馬鈴薯stu-miR4322及其篩選方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明專利涉及一種microRNA(miRNA)及其篩選方法和應(yīng)用，具體地說(shuō)是馬鈴薯stu-miR4322及其篩選方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]miRNA是一類非編碼的單鏈小分子RNA，長(zhǎng)約20 nt的內(nèi)源性非蛋白編碼RNAt3HiiRNA基因最初轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的pre-miRNAs。隨后pre-miRNA被轉(zhuǎn)運(yùn)出核，在細(xì)胞質(zhì)中被Dicer酶作用，加工成成熟的miRNA。通過(guò)序列互補(bǔ)與特定革E基因的mRNA結(jié)合，通常在轉(zhuǎn)錄后水平引起mRNA降解或抑制mRNA翻譯從而對(duì)基因的表達(dá)起到負(fù)調(diào)節(jié)作用。
[0003]干旱脅迫是最主要的非生物脅迫之一，其對(duì)農(nóng)作物的生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量造成極其嚴(yán)重的影響。據(jù)統(tǒng)計(jì)，地球上總土地面積的36%屬于缺水的干旱或半干早區(qū)域，我國(guó)干旱和半干早區(qū)域大約占國(guó)土地面積的1/2。即使在半濕潤(rùn)和濕潤(rùn)的農(nóng)業(yè)主產(chǎn)區(qū)，也通常會(huì)受到季節(jié)性和周期性的旱災(zāi)侵襲。干旱脅迫對(duì)農(nóng)作物產(chǎn)量、質(zhì)量的影響相當(dāng)于其余自然災(zāi)害之和，其危害性在各種自然逆境脅迫中占首位，僅次于病蟲(chóng)害對(duì)作物造成的損失。解決干旱問(wèn)題的途徑，除了節(jié)水灌溉來(lái)提高水分的利用效率之外，就是培育節(jié)水抗旱的新品種以提高作物自身抵御干旱的能力。要達(dá)到這一目的，必須了解作物響應(yīng)干旱脅迫的分子機(jī)制。因此，對(duì)作物抗旱機(jī)理的研究以探索提高作物抗旱能力是各國(guó)科學(xué)家關(guān)注的研究熱點(diǎn)問(wèn)題。尤其是近年來(lái)對(duì)擬南芥、水稻等模式植物的深入研究，已鑒定、克隆出大量耐旱相關(guān)的基因，已研究清楚了一些耐鹽相關(guān)的基因的調(diào)控模式。將抗旱、耐鹽基因通過(guò)基因工程的手段整合到目標(biāo)植物基因組中或有目的的抑制或誘導(dǎo)一些干旱相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)獲得轉(zhuǎn)基因植株，開(kāi)辟了培育高度抗旱性作物新品種的新途徑。隨著對(duì)植物抗旱機(jī)理的了解以及轉(zhuǎn)基因技術(shù)的日趨成熟，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)來(lái)獲得抗旱的育種材料或遺傳改良的新品種，已成為抗旱品種培育最具發(fā)展?jié)摿Φ姆较颉?br>[0004]干旱等非生物脅迫往往會(huì)產(chǎn)生共同的次生脅迫，如氧化脅迫，會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞的代謝不協(xié)調(diào)，細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化物的過(guò)度積累，過(guò)度積累的活性氧將會(huì)攻擊脂肪、核酸及蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，產(chǎn)生大量的無(wú)功能蛋白垃圾，對(duì)植物造成的次生傷害。在逆境條件下，植物為了維持正常的生命代謝穩(wěn)態(tài)，在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中已經(jīng)演化形成一套抵御逆境脅迫的作用機(jī)制。如APX是植物體內(nèi)最為主要的過(guò)氧化物清除酶之一，也被認(rèn)為是在葉綠體中清除H2O2的關(guān)鍵酶，有研究顯示，轉(zhuǎn)APX基因并過(guò)量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草和擬南芥都表現(xiàn)出對(duì)氧化脅迫更強(qiáng)的耐受能力；同時(shí)也有研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)APX的轉(zhuǎn)基因棉花具有較高的PSII光化學(xué)活性和較強(qiáng)的抗氧化能力，從而大大提高了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)逆境脅迫的適應(yīng)能力。這可能是由于APX過(guò)量表達(dá)會(huì)保護(hù)Cal vin循環(huán)防止了 AsA被氧化。另外，最近通過(guò)研究了缺失APX的突變體也進(jìn)一步證明了 APX在植物抵抗逆境脅迫中起著重要作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供馬鈴薯stu-miR4322的前體序列、stu-miR4322抑制靶基因表達(dá)以研究靶基因功能的應(yīng)用、stu-miR4322抑制靶基因表達(dá)提高植物抗旱能力，培育抗旱植物品種的應(yīng)用。
[0006]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下:
