專利名稱：一種7-木糖紫杉烷糖基水解酶、其基因的核苷酸序列及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種水解酶及編碼該酶的核苷酸序列，具體講，涉及一種專一性水解紫杉烷木糖苷的7-木糖紫杉烷糖基水解酶及其核苷酸序列，以及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
紫杉醇(TaX0l ，PaClitaxel)主要由紅豆杉屬植物產(chǎn)生，作為二十世紀(jì)90年代抗癌藥的重要成就之一，自問世以來，其獨特的抗腫瘤機(jī)制和顯著的抗腫瘤活性令世人矚目 [Kingston DGI，et al. The taxane diterpenoids. In :Herz W，et al. eds. Progress in the chemistry of organic natural products. New York :Springer_Verlag，1993，161-165]0 它可以與微管蛋白結(jié)合，促進(jìn)微管蛋白的聚合并抑制其解聚，阻止細(xì)胞有絲分裂過程中紡錘絲的形成，使細(xì)胞停滯于G2期和M期。目前紫杉醇在臨床上被用作乳腺癌、卵巢癌和非小細(xì)胞肺癌等的一線藥物。對頭頸部癌癥、黑色素瘤、結(jié)腸癌以及由HIV引起的卡波濟(jì)肉瘤也有較好的療效。紫杉醇在紅豆杉植株中含量很低，即使是含量最高的部位樹皮中也只有萬分之二左右[美國專利US 6(^8206]。如果以紅豆杉樹皮為原料，每提取1公斤紫杉醇就需要10 噸樹皮(相當(dāng)于2000棵左右的樹木)！而滿足1例病人的用藥量相當(dāng)于毀掉3-4棵百年老樹。目前，灌木型紅豆杉雜交種的苗圃栽培被認(rèn)為是已知的解決紫杉醇來源最簡易、資源可再生、成本最低廉的方法。另外，1988年法國Denis等從歐洲紅豆杉的針葉中得到含量為0. 的紫杉醇前體化合物10-去乙酰巴卡亭ΙΙ αθ-deacetylbaccatin III)，以此為前體半合成了紫杉醇，并研制出比紫杉醇抗腫瘤活性更強(qiáng)、有更好水溶性的多烯紫杉醇 Taxotere[Denis JN, Greene AE. J. Am Chem Soc 1988,110(17) :5917-5919 ；Ringel I， Horwitz SB. J Nat Cancer Inst 1991,83(4) :288-291]。盡管紅豆杉植株中紫杉醇的含量非常低，但具有紫杉醇母核結(jié)構(gòu)的 C-7木糖紫杉烷類化合物(紫杉烷木糖苷)，包括7-木糖-10-去乙酰紫杉醇 (7-β -xylosyl-10-deacytyltaxol, XDT)、7_ 木糖-10-去乙酰巴卡亭 ΙΙΙ(7_β -xylo syl-10-deacetylbaccatin III，XDB)、7-木糖-10-去乙酰三尖杉寧堿(7-β -xylosy l-10-deacetylc印holomanine，XDC)等，卻含量豐富，例如，7_木糖-10-去乙酰紫杉醇 (7-β -xylosyl-10-deacytyltaxol, XDT)的含量可達(dá)紫杉醇的10倍以上，在紅豆杉Taxus wallichiana的樹皮中，)(DT的收率甚至可高達(dá)0. 5% [美國專利US6(^8206]。這些在紅豆杉材料中大量存在的紫杉醇類似物如果采用化學(xué)或生物方法去除其木糖基，產(chǎn)生C-7位羥基化產(chǎn)物，用于制備紫杉醇或多烯紫杉醇、或其中間體，則可以達(dá)到提高紅豆杉資源利用率的目的。而這方面的研究已經(jīng)取得了一些進(jìn)展。但化學(xué)方法存在許多不足，如在高碘酸鹽的氧化過程中容易導(dǎo)致7-木糖紫杉烷其他側(cè)鏈的降解，收率低，反應(yīng)過程較繁瑣，對環(huán)境有污染等。生物方法則由于符合“綠色化學(xué)”的理念而越來越收到重視。
