專利名稱：甘氨酸的測定方法與甘氨酸測定試劑盒的制作方法
甘氨酸的測定方法與甘氨酸測定試劑盒
技術領域：
本發(fā)明涉及食品檢驗測定技術領域，更具體地，本發(fā)明涉及甘氨酸測定方法及其試齊U盒。
背景技術：
甘氨酸為非人體必需氨基酸。甘氨酸有獨特的甜味，能緩和酸、堿味，掩蓋食品中添加糖精的苦味并增強甜味。人體若攝入甘氨酸的量過多，不僅不能被人體吸收利用，而且會打破人體對氨基酸的吸收平衡而影響其它氨基酸的吸收，導致營養(yǎng)失衡而影響健康。甘氨酸不能被人體利用，只能分解轉(zhuǎn)化為熱能，這樣會增加肝臟負擔。而分解產(chǎn)物中的含氮化合物要通過尿液排出體外，又會增加腎臟負擔。如果大量、長期食用這類食品，可能造成肝腎損傷。部分含乳飲料企業(yè)為提高產(chǎn)品中蛋白質(zhì)含量，在生產(chǎn)加工中違規(guī)使用甘氨酸，對青少年及兒童的正常生長發(fā)育很容易帶來不利影響。按照我國《食品添加劑使用衛(wèi)生標準》GB2760規(guī)定，甘氨酸在作為食品添加劑只允許在調(diào)味劑與豆奶中使用，且最高限量為每公斤1克，但在含乳飲料中不允許使用。

發(fā)明內(nèi)容[要解決的技術問題]本發(fā)明的目的是提供一種甘氨酸的測定方法。本發(fā)明的另一個目的是提供一種甘氨酸測定試劑盒。[技術方案]本發(fā)明是通過下述技術方案實現(xiàn)的。本發(fā)明的方法是一種采用二倍擴增法、酶比色法(Enzymatic ColorimetricMethod)與酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)的聯(lián)用技術，利用測定還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處的吸光度變化測定甘氨酸的方法。本發(fā)明甘氨酸測定方法的的技術原理是根據(jù)下述氰化氫合成酶、丙酮酸氧化酶、 甘油醛-3-磷酸脫氫酶的系列催化反應完成 甘氨酸+2輔酶氰化氫合成酶氰化氫+ 二氧化碳+2還原型輔酶二氧化碳+乙酰磷酸+過氧化氫丙酮酸氧化酶磷酸根+丙酮酸+氧 +水磷酸根+甘油醛-3-磷酸+輔酶甘油酵-3-磷酸脫氫酶甘油酸-1，3-雙磷酸+還原型輔酶本發(fā)明的方法利用氰化氫合成酶(hydrogen cyanide synthase ；EC 1.4.99.5) 酶(偶)聯(lián)丙酮酸氧化酶(pyruvate oxidase ；EC 1. 2. 3. 3)、甘油醛_3_磷酸脫氫酶 (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ；EC 1. 2. 1. 59)酶促反應終點法。氰化氫合成酶酶解甘氨酸反應產(chǎn)生二氧化碳，再通過(偶)聯(lián)合丙酮酸氧化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶的作用，最終將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的程度，這樣可以通過測量340nm 處吸光度上升的程度，可以測算甘氨酸的濃度大小。本發(fā)明是通過下述技術方案實現(xiàn)的。本發(fā)明涉及一種甘氨酸的測定方法。該甘氨酸測定方法的步驟如下A、樣品準備A. 1標準樣品的制備將一定量的甘氨酸溶于水或緩沖液中，再將甘氨酸濃度調(diào)整到1毫摩爾/升，得到的溶液作為標準樣品；A. 2待測樣品的制備待測液體樣品直接測試，無須預處理；將一定量的待測固體樣品像制備標準樣品一樣溶于水或緩沖液中；A. 3空白樣品所述的水或緩沖液作為空白樣品，其甘氨酸濃度為0毫摩爾/升；B、試劑溶液的制備分別移取或稱取緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、氰化氫合成酶、丙酮酸氧化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、乙酰磷酸、過氧化氫與甘油醛-3-磷酸，然后將它們混合均勻，用水溶解得到所述的試劑溶液，它們的濃度分別是20-500mmol/L、0. 001-7mol/L、0. l-5mmol/ L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、l-100mmol/L、l-100mmol/L 與 l-100mmol/L ；C、待測樣品與在步驟B)得到的試劑溶液按照體積比1/10至1/500進行混合，在溫度15-45°C下反應5-60分鐘，在主波長340nm與副波長405nm(如果受儀器限制可以不設副波長)下進行測定，測定其吸光度隨時間的變化；D、在與步驟C)同樣的條件下測定步驟A)標準樣品的吸光度隨時間的變化；E、在與步驟C)同樣的條件下測定在步驟A)空白樣品的吸光度隨時間的變化；F、數(shù)據(jù)處理由步驟C-E)所述測定的主波長340nm的吸光度隨時間的變化，根據(jù)下式計算得到
