專利名稱：一種利用重組菌無細(xì)胞提取物催化不對稱轉(zhuǎn)化制備光學(xué)純芳基醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種利用重組菌無細(xì)胞提取物催化不對稱轉(zhuǎn)化制備光學(xué)純芳基醇的方法，屬于生 物催化不對稱轉(zhuǎn)化技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
芳基醇的化學(xué)結(jié)構(gòu)為
(R: = H, CI, CH3, 0CH3 ;R2 = H, Br, OH)光學(xué)純芳基醇是制備具有光學(xué)活性的醫(yī)藥、農(nóng)藥和功能材料的重要中間體，開展 光學(xué)純芳基醇不對稱轉(zhuǎn)化制備方法的研究極有意義。手性化合物在人們生活中具有重要作用，由于兩個(gè)對映體在藥理、毒理及功能作 用等各方面均有所不同，因此，制備光學(xué)純的手性模塊化合物在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、材料以及環(huán)保 等領(lǐng)域都具有重要的意義。目前，國際上制備光學(xué)純手性化合物的常見方法主要包括化學(xué)拆分法，色譜拆分 法，液體膜拆分法或手性固體膜拆分的膜拆分法，和生物法。利用生物法轉(zhuǎn)化制備光學(xué)純的 手性化合物具有反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)物單一，立體選擇性、區(qū)域選擇性和化學(xué)選擇性較高，并 能完成一些化學(xué)合成難以進(jìn)行的反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。合成光學(xué)活性物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)大致可分 為兩類一類是把外消旋體拆分為兩個(gè)具有光學(xué)活性的對映體；另一類是從外消旋或前手 性的前體出發(fā)，通過催化反應(yīng)得到不對稱的光學(xué)活性產(chǎn)物。90年代起國際上對微生物及酶拆分手性化合物進(jìn)行大量的研究。酶由L-氨基酸 構(gòu)成，其活性中心構(gòu)成了一個(gè)不對稱環(huán)境，有利于對消旋體的識別，是一種高度手性的催化 劑。其催化效率高，有較強(qiáng)的專一性。酶促拆分消旋體是比較理想的選擇。利用完整細(xì)胞 對外消旋化合物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，可以獲得光學(xué)純對映體，在非水相及有機(jī)一水雙相反應(yīng)體系中， 也可酶促轉(zhuǎn)化制備光學(xué)純化合物。微生物細(xì)胞所產(chǎn)生的氧化還原酶具有立體選擇性高和反應(yīng)條件溫和等特點(diǎn)，在制 備手性醇、氨基酸和類固醇等方面顯示出極大的優(yōu)勢，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、食品、精細(xì)化 工等領(lǐng)域。目前，利用氧化還原酶催化不對稱轉(zhuǎn)化通常以細(xì)胞形式或純酶形式進(jìn)行。然而， 無論采用何種生物催化劑形式，以氧化還原酶在進(jìn)行生物催化時(shí)，都需要輔酶NAD (P)H作 為電子傳遞體參與反應(yīng)，在合成產(chǎn)物的同時(shí)會消耗掉一定量的輔酶。由于輔酶價(jià)格昂貴， 從經(jīng)濟(jì)角度考慮在催化反應(yīng)過程中添加大量輔酶是不現(xiàn)實(shí)的，因此應(yīng)設(shè)法建立輔酶再生體 系，對輔酶進(jìn)行再生并循環(huán)使用。氧化還原酶的輔酶再生通常采用兩種方式一種是以醇類 或糖類化合物為輔助底物的底物耦聯(lián)再生，但維持輔酶循環(huán)所需的醇類化合物可能會對催 化用酶本身產(chǎn)生變性失活作用；另一種是構(gòu)建酶耦聯(lián)再生體系，在體系中添加可用于輔酶 循環(huán)的再生酶，如葡萄糖脫氫酶、甲酸脫氫酶、氫化酶等，但這些酶的添加無疑增加了反應(yīng)的復(fù)雜性和經(jīng)濟(jì)成本。此外，以細(xì)胞形式進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，細(xì)胞膜會對底物和產(chǎn)物進(jìn)出細(xì)胞形成 阻礙，進(jìn)而影響反應(yīng)的效率。因此，很有必要建立一種方便、有效、經(jīng)濟(jì)的生物催化系統(tǒng)以促 進(jìn)和改善其催化轉(zhuǎn)化效果。