專利名稱：一種可連接多片段的重疊延伸pcr方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及DNA的體外重組方法，具體涉及重疊延伸PCR。
背景技術(shù)：
重疊延伸PCR技術(shù)(SOE-PCR) 1989年由Horton等建立。該技術(shù)采用具有互補(bǔ)末 端的引物，使PCR產(chǎn)物形成了重疊鏈，從而在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過重疊鏈的延伸，將不同 來源的擴(kuò)增片段重疊拼接起來，實(shí)現(xiàn)體外基因重組。SOE-PCR技術(shù)可以獲得依靠限制性內(nèi)切 酶消化的方法難以得到的產(chǎn)物，并且方便快速，在進(jìn)行大片段基因的定點(diǎn)突變、基因片段刪 除以及多個(gè)編碼序列嵌合連接上具有獨(dú)有的優(yōu)勢(shì)。但常規(guī)SOE-PCR技術(shù)也存在反應(yīng)效率受初始模板數(shù)量多少和比例的制約、擴(kuò)增非 特異性條帶多等問題，需要對(duì)初始模版的摩爾比以及加入模板的量進(jìn)行多次摸索實(shí)驗(yàn)才能 獲得理想擴(kuò)增效果。此外，常規(guī)的SOE-PCR難以實(shí)現(xiàn)三個(gè)或三個(gè)以上的片段的同時(shí)連接。傳統(tǒng)的做法 是先將相鄰的兩片段分別連接，再將連接產(chǎn)物與其它片段或連接產(chǎn)物進(jìn)行二次或者多次連 接，這種方法增加了 PCR擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)，也相應(yīng)增加了所獲DNA產(chǎn)物的突變機(jī)率。另 一種做法是在進(jìn)行三向及多向連接時(shí)在引物兩端引入酶切位點(diǎn)，但是這樣一般也會(huì)同時(shí)引 入突變(點(diǎn)突變或插入突變)，并且也需要估計(jì)模板間的連接比率，還由于添加的堿基數(shù)量 有限，必然導(dǎo)致酶切效率低下，對(duì)用作多向連接原始模板的量要求高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種可進(jìn)行多片段同時(shí)拼接的重疊延伸PCR方法。本發(fā)明解決上述問題的技術(shù)方案是—種可連接多片段的重疊延伸PCR方法，該方法由以下步驟組成(1)亞片段的合成針對(duì)不同的目的亞片段設(shè)計(jì)并合成具有互補(bǔ)末端的引物，以 具有目的亞片段的DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下進(jìn)行平行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出具有重疊 末端的亞片段；(2)亞片段的連接將所得亞片段等摩爾混合，加入步驟(1)中用于合成亞片段的 所有引物，在DNA聚合酶的作用下進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)，通過亞片段重疊末端的延伸使各亞 片段DNA連接成目的長片度；所述引物的用量比例為位于目的長片度兩末端的引物與位 于目的長片段拼接區(qū)域的引物的摩爾比為40 120 1 ；上述步驟中，所述亞片段的數(shù)量為2 5個(gè)；所述引物由位于目的長片段兩末端的引物與位于目的長片段拼接區(qū)域的引物組 成，其中位于目的長片段拼接區(qū)域的引物兩兩互補(bǔ)。本發(fā)明方法具有以下優(yōu)點(diǎn)