甘氨酸的含量
ΔΑ (樣品)-ΔΑ (空白)
甘氨酸含量= -^標準濃度(mmol/L)
ΔΑ (標準)-ΔΑ (空白)式中Δ A(樣品)表示步驟C)得到的待測樣品的吸光度變化；Δ A(空白)表示步驟Ε)得到的空白樣品的吸光度變化；Δ A (標準)表示步驟D)標準樣品的吸光度變化。根據(jù)本發(fā)明，在所述的甘氨酸測定方法中，所述的緩沖液應該理解是能夠使其測定介質(zhì)的PH基本保持穩(wěn)定(一般是6. 5-8. 5)的溶液。如果該ρΗ高于8. 5或ρΗ低于6. 5， 則該測定方法使用的酶的活性達不到預期的活性效果，因此需要添加更多的介質(zhì)與酶，才有可能達到預期的活性效果。
在本發(fā)明中，所述的緩沖液是一種或多種選自三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液、咪唑_鹽酸緩沖液、磷酸氫二鈉_檸檬酸緩沖液、硼砂_鹽酸緩沖液、巴比妥鈉_鹽酸緩沖液、硼酸_硼砂緩沖液、二乙醇胺緩沖液或“PBS”緩沖液的緩沖液。優(yōu)選地，所述的緩沖液例如選自三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液、 磷酸鹽緩沖液或“PBS”緩沖液。更優(yōu)選地，所述的緩沖液例如選自三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液或磷酸鹽緩沖液。根據(jù)本發(fā)明，在所述的甘氨酸測定方法中，所述的穩(wěn)定劑應該理解是一種能保護試劑中的介質(zhì)(底物)與酶，使其不會隨著時間推移而改變其性質(zhì)，進而失去活性的物質(zhì)， 它會使得試劑具備很長的活性壽命，通常長達數(shù)月，甚至一、二年。如果沒有所述的穩(wěn)定劑， 則試劑的活性在溶液中只能維持數(shù)十小時，頂多數(shù)天，就會逐漸失去活性而不再具備檢測性能。在本發(fā)明中，所述的穩(wěn)定劑使用量是0.01-7mol/L。如果所述的穩(wěn)定劑使用量不夠， 則試劑活性的壽命就會縮短；如果所述的穩(wěn)定劑使用量過高，則會增加成本。在本發(fā)明中，所述的穩(wěn)定劑是一種或多種選自硫酸銨、氯化鈉、乙二醇、丙二醇、甘油或雙乙酸鈉或疊氮鈉防腐劑的穩(wěn)定劑。優(yōu)選地，所述的穩(wěn)定劑例如是一種或多種選自硫酸銨、氯化鈉、丙二醇、甘油或雙乙酸鈉或疊氮鈉的穩(wěn)定劑。更優(yōu)選地，所述的穩(wěn)定劑例如是一種或多種選自甘油、硫酸銨或雙乙酸鈉的穩(wěn)定劑。在本發(fā)明中，所述的輔酶是一種或多種選自NADP+、NAD+或thio_NAD+的輔酶。根據(jù)一種本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，本發(fā)明使用全自動生化分析儀測定甘氨酸時， 待測樣品、所述標準樣品與所述空白樣品由該分析儀在設定條件下(參數(shù))自動取樣，然后在下述條件下進行測定測定方法為二點終點法/終點法，溫度37°C，反應時間10分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測甘氨酸樣品與試劑的體積比例為1/10-1/500，反應方向為正反應，延遲時間1/0分鐘，檢測時間4/5分鐘。根據(jù)另一種本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，本發(fā)明使用的試劑溶液配制成如下雙劑試劑由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、乙酰磷酸、過氧化氫與甘油醛-3-磷酸組成的試劑1 ；由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、氰化氫合成酶、丙酮酸氧化酶與甘油醛-3-磷酸脫氫酶組成的試劑2 ；其中輔酶、氰化氫合成酶、丙酮酸氧化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、乙酰磷酸、過氧化氫、甘油醛-3-磷酸在試劑1或試劑2中的位置是不限定的。