目前生物法不對稱轉(zhuǎn)化制備光學(xué)純芳基醇的方法主要是利用含有氧化還原酶的 細(xì)胞如釀酒酵母或重組大腸桿菌，或氧化還原酶純酶如微生物產(chǎn)生的羰基還原酶或醇脫氫 酶。但是，尚沒有利用重組菌無細(xì)胞提取物催化不對稱轉(zhuǎn)化制備光學(xué)純芳基醇的報(bào)道。構(gòu) 建重組菌株的基因scrl來自于近平滑假絲酵母(Candida parapsilosis) CCTCC M203011, 該基因編碼羰基還原酶SCR1，催化不對稱還原2-羥基苯乙酮為(S)-l-苯基-1，2-乙二醇 的反應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
(1)要解決的技術(shù)問題本發(fā)明的目的是提供一種利用重組菌無細(xì)胞提取物催化不對稱轉(zhuǎn)化制備光學(xué)純 芳基醇的方法。本發(fā)明目的不僅僅在于建立一種不對稱轉(zhuǎn)化制備光學(xué)純芳基醇的無細(xì)胞催 化體系，并將該無細(xì)胞體系應(yīng)用于不對稱還原制備光學(xué)純芳基醇的反應(yīng)中，以提高不對稱 轉(zhuǎn)化制備光學(xué)純芳基醇產(chǎn)物的生產(chǎn)效率，而且利用該重組菌無細(xì)胞提取物，僅通過添加葡 萄糖等輔助底物而無需額外添加輔酶再生所需的耦聯(lián)酶，即可實(shí)現(xiàn)生物催化氧化還原必需 輔酶的有效再生，從而建立一種具有廣泛適用性的經(jīng)濟(jì)、方便、有效的生物催化系統(tǒng)。(2)技術(shù)方案本發(fā)明首先從表達(dá)羰基還原酶的重組大腸桿菌出發(fā)制備重組菌無細(xì)胞提取物，該 無細(xì)胞體系僅通過添加輔助底物和初始量輔酶NADP+即可實(shí)現(xiàn)輔酶NADPH的再生循環(huán)。在 此基礎(chǔ)上，對該無細(xì)胞體系催化不對稱還原制備光學(xué)純芳基醇的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，并考 察該反應(yīng)體系對于制備不同芳基醇的底物專一性和轉(zhuǎn)化效果。設(shè)計(jì)該轉(zhuǎn)化方法的途徑如圖1所示。利用重組菌無細(xì)胞提取物催化不對稱轉(zhuǎn)化制備光學(xué)純芳基醇的方法，以重組菌無 細(xì)胞提取物為催化劑，并在該無細(xì)胞體系中添加輔助底物和初始輔酶NADP+實(shí)現(xiàn)輔酶NADPH 的再生循環(huán)，同時(shí)催化芳基酮不對稱轉(zhuǎn)化反應(yīng)制備光學(xué)純芳基醇；所用的輔助底物選用葡萄糖、海藻糖、麥芽糖、乳糖、乙醇、或果糖，濃度為10 20g/L ；輔酶NADPH初始添加量為0. 005 0. 2mM。所用的底物芳基酮選用2-羥基苯乙酮、間氯-2-羥基苯乙酮、對氯-2-羥基苯乙 酮、對甲基-2-羥基苯乙酮、對甲氧基-2-羥基苯乙酮、間氯-2-溴苯乙酮、對氯-2-溴苯乙 酮、對甲基-2-溴苯乙酮、對甲氧基-2-溴苯乙酮、苯乙酮、鄰氯苯乙酮、間氯苯乙酮、對氯苯 乙酮、對甲基苯乙酮、或?qū)籽趸揭彝?，濃度?0 80mM。(1)重組菌的構(gòu)建提取基因組的菌種為近平滑假絲酵母C. parapsilosis CCTCC M203011 ；近平滑假絲酵母(C.parapsilosis)CCTCC M203011 ；培養(yǎng)基(m/V，即 g/100mL雙蒸 水)葡萄糖 4%，酵母膏 0. 5%，(NH4)2HP04 1. 3%, KH2P04 0. 7%, ZnS047H20 0. 03%, NaCl 0. 01%, pH7. 0。將近平滑假絲酵母(C. parapsilosis)CCTCC M203011菌種接種于培養(yǎng)基裝液量
5為20%的250mL搖瓶中于30°C、150rpm振蕩培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束后，將菌體離心并用生理 鹽水洗滌兩次，收集細(xì)胞利用基因組DNA提取試劑盒Genomic DNA Extraction Miniprep System(VI0GENE公司)提取基因組。以近平滑假絲酵母(C. parapsilosis)CCTCC M203011基因組DNA作為PCR擴(kuò)增反 應(yīng)模板，利用含有Ndel限制性酶切位點(diǎn)的引物1和含有Xhol限制性酶切位點(diǎn)的引物2通 過PCR反應(yīng)擴(kuò)增scrl基因片斷；引物 1:5' -CCCGCCCGCATATGAGTAAAGACGAAACAATTTC-3'，引物 2 5 ‘ -GCCCGCTCGAGTGGGACAGTATAACCACCATC-3 ‘，PCR 反應(yīng)體系ddH20 37 u L, 10 X Reaction Buffer 5 u L, 25mmol/L dNTP 0. 