美國及歐洲專利[US005700669A ；EP0668360A1]及發(fā)表的相關(guān)論文[Hanson，RL, et al. Biotechnol Appl Biochem 1997,26 :153-158]公開了利用細(xì)菌 Moraxella sp.、 Bacillus macerans、Bacillus circulans 禾口 Micrococcus sp.將 C-7 木糖紫杉燒轉(zhuǎn)化為 C-7羥基紫杉烷的水解方法。其中，Moraxella sp. (ATCC55475)的轉(zhuǎn)化能力最強(qiáng)，在2ml細(xì)胞懸浮液中加入0. 5mg 7-木糖-10-去乙酰紫杉醇O(DT)(濕細(xì)胞91. 5mg/mL ；XDTO. 25mg/ ml)J8°C、12rpm條件下極向(end-over-end)混合21小時，沒有)(DT剩余，HPLC檢測到產(chǎn)物DT的產(chǎn)率為0. 23mg/ml。在另一個實驗中，2ml反應(yīng)懸浮液中的62. 5mg濕菌體在7小時內(nèi)可將0. 5mg XDT幾乎完全轉(zhuǎn)化為DT。中國專利[申請?zhí)?00610046^6. 6]及發(fā)表的相關(guān)論文[Hao DC, Ge GB, Yang L.FEMS Microbiol Lett 2008,284 :204-212]公開了利用放線菌 Leifsonia shinshuensisDICP 16 (CCTCC No. M 206026)將C_7木糖紫杉烷轉(zhuǎn)化為C_7羥基紫杉烷的水解方法。利用類似于上述美國專利的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化條件，在2ml菌體懸浮液中加入lmgXDT，21 小時后反應(yīng)液中無》)T殘留，產(chǎn)生O.^ig/ml DT0在另一個實驗中，在7-木糖-10-去乙酰巴卡亭III最佳底物濃度(1.95mg/ml)條件下，反應(yīng)40小時后可將底物幾乎完全轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物。另一份中國專利[申請?zhí)?007100U698.9]公開了放線菌纖維化纖維單孢菌 (Cellulosimicrobium cellulans, XZ-5CCTCC No. M 207130)、水解酶及其在紫杉燒轉(zhuǎn)化方面的用途將IOml XDT (濃度為5mg/ml)加入到90ml粗酶液(IOOml培養(yǎng)液加入Iml 30°C 培養(yǎng)2天的纖維化纖維單孢菌種子液，150rpm，3(TC搖瓶培養(yǎng)5天，離心收集上清即為粗酶液)，50rpm、30°C下反應(yīng)20小時，得到40mg DT (轉(zhuǎn)化率91% ) 除此之外，未見其他相關(guān)報道。上述生物方法在水解7-木糖紫杉烷方面均有潛在的應(yīng)用價值，但由于現(xiàn)存技術(shù)中的細(xì)胞酶量普遍偏低、底物在水中的溶解度不高等因素，導(dǎo)致產(chǎn)物的產(chǎn)率(單位體積反應(yīng)液或單位體積菌體轉(zhuǎn)化底物為產(chǎn)物的質(zhì)量數(shù))仍然低下，不符合規(guī)模化工業(yè)生產(chǎn)的要求。本發(fā)明在前期工作獲得能轉(zhuǎn)化7-木糖紫杉烷為7-羥基紫杉烷的1株真菌的基礎(chǔ)上，從培養(yǎng)的菌體中分離并純化了能催化上述反應(yīng)的糖基水解酶，根據(jù)LC-MS/MS對該酶幾個肽段的氨基酸序列分析結(jié)果，設(shè)計出一系列簡并引物，通過巢式PCR、RACE和Genomic Walking等分子生物學(xué)技術(shù)克隆并測定出該酶的核苷酸編碼序列及其結(jié)構(gòu)基因，將該基因的核苷酸編碼序列或其開放閱讀框(ORF)與適當(dāng)表達(dá)載體連接后，導(dǎo)入到生長快、適合高密度發(fā)酵的宿主如畢赤酵母中，重組菌可高效轉(zhuǎn)化7-木糖紫杉烷為7-羥基紫杉烷。盡管能水解木糖殘基的普通木糖苷酶已從細(xì)菌、放線菌、真菌等多種來源分離得至IJ [Lama L, et al. Res Microbiol 2004,155(4) :283-289 ；Belfaquih, Penninckx MJ. Enzyme Microb Technol 2000,27(1-2) :114-121 ；Tuohy MG, et al. Biochem J 1993, 290 (Pt 2) :515-523 ；Golubev AM, et al. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 2000， 56(Pt 8) :1058-1060 ；Pan I，Yao H, Li Y.Enzyme Microb Technol 2001,28(2-3) 196-201 ；Rizzatti AC, et al. J Ind Microbiol Biotechnol 2001,26(3) :156-160 ； Saha BC.J Ind Microbiol Biotechnol 2001,27(4) :241-245 ；Gargouri Μ, et al. J Mol Cataly B =Enzymati 2004,29, Issues 1-6:89-94]。一些 β -木糖苷酶基因，如幾種真菌來源的編碼 β -木糖苷酶的基因[Margolles-Clark E, et al. Appl Environ Microbiol 1996,62(10) :3840-3846 ；van Peij NN, et al. Eur J Biochem 1997,245(1) :164-173; Perez-Gonzalez JA, et al. Appl Environ Microbiol 1998,64(4) :1412-1419 ；Kitamoto N,et al. Appl Environ Microbiol 1999,65(1) :20-24 ；Reen FJ,et al. Biochem Biophys Res Commun 2003,305(3) :579-585]，已被克隆和測序，但是，包括所有原核生物及真核生物在內(nèi)，尚未見到能專一性水解去除7-木糖紫杉烷的木糖基的基因克隆的報道或?qū)＠?。因此，本發(fā)明首次克隆并異源表達(dá)了能專一性地催化7-木糖紫杉烷為7-羥基紫杉烷這一水解反應(yīng)的糖基水解酶的基因，該基因序列與GenBank中已注冊的所有DNA序列相比較差異極大，幾乎沒有一致性(identity)，最為接近者也多為假定蛋白基因序列，且覆蓋率僅3 7%。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要發(fā)明目的在于提供一種7-木糖紫杉烷糖基水解酶。本發(fā)明的第二發(fā)明目的在于提供編碼該酶的核苷酸序列。本發(fā)明的第三發(fā)明目的在于提供含有該核苷酸序列的表達(dá)載體。本發(fā)明的第四發(fā)明目的在于提供含有該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的第五發(fā)明目的在于提供了該酶的應(yīng)用。為了實現(xiàn)本發(fā)明之目的，采用的技術(shù)方案為本發(fā)明提供一種7-木糖紫杉醇糖基水解酶，所述7-木糖紫杉醇糖基水解酶的氨基酸序列包括SEQ ID NO :2所示序列的至少8個氨基酸序列，優(yōu)選包括SEQ ID NO :2所示序列的至少15個氨基酸序列，更優(yōu)選包括SEQ ID NO 2所示序列的至少240個氨基酸序列，進(jìn)一步優(yōu)選包括SEQ ID NO :2所示序列的至少321個氨基酸序列，更優(yōu)選包括SEQ ID NO 2所示序列的至少481個氨基酸序列。本發(fā)明還提供了一種編碼所述7-木糖紫杉醇糖基水解酶的核苷酸序列。其中，該核苷酸序列具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列的至少M(fèi)個核苷酸。本發(fā)明還提供兩種含有該核苷酸序列的表達(dá)載體。本發(fā)明還提供一種含有該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。其中，所述宿主細(xì)胞優(yōu)選為細(xì)菌、放線菌、絲狀真菌、酵母菌、植物細(xì)胞、動物細(xì)胞； 進(jìn)一步優(yōu)選的，細(xì)菌選自大腸桿菌，放線菌選自鏈霉菌，絲狀真菌選自擔(dān)子菌、絲狀子囊菌， 酵母菌選自畢赤酵母、釀酒酵母、裂殖酵母，動物細(xì)胞選自昆蟲細(xì)胞。本發(fā)明還提供7-木糖紫杉醇糖基水解酶或含有7-木糖紫杉醇糖基水解酶的宿主細(xì)胞在水解去除木糖基和/或水解去除葡萄糖基方面的應(yīng)用。其中，7-木糖紫杉醇糖基水解酶水解去除木糖基時底物包括7-木糖紫杉烷、 7-木糖-10-去乙酰紫杉醇、7-木糖-10-去乙酰三尖杉寧堿、7-木糖-10-去乙酰巴卡亭 III、7-木糖-10-去乙酰紫杉醇C、7-木糖紫杉醇、7-木糖三尖杉寧堿、7-木糖巴卡亭III、 7-木糖紫杉醇C ；水解去除木糖基后得到的產(chǎn)物包括7-羥基紫杉烷，其中制備的7-羥基紫杉烷，包括但不限于10-去乙酰紫杉醇、10-去乙酰三尖杉寧堿、10-去乙酰巴卡亭III、 10-去乙酰紫杉醇C、紫杉醇、三尖杉寧堿、巴卡亭III、紫杉醇C。