溶至49ml，然后加入0. 5N NaOH， 至完全溶解，于-20°C保存。10) Kinetin 儲(chǔ)存液(0. 2mg/ml)稱取Kinetin 10mg，溶于Iml IN K0H，加蒸餾水定溶至50ml，于4°C保存。11)離八儲(chǔ)存液(0.211^/1111)稱取NAA 10mg，溶于0.5ml IN K0H，加蒸餾水定溶至50ml，于4°C保存。12)乙酰丁香酮(100mg/ml)稱取乙酰丁香酮lOOmg，溶于Iml DMS0，于_20°C保存。實(shí)施例3 檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻植株和野生型水稻的PHYB蛋白質(zhì)水平以水稻品種日本晴和5個(gè)獨(dú)立的T3代轉(zhuǎn)基因水稻植株為材料，提取5葉期水稻 葉片的可溶性蛋白質(zhì)，利用western blot檢測(cè)水稻葉片中PHYB蛋白質(zhì)水平。具體方法如 下；從上述材料收集Ig水稻葉片，在液氮中充分研磨，加入2ml蛋白質(zhì)提取緩沖液(IOOmM Tris-HCl，pH8. 3，5mM EDTA, 0. 2% β -巰基乙醇和蛋白酶抑制劑混合物)，混勻，在冰上放 置30分鐘。然后12000 Xg 4°C離心15分鐘。轉(zhuǎn)移上清液至另一管中，加入2/3體積的飽和 硫酸銨，混勻，冰上靜止30分鐘。12000Xg 4°C離心30分鐘。棄上清，沉淀用200 μ 1蛋白 質(zhì)提取緩沖液懸浮。利用 Coomassie PLUS Protein Assay Reagent (Pierce, Rockford, IL) 測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。利用10% SDS-PAGE進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳，每個(gè)上樣孔50 μ g蛋白質(zhì)。電泳結(jié)束后，通過(guò)印跡法轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Millip0re，Billerica，MA)。然后按照Takano等人的方法 進(jìn)行免疫化學(xué)分析，檢測(cè)PHYB蛋白質(zhì)水平(Takano等，Plant Cell, 2005,17 :3311_3325)。 結(jié)果表明，在6個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因水稻植株中，PHYB蛋白質(zhì)的水平都明顯低于野生型(見圖 2)。實(shí)施例4 轉(zhuǎn)反義PHYB基因植株具有較強(qiáng)的干旱脅迫耐性將轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株用70%乙醇表面消毒1分鐘；5% (活性氯含量) NaClO溶液表面消毒20分鐘；無(wú)菌水沖洗4-5次；播種于含有0. 4%的瓊脂培養(yǎng)基的玻璃 培養(yǎng)瓶。在光照培養(yǎng)箱(14小時(shí)光照，28°C ；10小時(shí)黑暗，23°C )生長(zhǎng)6天后，挑選生長(zhǎng)一 致的幼苗轉(zhuǎn)移至土中，在溫室中培養(yǎng)(自然條件)至4葉期，停止?jié)菜?0天，轉(zhuǎn)基因植株比 野生型更早出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象，至所有植株均出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象后，加水恢復(fù)5天后統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示， 70%的轉(zhuǎn)基因植株能夠恢復(fù)正常生長(zhǎng)，僅僅5. 7%野生型能夠恢復(fù)正常生長(zhǎng)(如圖3)。相 同實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果表明，發(fā)現(xiàn)70%以上轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株能夠恢復(fù)正常生長(zhǎng)，而對(duì)應(yīng)的野 生型植株僅僅5% -10%恢復(fù)正常生長(zhǎng)。實(shí)施例5 轉(zhuǎn)反義PHYB基因植株主根較長(zhǎng)本實(shí)施例將T3代轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株播種在0. 4%瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，以測(cè) 量主根長(zhǎng)度。具體步驟如下去殼的轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株用70%乙醇表面消毒1分鐘； 5% (活性氯含量)NaClO溶液表面消毒20分鐘；無(wú)菌水沖洗4_5次；播種于含有0. 4%的 瓊脂培養(yǎng)基的玻璃培養(yǎng)瓶。為了模擬土壤生長(zhǎng)條件，在播種后的種子上面加上一層無(wú)菌蛭 石，同時(shí)把培養(yǎng)瓶含有培養(yǎng)基的部分陷進(jìn)蛭石中，以保證根免受光照。