專利名稱：半乳糖的測(cè)定方法與半乳糖診斷/測(cè)定試劑盒的制作方法
半乳糖的測(cè)定方法與半乳糖診斷/測(cè)定試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)/食品檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及半乳糖診斷/測(cè)定方法及其試劑盒。
背景技術(shù)：
牛奶在營(yíng)養(yǎng)界素有“液體黃金”的美稱，我國(guó)早在1992年由七部位聯(lián)合提出“一杯牛奶強(qiáng)壯一個(gè)民族”的口號(hào)。奶類除不含纖維素外，幾乎含有人體所需要的各種營(yíng)養(yǎng)素。 牛奶中的乳糖進(jìn)入人體后，經(jīng)小腸乳糖酶作用分解成葡萄糖和半乳糖。半乳糖是嬰兒大腦發(fā)育的必需物質(zhì)，與嬰兒大腦的迅速成長(zhǎng)有密切關(guān)系。牛奶雖好但并不是所有的人都能享受，有些人由于乳糖酶的缺乏，人體不能很好的消化吸收牛奶中的營(yíng)養(yǎng)素，還會(huì)造成鈣、磷、鉀、鐵等元素的吸收障礙，影響嬰幼兒的體格和智力發(fā)育，在老年人中，乳糖酶缺乏是造成骨質(zhì)疏松的重要原因。中國(guó)成年人飲用牛乳后乳糖吸收不良的發(fā)病率高達(dá)86. 7%，不耐受指數(shù)為0. 9。為了避免不適當(dāng)飲奶對(duì)健康造成的損害，因此最好在飲奶前檢查自己是否耐受乳糖，在飲用牛奶后，測(cè)試尿液中半乳糖的濃度，這是目前國(guó)外最常用的一種方法，更為簡(jiǎn)便、 經(jīng)濟(jì)、可靠。

發(fā)明內(nèi)容[要解決的技術(shù)問題]本發(fā)明的目的是提供一種半乳糖的測(cè)定方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種半乳糖診斷/測(cè)定試劑盒。[技術(shù)方案]本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明的方法是一種采用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)與酶 (偶)聯(lián)法(Couple Reaction)的聯(lián)用技術(shù)，利用測(cè)定還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在 340nm波長(zhǎng)處的吸光度變化測(cè)定半乳糖的方法。本發(fā)明半乳糖測(cè)定方法的的技術(shù)原理是根據(jù)下述半乳糖激酶、乙酰輔酶A羧化酶、丙二酸半醛脫氫酶的系列催化反應(yīng)完成半乳糖+腺苷三磷酸半乳糖激酶腺苷二磷酸+半乳糖1-磷酸腺苷二磷酸+磷酸根+蘋果酰輔酶A乙酰輔酶A羧化酶乙酰輔酶A+腺苷三磷酸+ 二氧化碳二氧化碳+乙酰輔酶A+還原型輔酶丙二酸半酵脫氫酶3-甲酰乙酸+輔酶A+輔酶本發(fā)明的方法利用半乳糖激酶(galactokinase ；EC 2. 7. 1. 6)酶(偶)聯(lián)乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase ；EC 6. 4. 1.幻、丙二酸半醛脫氫酶 (malonatesemialdehyde dehydrogenase ；EC 1. 2. 1. 18)酶促反應(yīng)終點(diǎn)法。半乳糖激酶酶解半乳糖反應(yīng)產(chǎn)生腺苷二磷酸，再通過(偶)聯(lián)合乙酰輔酶A羧化酶、丙二酸半醛脫氫酶的作用，最終將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)， 從而得以測(cè)定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的程度，這樣可以通過測(cè)量340nm處吸光度下降的程度，可以測(cè)算半乳糖的濃度大小。本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明涉及一種半乳糖的測(cè)定方法。該半乳糖測(cè)定方法的步驟如下A、樣品準(zhǔn)備A. 1標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備將一定量的半乳糖溶于水或緩沖液中，再將半乳糖濃度調(diào)整到100微摩爾/升，得到的溶液作為標(biāo)準(zhǔn)樣品；A. 2待測(cè)樣品的制備待測(cè)液體樣品直接測(cè)試；將一定量的待測(cè)固體樣品(如乳粉)像制備標(biāo)準(zhǔn)樣品一樣溶于水或緩沖液中；A. 3空白樣品所述的水或緩沖液作為空白樣品，其半乳糖濃度為0微摩爾/升；B、試劑溶液的制備分別移取或稱取緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、半乳糖激酶、乙酰輔酶A羧化酶、 丙二酸半醛脫氫酶、腺苷三磷酸、單價(jià)磷酸鹽(磷酸根)、蘋果酰輔酶A與乙酰輔酶A， 然后將它們混合均勻，用水溶解得到所述的試劑溶液，它們的濃度分別是20-500mmol/ L、0. 001-7mol/L、0. 1-0. 