本發(fā)明的7-木糖紫杉醇糖基水解酶在應(yīng)用方面的技術(shù)方案優(yōu)選為7-木糖紫杉醇糖基水解酶在以7-糖基紫杉烷為原料制備7-羥基紫杉烷時的應(yīng)用。其中，所述的7-糖基紫杉烷原料選自帶有木糖基的紫杉烷類的混合物，進(jìn)一步優(yōu)選的，紫杉烷類的混合物選自紫杉屬植物組織、植物細(xì)胞培養(yǎng)物或微生物細(xì)胞培養(yǎng)物。下面對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的說明本發(fā)明提供的一種能明確其氨基酸序列的水解酶-7-木糖紫杉醇糖基水解酶，系由一種口蘑科(Tricholomareceae)真菌香菇(Lentinula edodes M95. 33)、或由含有該酶編碼基因的重組細(xì)胞產(chǎn)生，可位于細(xì)胞內(nèi)或分泌到細(xì)胞外，用于轉(zhuǎn)化C-7-木糖紫杉烷為紫杉醇或其類似物。本發(fā)明的水解酶-7-木糖紫杉醇糖基水解酶的氨基酸序列具有SEQ ID No :2所示的氨基酸序列至少8個氨基酸殘基，或具有SEQ ID No :2至少30%的氨基酸序列，或者是 SEQ ID NO :2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID NO 2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID NO 2衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供了編碼該氨基酸序列的核苷酸序列，與提供的SEQ ID No=I所示的核苷酸序列的一部分具有編碼SEQ ID No :2所示的氨基酸殘基序列的至少對個核苷酸，優(yōu)選具有編碼SEQ ID No :2所示的氨基酸殘基序列的至少45個核苷酸，更優(yōu)選具有編碼SEQ ID No 2所示的氨基酸殘基序列的至少720個核苷酸，進(jìn)一步優(yōu)選具有編碼SEQ ID No 2 所示的氨基酸殘基序列的至少963個核苷酸，更優(yōu)選具有編碼SEQ ID No :2所示的氨基酸殘基序列的至少1443個核苷酸。本發(fā)明提供的該糖基水解酶核苷酸序列，包括完整的開放閱讀框架(ORF)可以用來構(gòu)建各種類型的重組表達(dá)質(zhì)粒，后者被轉(zhuǎn)移到原來的真菌或其他真菌宿主細(xì)胞，或被轉(zhuǎn)移到原核細(xì)胞(包括大腸桿菌、放線菌)、植物細(xì)胞和動物細(xì)胞等宿主細(xì)胞，由于該糖基水解酶基因的表達(dá)可以使這些宿主獲得水解7-木糖紫杉烷為7-羥基紫杉烷的能力。還可以用于有糖基的其他化合物的生物轉(zhuǎn)化。本發(fā)明還提供了該7-木糖紫杉醇糖基水解酶的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種紫杉醇及其類似物的生物轉(zhuǎn)化制備方法以C-7-木糖紫杉烷為原料，用上述口蘑科的真菌或重組菌(如重組畢赤酵母)水解除去原料上的木糖基，得到紫杉醇或其類似物。本發(fā)明所述的溶解底物的溶劑，除非有明確說明，一般是指水、甲醇、N, N-二甲基甲酰胺(N，N-Dimethylformamide，DMF)、二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide, DMS0)等。本發(fā)明提供的方法中制備的紫杉醇或其類似物(產(chǎn)物)，以及所用的C-7-木糖紫杉烷原料(底物)，其結(jié)構(gòu)特征如通式I所示。通式 I
權(quán)利要求
1.一種7-木糖紫杉醇糖基水解酶，其特征在于，所述7-木糖紫杉醇糖基水解酶的氨基酸序列包括SEQ ID NO 2所示序列的至少8個氨基酸序列，優(yōu)選包括SEQ IDNO :2所示序列的至少15個氨基酸序列，更優(yōu)選包括SEQ ID NO 2所示序列的至少240個氨基酸序列，進(jìn)一步優(yōu)選包括SEQ ID NO :2所示序列的至少321氨基酸序列，更優(yōu)選包括SEQ ID NO :2所示序列的至少481氨基酸序列。