5u L, 1 U L5 0pmol/ii L 弓| 物 1，1 ii L 50pmol/ii L 弓| 物 2，基因組 DNA 5 u L, 5U/ u LTaq DNA polymerase 0. 5 u L ；PCR 反應(yīng)過程為94°C預(yù)變性 5min ;94°C lmin，65°C lmin，72°C lmin，進(jìn)行 30 個(gè) 循環(huán)；72°C延伸lOmin ；PCR 產(chǎn)物利用 3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit (上海申能博彩生物 科技有限公司)純化DNA片斷。利用限制性內(nèi)切酶Ndel和Xhol對擴(kuò)增得到的scrl基因與載體pET21c進(jìn)行雙酶 切處理，處理后DNA片斷插入載體pET21c的Ndel和Xhol位點(diǎn)獲得帶有目的基因片斷的重 組質(zhì)粒PETSCR1，重組質(zhì)粒pETSCRl轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coliBL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，通過含有 100 u g/mL氨芐青霉素的LB平板篩選目的重組菌株E. coli BL21 (DE3) (pETSCRl)；應(yīng)用的典型例子為表達(dá)羰基還原酶基因的重組大腸桿菌Escherichia coliBL21 (DE3) (pETSCRl)，羰基還原酶基因scrl來自于近平滑假絲酵母(Candida parapsilosis CCTCC M203011)，該基因編碼羰基還原酶SCR1，催化不對稱還原2_羥基苯乙 酮為(S)-l-苯基-1，2-乙二醇的反應(yīng)?；騭crl見序列表SEQ ID N0 :1。PCR 產(chǎn)物利用 3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit (上海申能博彩生物 科技有限公司)純化DNA片斷。將目的基因PCR產(chǎn)物DNA片段和質(zhì)粒pET_21c進(jìn)行酶切。反應(yīng)體系組成10XH Buffer 4 u L, DNA 10 u L, Ndel 2 u L, Xhol 2 u L, dd H20 將體系補(bǔ)足 40 ii L，振蕩使液體充 分混勻，37°C水浴3h，在管中加入4ii L的Loading Buffer或?qū)⒐苤糜?5°C保溫lOmin，終 止酶切反應(yīng)。酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析并切膠回收目的片段，濃縮。將目的基因DNA片段與質(zhì)粒pET_21c連接，反應(yīng)體系組成如下質(zhì)粒pET_21c 0. 8ii L，外源基因 4. 2ii L，Ligation Solution 5 u L, ddH20 將體系補(bǔ)足 10 ii L?；旌线B接 液，將其置于16°C培養(yǎng)箱中連接16h。連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，在100 uL E. coli BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞懸液中加 入10yL連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰浴中靜置30min。轉(zhuǎn)入42°C水浴中，熱擊90秒。快速轉(zhuǎn)移 至冰浴中，冷卻2min。每管中加入700 ii L LB液體培養(yǎng)基，37°C、lOOrprn搖床溫育培養(yǎng)lh。 培養(yǎng)后菌液3，OOOrpm離心2min，棄上清600 u L，剩余菌液混勻后涂布到含有100 u g/mL氨 芐青霉素的LB平板上，37°C倒置培養(yǎng)。培養(yǎng)后的單菌落經(jīng)測序鑒定獲得含有羰基還原酶基因scrl的重組大腸桿菌 Escherichia coli BL21(DE3)(pETSCRl)。
