一種猴頭菌乙醇提取物的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種猴頭菌乙醇提取物的制備方法，包括：(1)取猴頭菌子實體粉碎成顆粒，然后溶于水中沸騰攪拌1～3h，靜置冷卻至室溫后進行超聲提取，然后進行離心，靜置后取上清液，得猴頭菌水提取液；(2)將猴頭菌水提取液加入預處理過的大孔樹脂，室溫下吸附，然后使用乙醇進行洗脫，干燥后得到猴頭菌乙醇提取物。本發(fā)明具有良好的分離效果、穩(wěn)定性能和可循環(huán)重復利用的特點，適合于規(guī)?；a(chǎn)；而且大孔吸附樹脂吸附分離法具有有機溶劑用量少可回收、可重復性使用、再生簡單，降低成本等諸多優(yōu)點，可用于猴頭菌中有效成分的富集分離和大工業(yè)生產(chǎn)。
【專利說明】一種猴頭菌乙醇提取物的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于食用菌提取領(lǐng)域，特別涉及一種猴頭菌乙醇提取物的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]目前我國以猴頭菌為原料用于治療胃病藥品大約有100多種，幽門螺旋桿菌(116110013801:61-砂匕!^)是一種需氧型革蘭氏陰性菌，大量臨床研究表明能夠引起慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌、胃粘膜等胃病。
[0003]猴頭菌0161*1(3111111應(yīng)用于胃腸疾病治療具有鮮明的中國特色，在臨床上廣泛用來治療慢性胃炎、胃十二指腸潰瘍等疾病，積累了大量的臨床經(jīng)驗和數(shù)據(jù)。上世紀60年代，上海市農(nóng)科院食用菌所在我國首先馴化猴頭菇人工栽培成功。70年代從民間了解到猴頭菇有補胃功能，開始制作猴頭糖漿對十二指腸潰瘍患者作療效試驗，獲得良好的治療效果。
[0004]目前常用的提取猴頭菌的方法主要是常規(guī)的水提醇沉，但是這樣得到的猴頭菌提取物抑制幽門螺旋桿菌活性成分少，并不能投入實際應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種猴頭菌乙醇提取物的制備方法，該方法具有良好的分離效果、穩(wěn)定性能和可循環(huán)重復利用的特點，適合于規(guī)模化生產(chǎn)；而且大孔吸附樹脂吸附分離法具有有機溶劑用量少可回收、可重復性使用、再生簡單，降低成本等諸多優(yōu)點，可用于猴頭菌中有效成分的富集分離和大工業(yè)生產(chǎn)。
[0006]本發(fā)明的一種猴頭菌乙醇提取物的制備方法，包括:
[0007](1)取猴頭菌子實體粉碎成顆粒，然后溶于水中沸騰攪拌1?3匕靜置冷卻至室溫后進行超聲提取，然后進行離心，靜置后取上清液，得猴頭菌水提取液；其中猴頭菌顆粒與水的重量比為1:5?10 ；
[0008](2)將猴頭菌水提取液加入預處理過的大孔樹脂?。?？0-100 (河北滄州寶恩化工有限公司)，室溫下吸附，然后使用70%?100%乙醇進行洗脫，干燥后得到猴頭菌乙醇提取物。
[0009]所述步驟⑴中的離心速度為800011)111，離心時間為10111111。
[0010]所述步驟(2)中的大孔樹脂?。。?-100預處理步驟如下:在樹脂柱內(nèi)加入高于樹脂層10厘米的90%乙醇浸泡4小時，放出浸液，用蒸餾水洗滌至流出液在試管中加水稀釋不渾濁并且洗脫液用紫外光譜掃描不得檢出吸收峰為止，再用水洗滌至乙醇含量小于1%，即可。