在光照培養(yǎng)箱(14小 時(shí)光照，28°C ;10小時(shí)黑暗，23°C)生長(zhǎng)10天。測(cè)定主根長(zhǎng)度。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。結(jié)果 顯示，轉(zhuǎn)反義PHYB基因植株的主根明顯長(zhǎng)于野生型(圖4)。實(shí)施例6 轉(zhuǎn)反義PHYB基因植株蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度降低。本實(shí)施例測(cè)定了 5葉期野生型和轉(zhuǎn)反義PHYB基因植株的蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度。 具體步驟如下轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株用70%乙醇表面消毒1分鐘；5% (活性氯含量) NaClO溶液表面消毒20分鐘；無(wú)菌水沖洗4-5次，在暗條件下萌發(fā)3天。隨后轉(zhuǎn)移到土壤 中，在溫室中生長(zhǎng)至5葉期。采用美國(guó)便攜式光合儀(LI-COR LI-6400)于晴朗無(wú)風(fēng)的天氣， 上午9:30-11:00在強(qiáng)制光源(ΙδΟΟηπιοΙπ^ Γ1)下測(cè)定水稻野生型和轉(zhuǎn)反義PHYB基因植株 的第4片葉的氣孔導(dǎo)度(mol H2O Hi-2S-1)和蒸騰速率(mmol H2O. HT2iT1)。野生型和轉(zhuǎn)基因植 株分別測(cè)定至少5個(gè)植株，相同的實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)反義PHYB基因植株的氣孔 導(dǎo)度和蒸騰速率都顯著低于野生型(圖5)。實(shí)施例7 轉(zhuǎn)反義PHYB基因植株產(chǎn)量不會(huì)降低本實(shí)施例分析了大田中生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)反義PHYB基因株系和野生型的千粒重和穗數(shù)和 產(chǎn)量。具體步驟如下轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株用70%乙醇表面消毒1分鐘；5% (活性氯 含量)NaClO溶液表面消毒20分鐘；無(wú)菌水沖洗4-5次，在暗條件下萌發(fā)3天。隨后轉(zhuǎn)移到 土壤中生長(zhǎng)至3葉期，移栽至大田中，2個(gè)水稻植株之間的距離是30cm χ 30cm。收獲時(shí)分 析轉(zhuǎn)基因植株和野生型的每個(gè)植株上的有效穗數(shù)、每個(gè)穗的重量和千粒重。結(jié)果表明，這些 參數(shù)在野生型和轉(zhuǎn)基因植株之間沒(méi)有差異?？梢姳M管轉(zhuǎn)基因植株蒸騰速率降低，但是轉(zhuǎn)基 因植株的產(chǎn)量并沒(méi)受影響。
權(quán)利要求
基因PHYB在控制水稻干旱脅迫耐性中的應(yīng)用。
2.基因PHYB在控制水稻干旱脅迫耐性中的應(yīng)用方法，其特征是，通過(guò)PCR方法，擴(kuò)增出 水稻PHYB基因的全長(zhǎng)編碼區(qū)，反向連接在植物表達(dá)載體pIG121Hm-8上，再進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化至 水稻品種日本晴中，抑制水稻內(nèi)源PHYB基因的表達(dá)，得到水稻PHYB基因表達(dá)受到抑制的轉(zhuǎn)基因植株。
全文摘要
本發(fā)明公開了基因PHYB在控制水稻干旱脅迫耐性中的用途，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過(guò)PCR方法，擴(kuò)增出水稻PHYB基因的全長(zhǎng)編碼區(qū)，反向連接在植物表達(dá)載體pIG121Hm-8上，再進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化至水稻品種日本晴中，抑制水稻內(nèi)源PHYB基因的表達(dá)，得到水稻PHYB基因表達(dá)受到抑制的轉(zhuǎn)基因植株。在轉(zhuǎn)基因的T3代植株中發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)性水稻植株的干旱脅迫耐性明顯高于陰性植株在同樣條件下失水和復(fù)水處理后，發(fā)現(xiàn)70％以上轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株能夠恢復(fù)正常生長(zhǎng)，而對(duì)應(yīng)的野生型植株僅僅5％-10％恢復(fù)正常生長(zhǎng)。
文檔編號(hào)C12N15/82GK101899449SQ20101021202
公開日2010年12月1日 申請(qǐng)日期2010年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月29日
發(fā)明者劉婧, 周晉軍, 畢玉平, 范仲學(xué), 謝先芝, 錢鳳芹 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高新技術(shù)研究中心