(2)重組菌無細(xì)胞提取物的制備LB培養(yǎng)基，以g/L計(jì)胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，pH7. 0，氨芐青霉素 0. 05，固體培養(yǎng)基添加瓊脂粉15 ；挑取重組菌單菌落接種于3mL含50 y g/rnL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于 37°C,200rpm振蕩培養(yǎng)過夜；取lmL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于50mL含50 y g/mL氨芐青霉素的LB液 體培養(yǎng)基中，于37°C、200rpm振蕩培養(yǎng)至控制0D_約為0. 6 ；向培養(yǎng)物中加入誘導(dǎo)物異丙 基-0 -D-硫代半乳糖苷IPTG至終濃度0. 1 lmmol/L，在培養(yǎng)溫度17 30°C下誘導(dǎo)培養(yǎng) 12 15h ；培養(yǎng)后的重組大腸桿菌細(xì)胞10，OOOrpm離心lOmin并用生理鹽水洗滌三次后收集 細(xì)胞；菌體重新懸浮于PH 6. 5、0. 1M磷酸鉀緩沖液中配置成含有濕細(xì)胞濃度為100g/L的菌 懸液，菌懸液經(jīng)超聲破碎后離心，所得上清液總可溶蛋白濃度5 20g/L作為無細(xì)胞提取物 用于不對稱轉(zhuǎn)化反應(yīng)；(3)重組菌無細(xì)胞提取物催化不對稱轉(zhuǎn)化制備光學(xué)純芳基醇(a)水相反應(yīng)體系中無細(xì)胞提取物催化不對稱還原反應(yīng)2mL反應(yīng)體系組成lmL pH 6. 5、0. 1M磷酸鉀緩沖液，lmL無細(xì)胞提取物，提取物的 總可溶蛋白5 20mg/mL，10 20mg/mL輔助底物，10 80mM底物芳基酮，0. 005 0. 2mM NADP+ ；反應(yīng)混合物于20°C振蕩反應(yīng)2 12h，反應(yīng)后混合物用10mL乙酸乙酯萃取，有機(jī)相 用于產(chǎn)物分析；或(b)有機(jī)/水雙相反應(yīng)體系中無細(xì)胞提取物催化不對稱還原反應(yīng)2mL反應(yīng)體系組成0. 6mL pH 6. 5,0. 1M磷酸鉀緩沖液，0. 4mL有機(jī)溶劑，lmL無細(xì) 胞提取物，提取物的總可溶蛋白5 20mg/mL，10 20mg/mL輔助底物，10 80mM底物芳基 酮，0. 005 0. 2mM NADP+ ；反應(yīng)混合物于20°C振蕩反應(yīng)2 12h，反應(yīng)后混合物用10mL乙 酸乙酯萃取，有機(jī)相用于產(chǎn)物分析；反應(yīng)有機(jī)相所用有機(jī)溶劑為乙酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、 辛酸乙酯、壬酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、辛醇、二甲苯、或 異丙醚。產(chǎn)物通過手性固定相高效液相色譜(Agilent HP1100)或手性氣相色譜(Agilent 7890A)進(jìn)行分析。手性液相色譜柱為 Chiralcel 0B-H 柱(4. 6mmX 25cm ;Daicel Chemical Ind.，Ltd.，Japan)或 Chiralcel 0D—H 柱(4. 6mmX 25cm ；Daicel Chemical Ind.，Ltd.， Japan)，流動相為正己烷/異丙醇(90/10 98/2)，流速0. 4 0. 8mL/min,檢測波長為 215nm。手性氣相色譜柱為 CP-Chirasil-Dex CB chiral capillary column (25mX0. 25mm ； Varian, USA)。產(chǎn)物的光學(xué)純度通過對映過量值來衡量。產(chǎn)物對映過量值的計(jì)算對映過量值(e. e. % ) = [ (CS_CK) / (CS+CE) ] X 100%產(chǎn)物產(chǎn)率的計(jì)算產(chǎn)率(％ ) = CS/C0X 100%式中Cs為反應(yīng)后⑶_對映體的濃度，CE為反應(yīng)后(R)-對映體的濃度，C0為反應(yīng) 前底物的濃度。2-羥基苯乙酮、間氯-2-羥基苯乙酮、對氯-2-羥基苯乙酮、對甲基-2-羥基苯乙 酮、對甲氧基-2-羥基苯乙酮、間氯-2-溴苯乙酮、對氯-2-溴苯乙酮、對甲基-2-溴苯乙酮、 對甲氧基-2-溴苯乙酮、苯乙酮、鄰氯苯乙酮、間氯苯乙酮、對氯苯乙酮、對甲基苯乙酮、或?qū)籽趸揭彝?，?jīng)轉(zhuǎn)化后得到對應(yīng)的產(chǎn)物為(S)-l-苯基-1，2-乙二醇、(S)-間氯-1-苯 基-1，2-乙二醇、⑶-對氯-1-苯基-1，2-乙二醇、(S)-對甲基-1-苯基-1，2-乙二醇、 (S)_對甲氧基-1-苯基-1，2-乙二醇、(S)-間氯-2-溴苯乙醇、(S)-對氯-2-溴苯乙醇、 (S)_對甲基-2-溴苯乙醇、(S)-對甲氧基-2-溴苯乙醇、(S)-l-苯乙醇、(S)-鄰氯-1-苯 乙醇、(S)-間氯-1-苯乙醇、(S)-對氯-1-苯乙醇、(S)-對甲基-1-苯乙醇、或(S)-對甲 氧基-1-苯乙醇，光學(xué)純度為90 100% e. e.