2.一種編碼權(quán)利要求1所述7-木糖紫杉醇糖基水解酶的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列具有SEQIDNO 1所示的核苷酸序列的至少M(fèi)個核苷酸，優(yōu)選具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列的至少 45個核苷酸，更優(yōu)選包括SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列的至少720個核苷酸，進(jìn)一步優(yōu)選具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列的至少963個核苷酸，更優(yōu)選包括SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列的至少1443個核苷酸。
4.一種含有權(quán)利要求2所述核苷酸序列的表達(dá)載體。
5.一種含有權(quán)利要求4所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞選自細(xì)菌、放線菌、絲狀真菌、酵母菌、植物細(xì)胞、動物細(xì)胞，其中，細(xì)菌選自大腸桿菌，放線菌選自鏈霉菌，絲狀真菌選自擔(dān)子菌、絲狀子囊菌，酵母菌選自畢赤酵母、釀酒酵母、裂殖酵母，動物細(xì)胞選自昆蟲細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的7-木糖紫杉醇糖基水解酶或含有7-木糖紫杉醇糖基水解酶的宿主細(xì)胞在水解去除木糖基和/或水解去除葡萄糖基方面的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述7-木糖紫杉醇糖基水解酶水解去除木糖基時底物包括7-木糖紫杉烷、7-木糖-10-去乙酰紫杉醇、7-木糖-10-去乙酰三尖杉寧堿、7-木糖-10-去乙酰巴卡亭III、7-木糖-10-去乙酰紫杉醇C、7-木糖紫杉醇、7-木糖三尖杉寧堿、7-木糖巴卡亭III、7-木糖紫杉醇C。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的7-木糖紫杉醇糖基水解酶水解去除木糖基后得到的產(chǎn)物包括7-羥基紫杉烷，其中制備的7-羥基紫杉烷，包括但不限于 10-去乙酰紫杉醇、10-去乙酰三尖杉寧堿、10-去乙酰巴卡亭IIIUO-去乙酰紫杉醇C、紫杉醇、三尖杉寧堿、巴卡亭III、紫杉醇C。
10.根據(jù)權(quán)利要求8、9任-所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的7-木糖紫杉醇糖基水解酶在以7-糖基紫杉烷為原料制備7-羥基紫杉烷時的應(yīng)用。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的7-糖基紫杉烷原料選自帶有木糖基的紫杉烷類的混合物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的紫杉烷類的混合物選自紫杉屬植物組織、植物細(xì)胞培養(yǎng)物或微生物細(xì)胞培養(yǎng)物。
13.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的的7-木糖紫杉醇糖基水解酶在進(jìn)行水解反應(yīng)時的溶劑選自水、甲醇、N，N-二甲基甲酰胺或二甲基亞砜。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種7-木糖紫杉醇糖基水解酶，其氨基酸序列，包括SEQ ID NO2所示序列的至少8個氨基酸序列；還涉及編碼7-木糖紫杉醇糖基水解酶的核苷酸序列，以及含有該核苷酸序列的表達(dá)載體及宿主細(xì)胞；本發(fā)明還涉及7-木糖紫杉醇糖基水解酶或含有7-木糖紫杉醇糖基水解酶的宿主細(xì)胞在水解去除木糖基和/或水解去除葡萄糖基方面的應(yīng)用。
文檔編號C12N1/15GK102296053SQ201010209089
公開日2011年12月28日 申請日期2010年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月25日
發(fā)明者何惠霞, 孟超, 朱平, 朱慧新, 程克棣, 程海立, 趙瑞玉 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所