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(1)不需要人為的優(yōu)化模板組合。本發(fā)明方法在延伸步驟模板中通過引入非對(duì)稱 量的引物，從而實(shí)現(xiàn)初始短片段模板間的等摩爾擴(kuò)增，具有放大原始模板的作用，因此在低 豐度的模板延伸反應(yīng)也具有應(yīng)用價(jià)值。(2)由于設(shè)計(jì)時(shí)相鄰擴(kuò)增模板間的重疊引物本身完全互補(bǔ)，發(fā)生特異性擴(kuò)增的幾 率要高于非特異性擴(kuò)增的幾率，電泳結(jié)果顯示出來的特異性非常理想。(3)本發(fā)明方法實(shí)現(xiàn)了同一次反應(yīng)中進(jìn)行多片段的堿基延伸連接，相比之下減少 了反應(yīng)循環(huán)次數(shù)，又能高效率的擴(kuò)增出目的片段，經(jīng)多次驗(yàn)證是一種切實(shí)可行的減少突變 同時(shí)又能高效率擴(kuò)增的方法。


圖1是例1亞片段擴(kuò)增PCR產(chǎn)物電泳圖，其中，泳道1是PLG3-8片段3，泳道2是 p-IRES-EGFPg印區(qū)段擴(kuò)增片段4，泳道3是擴(kuò)增PLG3-8片段5，泳道Marker是DL5000分子 量標(biāo)準(zhǔn)。圖2是采用傳統(tǒng)SOE-PCR進(jìn)行兩兩拼接的產(chǎn)物電泳圖，其中，泳道1是SOE-PCR產(chǎn) 物，泳道Marker是DL5000分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖3是采用本發(fā)明方法進(jìn)行兩兩拼接的產(chǎn)物電泳圖，其中，泳道1是SOE-PCR產(chǎn) 物，泳道Marker是DL5000分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖4是采用本發(fā)明方法進(jìn)行三個(gè)片段同時(shí)拼接的產(chǎn)物電泳圖，其中，泳道1是 SOE-PCR產(chǎn)物，泳道Marker是DL5000分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖5是采用本發(fā)明方法進(jìn)行三個(gè)片段同時(shí)拼接的所得產(chǎn)物的酶切鑒定電泳圖，泳 道1是酶切產(chǎn)物，泳道Marker是DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖6是例2亞片段擴(kuò)增PCR產(chǎn)物電泳圖，其中，泳道1是PLG3-8片段1，泳道2是 PLG3-8片段2，泳道3是擴(kuò)增p-IRES-EGFPegfp區(qū)段擴(kuò)增片段3，泳道4是擴(kuò)增PLG3-8片段 4，泳道5是擴(kuò)增PLG3-8片段5，泳道Marker是DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖7是采用本發(fā)明方法進(jìn)行多片段連接(例2)與采用傳統(tǒng)SOE-PCR進(jìn)行多片段 連接的對(duì)比結(jié)果電泳圖，泳道1和2是采用傳統(tǒng)SOE-PCR進(jìn)行4片段連接的產(chǎn)物，泳道3和 4是采用本發(fā)明方法進(jìn)行4片段同時(shí)連接的產(chǎn)物，泳道5是采用傳統(tǒng)SOE-PCR進(jìn)行5片段連 接的產(chǎn)物，泳道6是采用本發(fā)明方法進(jìn)行5片段同時(shí)連接的產(chǎn)物，泳道M為DL1000+DL8000 分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖8是SOE-PCR連接反應(yīng)產(chǎn)物的電泳圖，泳道Maker為DL8000，1至5分別為中間 引物物質(zhì)的量依次為末端引物的1/40、1/80、1/120、1/160、1/200倍時(shí)的擴(kuò)增結(jié)果，三角形 符號(hào)標(biāo)注處為目的產(chǎn)物。
具體實(shí)施例方式例 1以馬傳染性貧血病毒感染性克隆株定點(diǎn)插入熒光標(biāo)簽標(biāo)記物IRES-EGFP進(jìn)行說 明，插入堿基大小為1. 3kbp，SOE-PCR總擴(kuò)增長度為4. 16kbp，其中載體PLG3-8中分別在 7097nt以及8288nt處含有單酶切位點(diǎn)XbaI以及Xhol，對(duì)PLG3-8實(shí)行雙酶切處理后短片 段長度約為1. 2kbp。圖略見