，產(chǎn)率為50 95%。與純酶反應(yīng)體系相比，該無細(xì)胞提取物催化體系不需額外添加輔酶再生所需的耦 聯(lián)酶，通過在反應(yīng)體系中添加10 20g/L輔助底物，初始輔酶0. 005 0. 2mM NADP+，實(shí)現(xiàn) 反應(yīng)必須輔酶NADPH的再生循環(huán)，輔酶總轉(zhuǎn)換數(shù)為936 3604，大大簡化了反應(yīng)系統(tǒng)的復(fù)雜 性；與細(xì)胞反應(yīng)體系相比，該無細(xì)胞提取物催化體系解除了細(xì)胞膜對底物/產(chǎn)物進(jìn)出細(xì)胞 的阻礙，大大縮短了反應(yīng)時(shí)間，反應(yīng)時(shí)間由全細(xì)胞催化體系的12 48h縮短至2 12h，提 高了不對稱轉(zhuǎn)化效果。此外，該無細(xì)胞系統(tǒng)還可適用于其他催化不對稱轉(zhuǎn)化的醇脫氫酶和 羰基還原酶，具有較為廣泛應(yīng)用價(jià)值。(3)有益效果本發(fā)明與通常采用的純酶或全細(xì)胞催化方式不同，是一種利用重組菌無細(xì)胞提取 物催化不對稱轉(zhuǎn)化制備光學(xué)純芳基醇的方法。利用該無細(xì)胞系統(tǒng)催化反應(yīng)，無需在反應(yīng)體 系中額外添加輔酶再生所需的耦聯(lián)酶，同時(shí)提高了酶與底物直接作用的效率，縮短反應(yīng)時(shí) 間，從而獲得較好的轉(zhuǎn)化效果。在水相或有機(jī)/水雙相的不對稱轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系中，利用重組菌無細(xì)胞提取物催 化不同底物芳基酮，均可獲得光學(xué)純的反應(yīng)產(chǎn)物芳基醇對映體，產(chǎn)物光學(xué)純度為90% 100% e. e.，產(chǎn)率為50% 90%。通過在反應(yīng)體系中添加10 20g/L輔助底物，初始輔酶 0. 005 0. 2mM NADP+，實(shí)現(xiàn)反應(yīng)必需輔酶NADPH的再生循環(huán)，輔酶總轉(zhuǎn)換數(shù)為936 3604。 反應(yīng)時(shí)間由全細(xì)胞催化體系的12 48h縮短至2 12h。該無細(xì)胞系統(tǒng)不僅提供了一種新的生物催化不對稱轉(zhuǎn)化的反應(yīng)方式，既實(shí)現(xiàn)了生 物催化氧化還原必需的輔酶再生，又提高了生物轉(zhuǎn)化的整體效果，而且該系統(tǒng)還可適用于 其他催化不對稱轉(zhuǎn)化的醇脫氫酶和羰基還原酶，是一種具有廣泛適用性的經(jīng)濟(jì)、方便、有效 的生物催化系統(tǒng)，具有較為廣泛應(yīng)用價(jià)值。生物材料樣品保藏近平滑假絲酵母，保藏日期2003年3月1日，保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心 CCTCC，菌株編號M203011。該菌株已在中國專利CN 1212403C公告。


圖1本發(fā)明轉(zhuǎn)化方法的途徑示意圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1重組菌無細(xì)胞提取物的制備LB培養(yǎng)基組成為胰蛋白胨1%，酵母提取物0. 5%, NaCl 1%, pH7.0o需要時(shí)使用前加入氨芐青霉素(50 yg/mL)，固體培養(yǎng)基添加1.5%瓊 脂粉。挑取陽性重組菌單菌落接種于3mL含50 y g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。取lmL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于50mL含50 y g/mL氨芐青霉素的LB液 體培養(yǎng)基中，于37°C、200rpm振蕩培養(yǎng)至0D6(1(1約為0. 6。向培養(yǎng)物中加入誘導(dǎo)物IPTG至終 濃度0. lmmol/L，在培養(yǎng)溫度17°C下誘導(dǎo)培養(yǎng)12h。培養(yǎng)后的重組大腸桿菌細(xì)胞10，OOOrpm 離心lOmin并用生理鹽水洗滌三次后收集。菌體重新懸浮于磷酸鉀緩沖液(pH 6. 5,0. 1M) 中配置成含有濕細(xì)胞濃度為100g/L的菌懸液，菌懸液經(jīng)超聲破碎后離心，所得上清液(總 可溶蛋白濃度10g/L)作為無細(xì)胞提取物用于不對稱轉(zhuǎn)化反應(yīng)。