根據(jù)另一種本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，本發(fā)明使用的試劑配制成如下三劑試劑由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、乙酰磷酸、過氧化氫與甘油醛-3-磷酸組成的試劑1 ；由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸氧化酶與甘油醛-3-磷酸脫氫酶組成的試劑2 ；由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑與氰化氫合成酶組成的試劑3 ；其中輔酶、氰化氫合成酶、丙酮酸氧化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、乙酰磷酸、過氧化氫、甘油醛-3-磷酸在試劑1、試劑2或試劑3中的位置是不限定的。在本發(fā)明甘氨酸測定方法中使用的測定儀器可以是紫外/可見光分析儀，例如上海精密儀器儀表有限公司銷售的紫外可見分光光度計、天津喀納斯光學分析儀器有限公司銷售的723可見分光光度計；半自動生化分析儀，例如上海偉思醫(yī)用設備有限公司的 BTS-330半自動生化分析儀；全自動生化分析儀，例如由邁瑞公司以商品名BS-300、奧林帕斯公司以商品名AU400、東芝公司以商品名120、日立公司以商品名7600、雅培公司以商品名CB8000或貝克曼公司以商品名CX20銷售的全自動生化分析儀。本發(fā)明還涉及甘氨酸測定試劑盒。該甘氨酸測定試劑盒由下述粉狀試劑組成，在使用時用水將它們?nèi)芙獾玫骄哂邢率鰸舛确秶目芍苯邮褂玫囊后w試劑緩沖液20-500mmol/L
穩(wěn)定劑0.001-7mol/L
輔酶0.l-5mmol/L
氰化氫合成酶1000-80000U/L
丙酮酸氧化酶1000-80000U/L
甘油醛-3-磷酉I脫氫酶1000-80000U/L
乙酰磷酸l-100mmol/L
過氧化氫l-100mmol/L
甘油醛-3-磷酉Il-100mmol/Lo
根據(jù)一種本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，本發(fā)明的甘氨
試劑1
緩沖液1OOmmo1/L
穩(wěn)定劑500mmol/L
輔酶1.25mmol/L
乙酰磷酸5mmol/L
過氧化氫15mmol/L
甘油醛-3-磷酉I5mmol/L ；
組成如下的試劑2
緩沖液IOOmmo1/L
穩(wěn)定劑500mmol/L
氰化氫合成酶16000U/L
丙酮酸氧化酶18000U/L
甘油醛-3-磷酉I 脫氫酶 12000U/L。
根據(jù)另一種本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，本發(fā)明的甘
試劑1
緩沖液IOOmmo1/L
穩(wěn)定劑500mmol/L
輔酶1.25mmol/L
乙酰磷酸5mmol/L
過氧化氫15mmol/L
甘油醛-3-磷酸5mmol/L ；組成如下的試劑2 緩沖液IOOmmol/L穩(wěn)定劑500mmol/L丙酮酸氧化酶18000U/L甘油醛-3-磷酸脫氫酶 12000U/L ；組成如下的試劑3 緩沖液IOOmmol/L穩(wěn)定劑500mmol/L氰化氫合成酶16000U/L。根據(jù)另一種本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，在本發(fā)明的甘氨酸測定試劑盒中，所述的緩沖液是一種或多種選自三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液、咪唑_鹽酸緩沖液、磷酸氫二鈉_檸檬酸緩沖液、硼砂_鹽酸緩沖液、巴比妥鈉_鹽酸緩沖液、硼酸_硼砂緩沖液、二乙醇胺緩沖液或“PBS”緩沖液的緩沖液。優(yōu)選地，所述的緩沖液例如選自三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸(TriS-HCl)緩沖液、 磷酸鹽緩沖液或“PBS”緩沖液。更優(yōu)選地，所述的緩沖液例如選自三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸(TriS-HCl)緩沖液或磷酸鹽緩沖液。在本發(fā)明中，所述的穩(wěn)定劑是一種或多種選自硫酸銨、氯化鈉、乙二醇、丙二醇、甘油或雙乙酸鈉或疊氮鈉防腐劑的穩(wěn)定劑。優(yōu)選地，所述的穩(wěn)定劑例如是一種或多種選自硫酸銨、氯化鈉、丙二醇、甘油、雙乙酸鈉或疊氮鈉的穩(wěn)定劑。更優(yōu)選地，所述的穩(wěn)定劑例如是一種或多種選自甘油、硫酸銨或雙乙酸鈉的穩(wěn)定劑。在本發(fā)明中，無論是單劑試劑、雙劑試劑或三劑試劑，在本發(fā)明測定甘氨酸的方法中，所述的輔酶可以是一種或多種選自NADP+、NAD+或thio-NAD+的輔酶。使用本發(fā)明的甘氨酸測定試劑盒時，可以使用紫外/可見光分析儀，例如上海精密儀器儀表有限公司銷售的紫外可見分光光度計、天津喀納斯光學分析儀器有限公司銷售的723可見分光光度計；半自動生化分析儀，例如上海偉思醫(yī)用設備有限公司的BTS-330半自動生化分析儀；全自動生化分析儀，例如由邁瑞公司以商品名BS-300、奧林帕斯公司以商品名AU400、東芝公司以商品名120、日立公司以商品名7600、雅培公司以商品名CB8000 或貝克曼公司以商品名CX20銷售的全自動生化分析儀。在采用本發(fā)明方法測定甘氨酸時，根據(jù)實驗要求進行多次試驗，然后將得到的這些試驗結(jié)果按照下式計算出精密度(CV)S= V Σ (X-Xi)Vn-I~式中云―試驗結(jié)果平均值；Xi -各次試驗結(jié)果；