圖1。
1、引物設(shè)計(jì)根據(jù)已發(fā)表EIAV(GENBANK AF327878)疫苗株核苷酸序列以及實(shí)驗(yàn) 室獲得的疫苗株全序列，利用oligo5. 0設(shè)計(jì)2對(duì)引物擴(kuò)增PLG3-8質(zhì)粒3 ’端LTR前后插入 位置兩段基因，預(yù)計(jì)擴(kuò)增的片斷分別為1. 8kb (引物Penvl和Penv2擴(kuò)增)和1. lkb(PLTRl 和PLTR2擴(kuò)增)。同時(shí)對(duì)插入序列IRES-EGFP載體p_IRES_EGFP設(shè)計(jì)一對(duì)引物，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片 段為1.3kbp (引物Gfpl和Gfp2擴(kuò)增)。引物序列和位置見表1。由下表可看出，引物設(shè)計(jì) 時(shí)設(shè)計(jì)成了 Perw2和Gfpl完全互補(bǔ)，PLTRl和Gfp2完全互補(bǔ)的形式，這樣操作以保證后期 連接操作時(shí)的特異性擴(kuò)增。表1基因擴(kuò)增所用到的引物 2、亞片段模板制備質(zhì)粒PCR 氨芐抗性篩選載體質(zhì)粒EIAV感染性克隆株P(guān)LG3-8以及帶有 pIRES-EGFP全長基因載體獲得擴(kuò)增模板。擴(kuò)增采用高保真聚合酶，用引物Eiav v3_l和 Eiav 3-2擴(kuò)增出EIAV感染性克隆株P(guān)LG3-8enV3'區(qū)域長約1. 8kb的核酸序列，簡稱片段 3 ；其中該片斷中含有一個(gè)單酶切位點(diǎn)XbaI (7097nt) ；Eiav 5-1和Eiav 5-2擴(kuò)增出EIAV 感染性克隆株的LTR5'端約1. Ikb的核酸序列，簡稱片段5 ；其中該片段中含有PLG3-8 序列中的一個(gè)單酶切位點(diǎn)Xho 1 (8288nt) ；Gfp4_l和Gfp4_2從載體質(zhì)粒中擴(kuò)增出帶有 IRES-EGFP約1. 3kb的核酸序列，簡稱片段4。擴(kuò)增結(jié)果見

圖2。PCR 反應(yīng)體系如下10 X Pyrobest Bufer (Mg2+2. 5mM) 5 μ 1，dNTP (IOmM) 1 μ 1，上下 游引物各 1 μ 1 (10 μ Μ)，Pyrobest DNA 聚合酶 0. 25 μ 1 (1. 25U)，模板核酸 1 μ 1 (200ng)，加 水補(bǔ)足50 μ 1。反應(yīng)程序?yàn)?4"C 4min 預(yù)變性； 72°C 延伸 7min。以瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物。采用小量凝膠回收試劑盒按說明書推薦方 法回收PCR產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)回收產(chǎn)物，估計(jì)回收產(chǎn)物間摩爾比。電泳結(jié)果如 圖1所示，條帶大小位置與預(yù)期相符。3、SOE-PCR對(duì)產(chǎn)物的連接
(1)采用本發(fā)明方法首先進(jìn)行兩兩連接試驗(yàn)，加入等量初始模板，擴(kuò)增模板兩側(cè)引 物的摩爾濃度為中間重疊區(qū)域引物的摩爾濃度的100倍將片段1和2連接時(shí)，分別加入10 μ M的引物Penvl和Gfp2各1 μ 1，加入0. 1 μ M 的Penv2和Gfpl各1 μ 1 ；將片段2和3進(jìn)行連接時(shí)，分別加入10 μ M的Gfpl和PLTR2各 1 μ 1，加入0. 1 μ M的Gfp2和PLTRl各1 μ 1。另需在兩兩連接反應(yīng)體系中加入Ex Tag DNA 聚合酶0.25 μ 1、Ex Tag Buffer 5 μ l.dNTP 1 μ 1，加入估計(jì)量等摩爾模板每約50ng，加水 補(bǔ)足總反應(yīng)體系為50 μ 1。反應(yīng)程序?yàn)?