實(shí)施例2重組菌無細(xì)胞提取物的制備LB培養(yǎng)基組成為胰蛋白胨1%，酵母提取物0. 5%, NaCl 1%, pH7.0o需要時(shí)使用前加入氨芐青霉素(50 y g/mL)，固體培養(yǎng)基添加1.5%瓊 脂粉。挑取陽性重組菌單菌落接種于3mL含50 y g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于 37°C,200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。取lmL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于50mL含50 y g/mL氨芐青霉素的LB液體 培養(yǎng)基中，于37°C、200rpm振蕩培養(yǎng)至0D6(1(1約為0. 6。向培養(yǎng)物中加入誘導(dǎo)物IPTG至終濃 度lmmol/L，在培養(yǎng)溫度30°C下誘導(dǎo)培養(yǎng)15h。培養(yǎng)后的重組大腸桿菌細(xì)胞10，OOOrpm離心 lOmin并用生理鹽水洗滌三次后收集。菌體重新懸浮于磷酸鉀緩沖液(pH 6.5、0. 1M)中配 置成含有濕細(xì)胞濃度為100g/L的菌懸液，菌懸液經(jīng)超聲破碎后離心，所得上清液(總可溶 蛋白濃度5g/L)作為無細(xì)胞提取物用于不對稱轉(zhuǎn)化反應(yīng)。實(shí)施例3重組菌無細(xì)胞提取物的制備LB培養(yǎng)基組成為胰蛋白胨1%，酵母提取物0. 5%, NaCl 1%, pH7.0o需要時(shí)使用前加入氨芐青霉素(50 y g/mL)，固體培養(yǎng)基添加1.5%瓊 脂粉。挑取陽性重組菌單菌落接種于3mL含50 y g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于 37°C、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。取lmL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于50mL含50 y g/mL氨芐青霉素的LB液 體培養(yǎng)基中，于37°C、200rpm振蕩培養(yǎng)至0D6(1(1約為0. 6。向培養(yǎng)物中加入誘導(dǎo)物IPTG至終 濃度0. 5mmol/L，在培養(yǎng)溫度17°C下誘導(dǎo)培養(yǎng)15h。培養(yǎng)后的重組大腸桿菌細(xì)胞10，OOOrpm 離心lOmin并用生理鹽水洗滌三次后收集。菌體重新懸浮于磷酸鉀緩沖液(pH 6. 5,0. 1M) 中配置成含有濕細(xì)胞濃度為100g/L的菌懸液，菌懸液經(jīng)超聲破碎后離心，所得上清液(總 可溶蛋白濃度20g/L)作為無細(xì)胞提取物用于不對稱轉(zhuǎn)化反應(yīng)。實(shí)施例4水相反應(yīng)體系中無細(xì)胞提取物催化不對稱還原反應(yīng)2mL反應(yīng)體系組成為lmL磷 酸鉀緩沖液(PH6. 5,0. 1M)，lmL無細(xì)胞提取物(總可溶蛋白15mg/mL)，10g/L葡萄糖，40mM 2-羥基苯乙酮，0.02mM NADP+。反應(yīng)混合物于20°C振蕩反應(yīng)6h，反應(yīng)后混合物用10mL乙酸 乙酯萃取，產(chǎn)物(3)-1-苯基-1，2_乙二醇的光學(xué)純度99% e. e.，產(chǎn)率93%。實(shí)施例5水相反應(yīng)體系中無細(xì)胞提取物催化不對稱還原反應(yīng)2mL反應(yīng)體系組成為lmL磷 酸鉀緩沖液(pH6. 5,0. 1M)，lmL無細(xì)胞提取物(總可溶蛋白15mg/mL)，10g/L海藻糖，10mM 2-羥基苯乙酮，0.02mM NADP+。反應(yīng)混合物于20°C振蕩反應(yīng)2h，反應(yīng)后混合物用10mL乙酸 乙酯萃取，產(chǎn)物(3)-1-苯基-1，2_乙二醇的光學(xué)純度99% e. e.，產(chǎn)率95%。實(shí)施例6有機(jī)/水雙相反應(yīng)體系中無細(xì)胞提取物催化不對稱還原反應(yīng)2mL反應(yīng)體系組成 為0.6mL磷酸鉀緩沖液(pH 6.5,0. 1M)，0. 4mL月桂酸乙酯，lmL無細(xì)胞提取物(總可溶蛋白20mg/mL)，10g/L葡萄糖，80mM 2-羥基苯乙酮，0. 02mM NADP+。反應(yīng)混合物于20°C振蕩反應(yīng) 12h，反應(yīng)后混合物用10mL乙酸乙酯萃取，產(chǎn)物(幻-1-苯基-1，2_乙二醇的光學(xué)純度99% e. e.