n -試驗次數(shù).N≥10
權利要求
1.一種利用二倍擴增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術的甘氨酸濃度測定方法，其測定的技術原理是根據(jù)下述氰化氫合成酶、丙酮酸氧化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶的系列催化反應完成甘氨酸+2輔酶氰化氫合成酶氰化氫+ 二氧化碳+2還原型輔酶二氧化碳+乙酰磷酸+過氧化氫丙酮酸氧化酶磷酸根+丙酮酸+氧+水磷酸根+甘油醛-3-磷酸+輔酶甘油酵-3-磷酸脫氫酶甘油酸-1，3-雙磷酸+還原型輔酶。
2.一種甘氨酸的測定方法，其特征在于該方法的步驟如下 2. 1樣品準備2. 1. 1標準樣品的制備將一定量的甘氨酸溶于水或緩沖液中，再將其濃度調(diào)整到1毫摩爾/升； 2. 1.2待測樣品的制備待測液體樣品直接測試，無須預處理；將一定量的待測固體樣品像制備標準樣品一樣溶于水或緩沖液中； 2. 1.3空白樣品所述的水或緩沖液作為空白樣品，其甘氨酸濃度為0毫摩爾/升； 2. 2試劑溶液的制備分別移取或稱取緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、氰化氫合成酶、丙酮酸氧化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、乙酰磷酸、過氧化氫與甘油醛-3-磷酸，然后將它們混合均勻，用水溶解得到所述的試劑溶液，它們的濃度分別是 20-500mmol/L、0. 001_7mol/L、0. l_5mmol/L、1000-80000U/ L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、l-100mmol/L、l-100mmol/L 與 l-lOOmmol/L ；2. 3待測樣品與在步驟2. 2)得到的試劑溶液按照體積比1/10至1/500進行混合，在溫度15-45°C下反應5-60分鐘，在主波長340nm與副波長405nm(如果受儀器限制，可以不設副波長)下進行測定，測定其吸光度隨時間的變化；2. 4在與步驟2. 3)同樣的條件下測定步驟2. 1. 1)標準樣品的吸光度隨時間的變化； 2. 5在與步驟2. 3)同樣的條件下測定在步驟2. 1. 3)使用的水或緩沖液作為空白溶液的吸光度隨時間的變化；2.6數(shù)據(jù)處理由步驟2. 3-2. 5)所述測定的主波長340nm的吸光度隨時間的變化，根據(jù)下式計算得到甘氨酸的含量ΔΑ (樣品)-ΔΑ (空白)甘氨酸含量= -5<標準濃度(mmol/L )ΔΑ (標準)-ΔΑ (空白)式中ΔΑ(樣品)表示步驟2. 3)得到的待測樣品的吸光度變化； ΔΑ(空白)表示步驟2. 5)得到的空白溶液的吸光度變化； 八八(標準)表示步驟2. 4)標準樣品的吸光度變化。
3.根據(jù)權利要求1、2所述的測定方法，其特征在于使用全自動生化分析儀測定時，待測樣品、所述標準樣品與所述空白樣品由該分析儀在設定條件下自動取樣，然后在下述條件下進行測定測定方法為終點法，溫度37°C，反應時間10分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測甘氨酸樣品與試劑的體積比例為1/10-1/500，反應方向為正反應，延遲時間1/0分鐘，檢測時間4/5分鐘。
4.根據(jù)權利要求1、2或3所述的測定方法，其特征在于，所述的穩(wěn)定劑是一種或多種選自硫酸銨、氯化鈉、乙二醇、丙二醇、甘油或雙乙酸鈉、疊氮鈉等防腐劑的穩(wěn)定劑；所述的緩沖液是一種或多種選自三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液、咪唑-鹽酸緩沖液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、硼砂-鹽酸緩沖液、巴比妥鈉-鹽酸緩沖液、硼酸-硼砂緩沖液、二乙醇胺緩沖液或“PBS”緩沖液的緩沖液；所述的輔酶是一種或多種選自NADP+、 NAD+ 或 thio-NAD+ 的輔酶。