55°C退火30sec,〖進(jìn)行30個(gè)循環(huán)； 72°C延伸 2min30s，J72°C 延伸 7min。擴(kuò)增結(jié)果見圖3。用本發(fā)明方法方法進(jìn)行三條短片段同時(shí)連接加入三條短片段純化產(chǎn)物各2 μ 1 (約50 IOOng)，引物Penvl、PLTR2各 1 μ 1 (10 μ Μ) ,Penv2,PLTRUGfpl 以及 Gfp2 各 1 μ 1 (0. 1 μ Μ)，Ex Tag DNA 聚合酶 0. 25 μ 1, Ex Tag Buffer5y l,dNTP 2 μ 1，加入估計(jì)量等摩爾模板每約50ng，加水補(bǔ)足總反應(yīng)體系為 50 μ 1。反應(yīng)程序?yàn)?4°C 4min預(yù)變性，94°C變性30sec，55°C退火30sec，72°C延伸4min進(jìn) 行30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸7min。1 %瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證條帶位置，結(jié)果見圖4。對(duì)三片 段連接產(chǎn)物切膠回收后采用Xba I以及Xho I酶切電泳驗(yàn)證，結(jié)果見圖5同時(shí)為便于對(duì)比，我們還采用傳統(tǒng)的重疊延伸擴(kuò)增方法即不加入中間稀釋量的 引物進(jìn)行了兩兩片段的連接以及進(jìn)行了三片段的連接，擴(kuò)增結(jié)果見圖2(陰性結(jié)果則未顯 示)°從上述結(jié)果可以看出，采用傳統(tǒng)的SOE-PCR操作方法對(duì)PLG3-8LTR5 ‘區(qū)域長約1. 1Kb的核酸序列以及 IRES-EGFP約1.3Kb的核酸序列連接產(chǎn)物，總長度為2. 4Kb (如圖2所示)，目的條帶強(qiáng)度暗； 采用傳統(tǒng)的SOE-PCR進(jìn)行三段亞片段模板同時(shí)連接則沒有出現(xiàn)目的條帶的擴(kuò)增結(jié)果。采用本發(fā)明方法進(jìn)行兩兩連接PLG3-8LTR5'區(qū)域長約1. 1Kb的核酸序列以及 IRES-EGFP約1. 3Kb的核酸序列連接產(chǎn)物總長度為2. 4Kb，PLG3_8env 3'區(qū)域長約1. 8Kb 的核酸序列以及IRES-EGFP約1. 3Kb的核酸序列連接產(chǎn)物總長度為3. Ikbp (如圖3所示) 目的條帶擴(kuò)增清晰，豐度高特異性好；改進(jìn)后的SOE-PCR方法進(jìn)行三片段連接得到約4. 2kb 左右位置條帶(如圖4所示)，切膠回收三片段連接產(chǎn)物后用XbaI以及Xhol酶切驗(yàn)證擴(kuò)增 片段。酶切結(jié)果得到長度為2493bp，971bp以及702bp產(chǎn)物，其中長度為2493bp產(chǎn)物片段 酶切后中間片段，長度為971bp產(chǎn)物片段為長片段經(jīng)Xba I酶切后產(chǎn)物片段，產(chǎn)物條帶位置 均符合預(yù)期，驗(yàn)證了擴(kuò)增片段為目的擴(kuò)增(如圖5所示)。后期對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果表明，長度為4. 2kb的擴(kuò)增產(chǎn)物，突變 堿基數(shù)為1個(gè)，其突變率為1/4200。
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對(duì)比實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，無論是在產(chǎn)物豐度還是特異性上，改進(jìn)后的SOE-PCR明顯 優(yōu)于不加引物預(yù)制模板的傳統(tǒng)SOE-PCR方法。在涉及到多片段連接操作時(shí)其可減少操作次 數(shù)，理論上可減少突變概率。例 2仍以慢病毒屬馬傳染性貧血病毒(EIAV)感染性克隆PLG3-8株和pIRES_EGFP進(jìn) 行多片段連接。1、引物設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)引物對(duì)，如表2所示。表2基因擴(kuò)增所用到的引物 2、亞片段模板制備質(zhì)粒PCR 氨芐抗性篩選載體質(zhì)粒EIAV感染性克隆株P(guān)LG3-8以及帶有 pIRES-EGFP全長基因載體獲得擴(kuò)增模板。