馬鈴薯stu-miR4322的前體序列如下(本發(fā)明中所列核苷酸序列均為5,—3'):ggguucgcuuggggccaguaauggucuccgagugccgguccagcccaggguguaggcucagggcgugacauccagaucacgcucugcaaggcccauucgaggguagca(序列表SEQ ID NO:1)。
[0007]馬鈴薯stu_miR4322的前體序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)式為:自5'端3bp_5bp和55bp_58bp形成環(huán)狀，自5'端25bp-34bp形成環(huán)狀;其他堿基配對(duì)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。
[0008]編碼上述馬鈴薯stuiiR4322的前體序列的DNA序列為:gggttcgcttggggccagtaatggtctccgagtgccggtccagcccagggtgtaggctcagggcgtgacatccagatcacgctctgcaaggcccattcgagggtagca(序列表SEQ ID NO:2)。
[0009]上述馬鈴薯stu_miR4322的成熟序列如下:cccaggguguaggcucagggcgug (序列表SEQ ID N0:3Xstu-miR4322的成熟序列是前體序列自5'端44bp-67bp的一段RNA序列。
[0010]上述馬鈴薯stu-miR4322的前體序列在研究基因功能中的應(yīng)用，stu-miR4322抑制靶基因APX基因(PGSC0003 DMG400030063)的表達(dá)，所述APX基因序列如序列表SEQ ID N0:4所示。
[0011]上述馬鈴薯stu-miR4322的前體序列在培育抗旱轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
[0012]優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)基因植物為馬鈴薯(Solanum tuberosum)0
[0013]優(yōu)選地，在馬鈴薯中過(guò)表達(dá)SEQ ID NO:1所述miRNA，或者抑制SEQ ID NO:1所述miRNA的表達(dá)，培育出具有高抗旱能力的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯。
[0014]采用上述技術(shù)方案所產(chǎn)生的技術(shù)效果在于:本發(fā)明提供了一種馬鈴薯Stu-miR4322及其篩選方法和應(yīng)用。RLMHACE測(cè)檢結(jié)果表明stu-miR4322調(diào)控APX基因(PGSC0003 DMG400030063)，可用于研究該APX基因的功能，即通過(guò)缺失表達(dá)或過(guò)表達(dá)該APX基因時(shí)研究植物的生理生化變化。熒光定量PCR測(cè)檢結(jié)果表明，stu-miR4322的表達(dá)受干旱脅迫調(diào)控，說(shuō)明其在馬鈴薯適應(yīng)干旱脅迫中起著重要作用，可利用其培育出具有高抗旱能力的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯，對(duì)提高馬鈴薯產(chǎn)量具有重要意義。
【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1是本發(fā)明馬鈴薯stu-miR4322的二級(jí)結(jié)構(gòu)圖。
[0016]圖2是本發(fā)明馬鈴薯靶基因降解電泳圖。
[0017]圖3是本發(fā)明馬鈴薯靶基因降解組測(cè)序圖。
[0018]圖4是本發(fā)明馬鈴薯stu-miR4322的熒光定量PCR圖。
【具體實(shí)施方式】
[0019]為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面對(duì)【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。本發(fā)明的實(shí)施方式僅僅是示例性的，并且本發(fā)明并不限于這些實(shí)施方式。
[0020]在此，還需要說(shuō)明的是，為了避免因不必要的細(xì)節(jié)而模糊了本發(fā)明，以下實(shí)施例僅僅示出了與根據(jù)本發(fā)明的方案密切相關(guān)的結(jié)構(gòu)和/或處理步驟，而省略了關(guān)系不大的其他細(xì)節(jié)。并且，本發(fā)明所使用的各種原料以及各項(xiàng)設(shè)備均為常規(guī)市售產(chǎn)品，均能夠通過(guò)市場(chǎng)購(gòu)買直接獲得;所有定量試驗(yàn)均設(shè)置三次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果取平均值。
[0021]實(shí)施例一:stu-miR4322和靶基因序列的確認(rèn)
馬鈴薯stu-miR4322的前體序列如下(本發(fā)明中所列核苷酸序列均為5,—3'):ggguucgcuuggggccaguaauggucuccgagugccgguccagcccaggguguaggcucagggcgugacauccagaucacgcucugcaaggcccauucgaggguagca(序列表SEQ ID NO:1)。
[0022]馬鈴薯stu_miR4322的前體序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)式為:自5'端3bp_5bp和55bp_58bp形成環(huán)狀，自5'端25bp-34bp形成環(huán)狀;其他堿基配對(duì)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。