5.根據(jù)權利要求1、2或3所述的測定方法，其特征在于5. 1所述的試劑溶液配制成如下單劑試劑它是由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、乙酰磷酸、過氧化氫、甘油醛-3-磷酸、氰化氫合成酶、丙酮酸氧化酶與甘油醛-3-磷酸脫氫酶組成的；5. 2所述的試劑溶液配制成如下雙劑試劑試劑1，它是由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、乙酰磷酸、過氧化氫與甘油醛-3-磷酸組成的；試劑2，它是由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、氰化氫合成酶、丙酮酸氧化酶與甘油醛-3-磷酸脫氫酶組成的；其中輔酶、氰化氫合成酶、丙酮酸氧化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、乙酰磷酸、過氧化氫、甘油醛-3-磷酸在試劑1或試劑2中的位置是不限定的。5.3所述的試劑配制成如下三劑試劑試劑1，它是由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、乙酰磷酸、過氧化氫與甘油醛-3-磷酸組成的；試劑2，它是由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸氧化酶與甘油醛-3-磷酸脫氫酶組成的；試劑3，它是由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑與氰化氫合成酶組成的；其中輔酶、氰化氫合成酶、丙酮酸氧化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、乙酰磷酸、過氧化氫、甘油醛-3-磷酸在試劑1、試劑2或試劑3中的位置是不限定的。
6.一種甘氨酸測定試劑盒，其特征在于6. 1它由下述粉狀試劑組成，在使用時用水將它們?nèi)芙獾玫骄哂邢率鰸舛确秶目芍苯邮褂玫囊后w試劑20-500mmol/L 0.001-7mol/L 0.l-5mmol/L 1000-80000U/L 1000-80000U/L 1000-80000U/L l-100mmol/L l-100mmol/L緩沖液穩(wěn)定劑輔酶氰化氫合成酶丙酮酸氧化酶甘油醛-3-磷酸脫氫酶乙酰磷酸過氧化氫甘油醛-3-磷酸l-100mmol/Lc20-500mmol/L 0.001-7mol/L 0.1-5mmol/L l-100mmol/L l-100mmol/L l-100mmol/L ；20-500mmol/L 0.001-7mol/L 1000-80000U/L 1000-80000U/L 1000-80000U/Lc6. 2根據(jù)權利要求6. 1所述的甘氨酸測定試劑盒，其特征在于它有組成如下的試劑1 緩沖液穩(wěn)定劑輔酶乙酰磷酸過氧化氫甘油醛-3-磷酸組成如下的試劑2 緩沖液穩(wěn)定劑氰化氫合成酶丙酮酸氧化酶甘油醛-3-磷酸脫氫酶 6. 3根據(jù)權利要求6. 1所述的甘氨酸測定試劑盒，其特征在于它有組成如下的試劑1 緩沖液穩(wěn)定劑輔酶乙酰磷酸過氧化氫甘油醛-3-磷酸組成如下的試劑2 緩沖液穩(wěn)定劑丙酮酸氧化酶甘油醛-3-磷酸脫氫酶組成如下的試劑3 緩沖液穩(wěn)定劑氰化氫合成酶20-500mmol/L 0.001-7mol/L 0.1-5mmol/L l-100mmol/L l-100mmol/L l-100mmol/L ；20-500mmol/L 0.001-7mol/L 1000-80000U/L 1000-80000U/L20-500mmol/L 0. 001-7mol/L 1000-80000U/L。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用二倍擴增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術的甘氨酸含量的測定方法、試劑的組成及成分，其測定的技術原理是依據(jù)氰化氫合成酶、丙酮酸氧化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶的系列催化反應完成，本發(fā)明還涉及一種甘氨酸測定試劑盒。本發(fā)明的測定方法靈敏度高、誤差小，因此本發(fā)明的測定方法與試劑盒可以廣泛地應用于食品檢驗。
文檔編號C12Q1/32GK102298011SQ20101020957
公開日2011年12月28日 申請日期2010年6月23日 優(yōu)先權日2010年6月23日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司