擴(kuò)增采用高保真聚合酶，用引物Eiav 1_1和 Eiav 1-2擴(kuò)增出EIAV感染性克隆株P(guān)LG3-8中長約2. Ikb的核酸序列，簡稱片段1 ；用引物 Eiav 2-1和Eiav 2-2擴(kuò)增出EIAV感染性克隆株P(guān)LG3_8env3'區(qū)域長約1. 4kb的核酸序 列，簡稱片段2 ；用引物Eiav 3-1和Eiav 3_2擴(kuò)增出EIAV感染性克隆株P(guān)LG3-8enV3‘區(qū) 域長約1. Skb的核酸序列，簡稱片段3 ；Eiav 5-1和Eiav 5-2擴(kuò)增出EIAV感染性克隆株的 LTR5'端約l.lkb的核酸序列，簡稱片段5 ;Gfp 4-1和Gfp 4_2從載體質(zhì)粒中擴(kuò)增出帶有 IRES-EGFP約1. 3kb的核酸序列，簡稱片段4。擴(kuò)增結(jié)果見

圖7.PCR 反應(yīng)體系如下10 X Pyrobest Bufer (Mg2+2. 5mM) 5 μ UdNTP(IOmM) 1 μ 1、上下 游引物各 1 μ 1 (10 μ Μ)、Pyrobest DNA 聚合酶 0. 25 μ 1 (1. 25U)、模板核酸 1 μ 1 (200ng)，加 水補(bǔ)足50 μ 1。反應(yīng)程序?yàn)?4"C 4min 預(yù)變性； 72°C 延伸 7min。
以瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物。采用小量凝膠回收試劑盒按說明書推薦方 法回收PCR產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)回收產(chǎn)物，估計(jì)回收產(chǎn)物間摩爾比，結(jié)果如圖6所
示ο3、SOE-PCR對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行多片段連接采用改進(jìn)的SOE-PCR方法進(jìn)行4個(gè)片段以及5個(gè)片段連接，加入等量初始模板，擴(kuò) 增模板兩側(cè)引物的摩爾濃度為中間重疊區(qū)域引物的摩爾濃度的100倍。具體反應(yīng)條件如下(1)片段 1、2、3 和 4 連接分別加入10 μ M 的引物 Eiav 1-1 和 Eiav 4-2 各 1 μ 1，加入 0. 1 μ M 的 Eiav 1-2 和 Eiav 2-1，Eiav 2-2 和 Eiav 3-1, Eiav 3-2 和 Eiav 4-1 各 1 μ 1 ；Ex Tag DNA 聚合酶 0. 30 μ l、Ex Tag Buffer 5 μ l、dNTP8 μ 1 (IOmM)，加入估計(jì)量等摩爾模板每約50ng，加水補(bǔ) 足總反應(yīng)體系為50 μ 1。反應(yīng)程序?yàn)?4"C 2min 預(yù)變性； 最后72°C延伸 lOmin。(2)片段2、3、4和5進(jìn)行連接分別加入10 μ M 的引物 Eiav 2-1 和 Eiav 5-2 各 1 μ 1，加入 0. 1 μ M 的 Eiav 2-2 和 Eiav3-1，Eiav 3-2 和 Eiav 4-1，Eiav 4-2 和 Eiav 5-1 各 1 μ 1 ;Ex Tag DNA 聚合酶 0. 30 μ l、Ex Tag Buffer 5 μ l、dNTP8 μ 1 (IOmM)，加入估計(jì)量等摩爾模板每約50ng，加水補(bǔ) 足總反應(yīng)體系為50 μ 1。反應(yīng)程序?yàn)?4"C 2min 預(yù)變性； 最后72°C延伸 lOmin。(3)片段 1、2、3、4 和 5 連接:分別加入10 μ M 的引物 Eiav 1-1 和 Eiav 5-2 各 1 μ 1，加入 0. 1 μ M 的 Eiav 1-2 和 Eiav 2-1，Eiav 2-2和Eiav 3-1，Eiav 3-2和Eiav 4-1，Eiav 4-2和Eiav 5-1各1 μ 1 ;Εχ Tag DNA 聚合酶 0. 30 μ 1、Ex Tag Buffer 5 μ 1、dNTP8 μ 1 (IOmM)，加入估計(jì)量等摩爾模板 每約50ng，加水補(bǔ)足總反應(yīng)體系為50 μ 1。反應(yīng)程序?yàn)?4°C 2min預(yù)變性，94°C變性30sec， 55°C退火30sec，72°C延伸7min30sec進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。同時(shí)為便于對(duì)比，我們還采用傳統(tǒng)的重疊延伸擴(kuò)增方法即不加入中間稀釋量的引物進(jìn)行了兩兩片段的連接以及進(jìn)行了三片段的連接，擴(kuò)增結(jié)果見圖7。從圖7可見，采用傳 統(tǒng)的SOE-PCR進(jìn)行4個(gè)片段和5個(gè)片段的分次連接，非特異性擴(kuò)增較多，目的產(chǎn)物的產(chǎn)量很 低，效果并不理想。而采用本發(fā)明方法進(jìn)行4個(gè)片段同時(shí)連接和5個(gè)片段同時(shí)連接，目的產(chǎn) 物的產(chǎn)量均比傳統(tǒng)SOE-PCR的得率高的多，且非特異性產(chǎn)物較少。例 3我們對(duì)不同條件稀釋內(nèi)引物條件下的擴(kuò)增進(jìn)行了摸索，對(duì)片段1、2、3和4進(jìn)行單