35mmol/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、 l-100mmol/L、l-100mmol/L、l-100mmol/L 與 l-lOOmmol/L ；C、待測(cè)樣品與在步驟B)得到的試劑溶液按照體積比1/10至1/500進(jìn)行混合，在溫度15-45°C下反應(yīng)5-60分鐘，在主波長(zhǎng)340nm與副波長(zhǎng)405nm(如果受儀器限制可以不設(shè)副波長(zhǎng))下進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定其吸光度隨時(shí)間的變化；D、在與步驟C)同樣的條件下測(cè)定步驟A)標(biāo)準(zhǔn)樣品的吸光度隨時(shí)間的變化；E、在與步驟C)同樣的條件下測(cè)定在步驟A)空白樣品的吸光度隨時(shí)間的變化；F、數(shù)據(jù)處理由步驟C-E)所述測(cè)定的主波長(zhǎng)340nm的吸光度隨時(shí)間的變化，根據(jù)下式計(jì)算得到
半乳糖的含量
權(quán)利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的半乳糖濃度測(cè)定方法，其測(cè)定的技術(shù)原理是根據(jù)下述半乳糖激酶、乙酰輔酶A羧化酶、丙二酸半醛脫氫酶的系列催化反應(yīng)完成半乳糖+腺苷三磷酸半乳糖激酶腺苷二磷酸+半乳糖1-磷酸腺苷二磷酸+磷酸根+蘋果酰輔酶A乙酰輔酶A羧化酶乙酰輔酶A+腺苷三磷酸+ 二氧化碳二氧化碳+乙酰輔酶A+還原型輔酶丙二酸半酵脫氫酶3-甲酰乙酸+輔酶A+輔酶。
2.一種半乳糖的測(cè)定方法，其特征在于該方法的步驟如下 2. 1樣品準(zhǔn)備2. 1. 1標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備將一定量的半乳糖溶于水或緩沖液中，再將其濃度調(diào)整到100微摩爾/升； 2. 1.2待測(cè)樣品的制備待測(cè)液體樣品直接測(cè)試；將一定量的待測(cè)固體樣品(如乳粉)像制備標(biāo)準(zhǔn)樣品一樣溶于水或緩沖液中； 2. 1.3空白樣品所述的水或緩沖液作為空白樣品，其半乳糖濃度為0微摩爾/升； 2. 2試劑溶液的制備分別移取或稱取緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、半乳糖激酶、乙酰輔酶A羧化酶、丙二酸半醛脫氫酶、腺苷三磷酸、單價(jià)磷酸鹽(磷酸根)、蘋果酰輔酶A與乙酰輔酶A，然后將它們混合均勻，用水溶解得到所述的試劑溶液，它們的濃度分別是20-500mmol/L、0. 001-7mol/ L、0.1-0.35mmol/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、l-100mmol/L、 l-100mmol/L,l-100mmol/L 與 l-lOOmmol/L ；2. 3待測(cè)樣品與在步驟2. 2)得到的試劑溶液按照體積比1/10至1/500進(jìn)行混合，在溫度15-45°C下反應(yīng)5-60分鐘，在主波長(zhǎng)340nm與副波長(zhǎng)405nm(如果受儀器限制，可以不設(shè)副波長(zhǎng))下進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定其吸光度隨時(shí)間的變化；2. 4在與步驟2. 3)同樣的條件下測(cè)定步驟2. 1. 1)標(biāo)準(zhǔn)樣品的吸光度隨時(shí)間的變化； 2. 5在與步驟2. 3)同樣的條件下測(cè)定在步驟2. 1. 3)使用的水或緩沖液作為空白溶液的吸光度隨時(shí)間的變化；2.6數(shù)據(jù)處理由步驟2. 3-2. 5)所述測(cè)定的主波長(zhǎng)340nm的吸光度隨時(shí)間的變化，根據(jù)下式計(jì)算得到半乳糖的含量
3.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的測(cè)定方法，其特征在于使用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定時(shí)，待測(cè)樣品、所述標(biāo)準(zhǔn)樣品與所述空白樣品由該分析儀在設(shè)定條件下自動(dòng)取樣，然后在下述條件下進(jìn)行測(cè)定測(cè)定方法為終點(diǎn)法，溫度37°C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)半乳糖樣品與試劑的體積比例為1/10-1/500，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)，延遲時(shí)間1/0分鐘，檢測(cè)時(shí)間4/5分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的測(cè)定方法，其特征在于，所述的穩(wěn)定劑是一種或多種選自硫酸銨、氯化鈉、乙二醇、丙二醇、甘油或雙乙酸鈉、疊氮鈉等防腐劑的穩(wěn)定劑；所述的緩沖液是一種或多種選自三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液、咪唑-鹽酸緩沖液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、硼砂-鹽酸緩沖液、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液、巴比妥鈉-鹽酸緩沖液、硼酸-硼砂緩沖液、二乙醇胺緩沖液或“PBS”緩沖液的緩沖液；所述的還原型輔酶是一種或多種選自NADPH、NADH或thio_NADH的還原型輔酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的測(cè)定方法，其特征在于5. 