，產(chǎn)率 90%。實(shí)施例7有機(jī)/水雙相反應(yīng)體系中無細(xì)胞提取物催化不對稱還原反應(yīng)2mL反應(yīng)體系組成 為0. 6mL磷酸鉀緩沖液(pH 6. 5,0. 1M)，0. 4mL辛烷，lmL無細(xì)胞提取物(總可溶蛋白15mg/ mL)，10g/L葡萄糖，40mM 2-羥基苯乙酮，0. 02mMNADP+。反應(yīng)混合物于20°C振蕩反應(yīng)6h，反 應(yīng)后混合物用10mL乙酸乙酯萃取，產(chǎn)物(S)-l-苯基-1，2-乙二醇的光學(xué)純度99% e. e.， 產(chǎn)率50%。實(shí)施例8有機(jī)/水雙相反應(yīng)體系中無細(xì)胞提取物催化不對稱還原反應(yīng)2mL反應(yīng)體系組成 為0. 6mL磷酸鉀緩沖液(pH 6. 5,0. 1M)，0. 4mL月桂酸乙酯，lmL無細(xì)胞提取物(總可溶蛋 白5 20mg/mL)，10g/L葡萄糖，25mM對氯-2-羥基苯乙酮，0. 02mM NADP+。反應(yīng)混合物于 20°C振蕩反應(yīng)6h，反應(yīng)后混合物用10mL乙酸乙酯萃取，產(chǎn)物(S)-對氯-1-苯基-1，2-乙二 醇的光學(xué)純度99% e. e.，產(chǎn)率71%。實(shí)施例9有機(jī)/水雙相反應(yīng)體系中無細(xì)胞提取物催化不對稱還原反應(yīng)2mL反應(yīng)體系組成 為0.6mL磷酸鉀緩沖液(pH 6.5,0. 1M)，0. 4mL月桂酸乙酯，lmL無細(xì)胞提取物(總可溶蛋白 5 20mg/mL)，10g/L葡萄糖，25mM對氯-2-溴苯乙酮，0. 02mM NADP+。反應(yīng)混合物于20°C 振蕩反應(yīng)6h，反應(yīng)后混合物用10mL乙酸乙酯萃取，產(chǎn)物(S)-對氯-2-溴苯乙醇的光學(xué)純度 99% e. e.，產(chǎn)率 51%。
權(quán)利要求
一種利用重組菌無細(xì)胞提取物催化不對稱轉(zhuǎn)化制備光學(xué)純芳基醇的方法，其特征在于以重組菌無細(xì)胞提取物為催化劑，并在該無細(xì)胞體系中添加輔助底物和初始輔酶NADP+實(shí)現(xiàn)輔酶NADPH的再生循環(huán)，同時(shí)催化芳基酮不對稱轉(zhuǎn)化反應(yīng)制備光學(xué)純芳基醇；所用的輔助底物選用葡萄糖、海藻糖、麥芽糖、乳糖、乙醇、或果糖，濃度為10～20g/L；輔酶NADPH初始添加量為0.005～0.2mM；所用的底物芳基酮選用2-羥基苯乙酮、間氯-2-羥基苯乙酮、對氯-2-羥基苯乙酮、對甲基-2-羥基苯乙酮、對甲氧基-2-羥基苯乙酮、間氯-2-溴苯乙酮、對氯-2-溴苯乙酮、對甲基-2-溴苯乙酮、對甲氧基-2-溴苯乙酮、苯乙酮、鄰氯苯乙酮、間氯苯乙酮、對氯苯乙酮、對甲基苯乙酮、或?qū)籽趸揭彝瑵舛葹?0～80mM；(1)重組菌的構(gòu)建提取基因組的菌種為近平滑假絲酵母C.parapsilosis CCTCC M203011；以近平滑假絲酵母(C.parapsilosis)CCTCC M203011基因組DNA作為PCR擴(kuò)增反應(yīng)模板，利用含有NdeI限制性酶切位點(diǎn)的引物1和含有XhoI限制性酶切位點(diǎn)的引物2通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增scr1基因片斷；引物15′-CCCGCCCGCATATGAGTAAAGACGAAACAATTTC-3′，引物25′-GCCCGCTCGAGTGGGACAGTATAACCACCATC-3′，PCR反應(yīng)體系ddH2O 37μL，10×Reaction Buffer 5μL，25mmol/L dNTP 0.5μL，1μL 50pmol/μL引物1，1μL 50pmol/μL引物2，基因組DNA 5μL，5U/μLTaq DNA polymerase 0.5μL；PCR反應(yīng)過程為94℃預(yù)變性5min；94℃ 1min，65℃ 1min，72℃ 1min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；利用限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI對擴(kuò)增得到的scr1基因與載體pET21c進(jìn)行雙酶切處理，處理后DNA片斷插入載體pET21c的NdeI和XhoI位點(diǎn)獲得帶有目的基因片斷的重組質(zhì)粒pETSCR1，重組質(zhì)粒pETSCR1轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，通過含有100μg/mL氨芐青霉素的LB平板篩選目的重組菌株E.coli