管擴(kuò)增連接。1、引物序列信息見表3表3基因擴(kuò)增所用到的引物 2、亞片段模板擴(kuò)增采用表3中的引物對(duì)分別擴(kuò)增出片段1、2、3和4作為亞片段模 板，擴(kuò)增信息見例2部分。3、不同稀釋引物下的片段1、2、3和4連接分別加入10 μ M的引物Eiav 1_1和Eiav 4_2各1 μ 1，每個(gè)泳道內(nèi)加入等量的引 物 Eiavl-2 和 Eiav 2-1、Eiav 2-2 和 Eiav 3-1、Eiav 3-2 和 Eiav 4-1，量為兩側(cè)長片段 引物的量的 1/40、1/80、1/120、1/160、1/200 ；反應(yīng)體系為=Ex Tag DNA 聚合酶 0. 30 μ 1、Ex Tag Buffer5 μ l、dNTP8 μ 1 (IOmM)，加入估計(jì)量等摩爾模板每約50ng，加水補(bǔ)足總反應(yīng)體系 為50μ1。反應(yīng)程序?yàn)?4"C 2min 預(yù)變性； 最后72°C延伸 lOmin。通過上述加入不同稀釋度中間引物的擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，比較產(chǎn)物得率的變化。從圖8可 見，以1、2、3、4片段為模板(預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物長度為6. 8kb)進(jìn)行的擴(kuò)增，在加入相同的模板、 外引物量以及反應(yīng)液情況下，分別加入40、80、120、160和200摩爾倍的稀釋梯度的中間引 物，結(jié)果表明稀釋梯度在40-120倍內(nèi)能夠有效的擴(kuò)增出目的條帶。說明加入一定稀釋度的 中間引物能夠促使更好的擴(kuò)增出目的條帶。
權(quán)利要求
一種可連接多片段的重疊延伸PCR方法，該方法由以下步驟組成(1)亞片段的合成針對(duì)不同的目的亞片段設(shè)計(jì)并合成具有互補(bǔ)末端的引物，以具有目的亞片段的DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下進(jìn)行平行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出具有重疊末端的亞片段；(2)亞片段的連接將所得亞片段等摩爾混合，加入步驟(1)中用于合成亞片段的所有引物，在DNA聚合酶的作用下進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)，通過亞片段重疊末端的延伸使各亞片段DNA連接成目的長片度；所述引物的用量比例為位于目的長片度兩末端的引物與位于目的長片段拼接區(qū)域的引物的摩爾比為40～120∶1；上述步驟中，所述亞片段的數(shù)量為2～5個(gè)；所述引物由位于目的長片度兩末端的引物與位于目的長片段拼接區(qū)域的引物組成，其中位于目的長片段拼接區(qū)域的引物兩兩互補(bǔ)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種可有效連接多個(gè)DNA片段的SOE-PCR方法，該方法通過采用完全互補(bǔ)的拼接區(qū)域引物和在重疊鏈延伸時(shí)引入非對(duì)稱量引物(即位于目的長片度兩末端的引物與位于目的長片段拼接區(qū)域的引物的摩爾比為40～120∶1)，實(shí)現(xiàn)了在同一個(gè)反應(yīng)里完成多個(gè)片段的連接，同時(shí)還具有不需優(yōu)化模板量和擴(kuò)增特異性高的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/10GK101899434SQ20101020519
公開日2010年12月1日 申請(qǐng)日期2010年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月18日
發(fā)明者萬成松, 張玲, 朱利, 熊建英, 趙衛(wèi), 鐘志成, 黎誠耀 申請(qǐng)人:南方醫(yī)科大學(xué)