1所述的試劑溶液配制成如下單劑試劑它是由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷三磷酸、單價(jià)磷酸鹽、蘋果酰輔酶A、乙酰輔酶A、半乳糖激酶、乙酰輔酶A羧化酶與丙二酸半醛脫氫酶組成的；5. 2所述的試劑溶液配制成如下雙劑試劑試劑1，它是由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷三磷酸、單價(jià)磷酸鹽、蘋果酰輔酶A與乙酰輔酶A組成的；試劑2，它是由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、半乳糖激酶、乙酰輔酶A羧化酶與丙二酸半醛脫氫酶組成的；其中還原型輔酶、半乳糖激酶、乙酰輔酶A羧化酶、丙二酸半醛脫氫酶、腺苷三磷酸、單價(jià)磷酸鹽、蘋果酰輔酶A、乙酰輔酶A在試劑1或試劑2中的位置是不限定的。5.3所述的試劑配制成如下三劑試劑試劑1，它是由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷三磷酸、單價(jià)磷酸鹽、蘋果酰輔酶A與乙酰輔酶A組成的；試劑2，它是由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、乙酰輔酶A羧化酶與丙二酸半醛脫氫酶組成的；試劑3，它是由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑與半乳糖激酶組成的；其中還原型輔酶、半乳糖激酶、乙酰輔酶A羧化酶、丙二酸半醛脫氫酶、腺苷三磷酸、單價(jià)磷酸鹽、蘋果酰輔酶A、乙酰輔酶A在試劑1、試劑2或試劑3中的位置是不限定的。
6.一種半乳糖診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于6. 1它由下述粉狀試劑組成，在使用時(shí)用水將它們?nèi)芙獾玫骄哂邢率鰸舛确秶目芍苯邮褂玫囊后w試劑20-500mmol/L 0.001-7mol/L 0.1-0. 35mmol/L 1000-80000U/L 1000-80000U/L 1000-80000U/L l-100mmol/L l-100mmol/L緩沖液穩(wěn)定劑還原型輔酶半乳糖激酶乙酰輔酶A羧化酶丙二酸半醛脫氫酶腺苷三磷酸單價(jià)磷酸鹽蘋果酰輔酶Al-100mmol/L乙酰輔酶Al-100mmol/Lo6. 2根據(jù)權(quán)利要求6.1所述的半乳糖診斷組成如下的試劑1 緩沖液20-500mmol/L穩(wěn)定劑0.001-7mol/L還原型輔酶0.1-0. 35mmol/L腺苷三磷酸l-100mmol/L單價(jià)磷酸鹽l-100mmol/L蘋果酰輔酶Al-100mmol/L乙酰輔酶Al-100mmol/L ；組成如下的試劑2 緩沖液20-500mmol/L穩(wěn)定劑0.001-7mol/L半乳糖激酶1000-80000U/L乙酰輔酶A羧化酶1000-80000U/L丙二酸半醛脫氫酶1000-80000U/L。6. 3根據(jù)權(quán)利要求6.1所述的半乳糖診斷組成如下的試劑1 緩沖液20-500mmol/L穩(wěn)定劑0.001-7mol/L還原型輔酶0.1-0. 35mmol/L腺苷三磷酸l-100mmol/L單價(jià)磷酸鹽l-100mmol/L蘋果酰輔酶Al-100mmol/L乙酰輔酶Al-100mmol/L ；組成如下的試劑2 緩沖液20-500mmol/L穩(wěn)定劑0.001-7mol/L乙酰輔酶A羧化酶1000-80000U/L丙二酸半醛脫氫酶1000-80000U/L ；組成如下的試劑3 緩沖液20-500mmol/L穩(wěn)定劑0.001-7mol/L半乳糖激酶1000-80000U/L。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的半乳糖含量的測(cè)定方法、試劑的組成及成分，其測(cè)定的技術(shù)原理是依據(jù)半乳糖激酶、乙酰輔酶A羧化酶、丙二酸半醛脫氫酶的系列催化反應(yīng)完成，本發(fā)明還涉及一種半乳糖診斷/測(cè)定試劑盒。本發(fā)明的測(cè)定方法靈敏度高、誤差小，因此本發(fā)明的測(cè)定方法與試劑盒可以廣泛地應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)/食品檢驗(yàn)。
文檔編號(hào)C12Q1/32GK102297974SQ20101020966
公開日2011年12月28日 申請(qǐng)日期2010年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月23日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司