[0023]編碼上述馬鈴薯stuiiR4322的前體序列的DNA序列為:gggttcgcttggggccagtaatggtctccgagtgccggtccagcccagggtgtaggctcagggcgtgacatccagatcacgctctgcaaggcccattcgagggtagca(序列表SEQ ID NO:2)。
[0024]上述馬鈴薯stu_miR4322的成熟序列如下:cccaggguguaggcucagggcgug (序列表SEQ ID N0:3Xstu-miR4322的成熟序列是前體序列自5'端44bp-67bp的一段RNA序列。
[0025]上述馬鈴薯stu-miR4322的前體序列在研究基因功能中的應(yīng)用，stu-miR4322抑制靶基因APX基因(PGSC0003 DMG400030063)的表達(dá)，所述APX基因序列如序列表SEQ ID N0:4所示。
[0026]實(shí)施例二:stu-miR4322 的制備 1、馬鈴薯材料處理
選取大小均勻完整的馬鈴薯栽培品種“紫花白”和“大西洋”的薯塊，然后將整薯盆栽種植于標(biāo)準(zhǔn)溫室進(jìn)行培養(yǎng);每個(gè)品種平行種植六盆，當(dāng)植株長(zhǎng)到20厘米左右時(shí)，每個(gè)品種隨機(jī)的選取3盆進(jìn)行干旱處理，剩余的3盆按時(shí)澆水使其正常生長(zhǎng)。當(dāng)處理一月后。分別采集馬鈴薯干旱處理和對(duì)照植株新鮮的葉片，并立即在液態(tài)氮中速凍，被儲(chǔ)存在-80°C冰箱。
[0027]2、樣品總RNA提取與檢測(cè)
(I)將采樣的馬鈴薯葉片在液氮中快速研磨成粉末，在液氮尚未揮發(fā)之前將大約100mg的粉末立即轉(zhuǎn)入預(yù)冷的DEPC處理過(guò)的1.5ml離心管中，快速加入Iml的Trizol溶液，渦旋震蕩充分混勾后室溫放置5?1min，使核酸與核蛋白完全分離。
[0028](2)4°C ,12000 r.min—1離心10 min，小心的將上清液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)DEPC處理過(guò)的
1.5ml離心管中。
[0029](3)加入200 μ?的氯仿，渦旋振蕩混勻，室溫放置5min。
[0030](4)4°C，12000 r.min—1離心10 min后，小心的將上層水相轉(zhuǎn)移至另一個(gè)DEPC處理過(guò)的1.5ml離心管中，切記勿吸取中間有機(jī)相。
[0031](5)分離后加入相同體積的異丙醇，充分混勻再于室溫放置15 min。
[0032](6)4°C ,12000 r.min-1 離心 10 min，廢棄上清，可得到RNA沉淀;
(7)按2 ml 75%乙醇/ml Trizol的比例加入75%乙醇(DEPC水稀釋)，溫柔的振蕩離心管，洗滌沉淀(重復(fù)一次)。
[0033](8)4°C ,12000 r.min-1離心5 min，棄掉上清，切不可倒出沉淀。
[0034](9)室溫放置5?10 min自然干燥，注:RNA樣品不要太過(guò)于干燥，否則很難再完全溶解。
[0035](10)用40 μ?無(wú)RNase的ddH20溶解RNA沉淀，55?60 °(:水浴處理5?10 min。將溶解好的RNA分裝于1.5 mL無(wú)Rnase的離心管中，置于_80°C超低溫冰箱保存。
[0036](Il)RNA樣品的檢測(cè):瓊脂糖凝膠電泳分析RNA降解程度以及是否有污染；Nanodrop檢測(cè)RNA的純度(0D26Q/28()比值);Qubit對(duì)RNA濃度進(jìn)行精確定量；Agilent 2100精確檢測(cè)RNA的完整性。
[0037]3、miRNA文庫(kù)的構(gòu)建及測(cè)序
提取的RNA經(jīng)檢測(cè)合格后，分別使用small RNA Sample Pre Kit構(gòu)建smRNA文庫(kù)，利用smRNA的3'財(cái)端的特殊結(jié)構(gòu)(5'端完整的磷酸基團(tuán)，3'端有羥基)，使用RNA連接酶在純化后的smRNA 37端加上接頭，添加反轉(zhuǎn)錄引物，防止多余3'接頭與5'接頭連接，減少接頭自連產(chǎn)物;再加5'接頭，添加反轉(zhuǎn)錄酶將上述smRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。隨后用PCR擴(kuò)增，然后擴(kuò)增產(chǎn)物用PAGE膠電泳分離目標(biāo)片段，切膠回收得到的為cDNA文庫(kù)。以此cDNA文庫(kù)為模板在11 Iumina測(cè)序儀中進(jìn)行PCR擴(kuò)增測(cè)序。miRNA分離、文庫(kù)構(gòu)建和高通量測(cè)序應(yīng)用11 IuminaHiSeq 2500測(cè)序儀完成。
[0038]4、測(cè)序數(shù)據(jù)分析和miRNA篩選
將測(cè)序獲得50 nt左右的序列經(jīng)去除低質(zhì)量的reads、去除5'接頭污染的reads、去除沒(méi)有3'接頭序列的reads以及含有poIyA的reads，獲得clean reads數(shù)據(jù)。將clean reads與genbank和Rf am數(shù)據(jù)庫(kù)以及參考基因組進(jìn)行比對(duì)，獲得不同sRNA的注釋信息。然后進(jìn)行序列長(zhǎng)度分布統(tǒng)計(jì)以及樣品之間公共序列統(tǒng)計(jì)分析，miRNA主要集中在20-24 nt的范圍。除注釋的所有miRNA片段，選取剩下的未注釋miRNA片段進(jìn)行已知miRNA的鑒定和