BL21(DE3)(pETSCR1)；(2)重組菌無細(xì)胞提取物的制備LB培養(yǎng)基，以g/L計(jì)胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，pH7.0，氨芐青霉素0.05，固體培養(yǎng)基添加瓊脂粉15；挑取重組菌單菌落接種于3mL含50μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜；取1mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于50mL含50μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)至控制OD600為0.6；向培養(yǎng)物中加入誘導(dǎo)物異丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG至終濃度0.1～1mmol/L，在培養(yǎng)溫度17～30℃下誘導(dǎo)培養(yǎng)12～15h；培養(yǎng)后的重組大腸桿菌細(xì)胞10,000rpm離心10min，并用生理鹽水洗滌三次后收集細(xì)胞；菌體重新懸浮于pH 6.5、0.1M磷酸鉀緩沖液中配置成含有濕細(xì)胞濃度為100g/L的菌懸液，菌懸液經(jīng)超聲破碎后離心，所得上清液總可溶蛋白濃度5～20g/L作為無細(xì)胞提取物用于不對稱轉(zhuǎn)化反應(yīng)；(3)重組菌無細(xì)胞提取物催化不對稱轉(zhuǎn)化制備光學(xué)純芳基醇(a)水相反應(yīng)體系中無細(xì)胞提取物催化不對稱還原反應(yīng)2mL反應(yīng)體系組成1mL pH 6.5、0.1M磷酸鉀緩沖液，1mL無細(xì)胞提取物，提取物的總可溶蛋白5～20mg/mL，10～20mg/mL輔助底物，10～80mM底物芳基酮，0.005～0.2mM NADP+；反應(yīng)混合物于20℃振蕩反應(yīng)2～12h，反應(yīng)后混合物用10mL乙酸乙酯萃取，有機(jī)相用于產(chǎn)物分析；或(b)有機(jī)/水雙相反應(yīng)體系中無細(xì)胞提取物催化不對稱還原反應(yīng)2mL反應(yīng)體系組成0.6mL pH 6.5、0.1M磷酸鉀緩沖液，0.4mL有機(jī)溶劑，1mL無細(xì)胞提取物，提取物的總可溶蛋白5～20mg/mL，10～20mg/mL輔助底物，10～80mM底物芳基酮，0.005～0.2mM NADP+；反應(yīng)混合物于20℃振蕩反應(yīng)2～12h，反應(yīng)后混合物用10mL乙酸乙酯萃取，有機(jī)相用于產(chǎn)物分析；反應(yīng)有機(jī)相所用有機(jī)溶劑為乙酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、壬酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、辛醇、二甲苯、或異丙醚。
全文摘要
一種利用重組菌無細(xì)胞提取物催化不對稱轉(zhuǎn)化制備光學(xué)純芳基醇的方法，屬于生物催化不對稱轉(zhuǎn)化技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明在水相或有機(jī)/水雙相反應(yīng)體系中，利用重組菌無細(xì)胞提取物催化不同底物芳基酮，獲得光學(xué)純芳基醇，產(chǎn)物光學(xué)純度為90％～100％e.e.，產(chǎn)率為50％～90％。通過添加10～20g/L輔助底物，初始輔酶0.005～0.2mM NADP+，實(shí)現(xiàn)反應(yīng)必需輔酶NADPH的再生循環(huán)，輔酶總轉(zhuǎn)換數(shù)為936～3604。反應(yīng)時(shí)間由全細(xì)胞催化體系的12～48h縮短至2～12h。與常規(guī)純酶或全細(xì)胞催化方式不同，該無細(xì)胞系統(tǒng)不需額外添加輔酶再生所需的耦聯(lián)酶，同時(shí)縮短反應(yīng)時(shí)間，而且該系統(tǒng)還適用于其他的醇脫氫酶和羰基還原酶，是一種具有廣泛適用性的經(jīng)濟(jì)、方便、有效的生物催化系統(tǒng)。
文檔編號C12N15/63GK101857887SQ20101020557
公開日2010年10月13日 申請日期2010年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月13日
發(fā)明者徐巖, 聶堯, 閆真 申請人:江南大學(xué)