[0011]所述步驟(2)中的吸附為靜態(tài)吸附，具體步驟如下:猴頭菌水提取液濃度為1001118加1，溶液與大孔樹脂的體積比為10:1，搖床1101^111，吸附1211。
[0012]所述步驟(2)中的洗脫為靜態(tài)洗脫或動態(tài)洗脫。
[0013]所述靜態(tài)洗脫具體為:將已吸附的大孔樹脂?。?？0-100，經(jīng)3倍柱床體積的蒸餾水洗脫后，用95%乙醇溶液4倍柱床體積置恒溫搖床110rpm、25°C、2h的條件下進行洗脫，顏色由深至淺，洗至無色；動態(tài)洗脫具體為:采用濕法或干法裝柱的方式裝柱，層析柱規(guī)格為徑高比1:8，猴頭菌水提取液上樣濃度為0.lkg/L，樹脂上樣量為Ikg/1L，流速為1.5mL/min,用95%乙醇溶液進行洗脫。
[0014]所述步驟(2)中的干燥為冷凍干燥，最終得到顏色為黑褐色的猴頭菌提取物產(chǎn)品O
_5] 有益.效果
[0016](I)本發(fā)明具有良好的分離效果、穩(wěn)定性能和可循環(huán)重復利用的特點，適合于規(guī)模化生產(chǎn)；而且大孔吸附樹脂吸附分離法具有有機溶劑用量少可回收、可重復性使用、再生簡單，降低成本等諸多優(yōu)點，可用于猴頭菌中有效成分的富集分離和大工業(yè)生產(chǎn)；
[0017](2)本發(fā)明與未使用大孔樹脂吸附前相比，該猴頭菌醇提物抑菌活性提高了 20倍，優(yōu)于未處理的猴頭菌醇提物。

【具體實施方式】
[0018]下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0019]實施例1
[0020]水提法制備猴頭菌粗活性物質(zhì):
[0021]稱取粉碎機粉碎成顆粒的猴頭菌子實體干粉0.2kg，溶于水中沸騰攪拌I?3h，之后靜置冷卻至室溫后用超聲波進行超聲2h提取,然后進行離心8000rpm, 1min,靜置后取上清液，得猴頭菌水提取物；其中猴頭菌顆粒與水的重量比為1:5?10。
[0022]實施例2
[0023]大孔樹脂性能的篩選
[0024](I)大孔樹脂的預處理
[0025]取HPD-100，HPD-400，D101, AB-8 (購自河北滄州寶恩化工有限公司)，在樹脂柱內(nèi)加入高于樹脂層10厘米的90%乙醇浸泡4小時，放出浸液，用蒸餾水洗滌至流出液在試管中加水稀釋不渾濁并且洗脫液用紫外光譜掃描不得檢出吸收峰為止，再用水洗滌至乙醇含量小于1%，即可使用。
[0026](2)樹脂的吸附
[0027]量取已預處理的HPD-100、HPD-400、D101、AB-8大孔樹脂各3份，每份1mL,分別置于250mL的三角瓶中，加入實施例1的樣液10mL,即樣液:樹脂=10:1。置在搖床llOrpm，25°C，12h，使充分吸附。
[0028](3)樹脂的洗脫
[0029]已吸附飽和的樹脂，用3倍柱體積(BV)蒸餾水進行沖洗，以洗去雜質(zhì)及不吸附成分，然后加入50mL的95%乙醇置恒溫搖床IlOrpm, 25 °C, 2h的條件下進行洗脫，收集洗脫液，濃縮，回收乙醇，得濃縮膏，稀釋一定的倍數(shù)。
[0030]實施例3[0031〕 抑制幽門螺桿菌的最低抑菌濃度測定
[0032](1)供試樣品的配制
[0033]精確稱取實施例1制備的猴頭菌水提物和實施例2制備得到的乙醇提取物樣品于滅過菌的6卯611(101^管中，用75%乙醇配制成一定濃度的溶液。在超聲下超聲15111111?？瞻讓φ諡?5%乙醇，陽性對照組甲硝唑配置成2！11^111匕
[0034](2)幽門螺旋桿菌菌懸液的制備
[0035]挑取適量培養(yǎng)7211的菌落于11111布氏肉湯培養(yǎng)基中，超聲約108，制成相當于
2.81:811(181-(1 (含菌 1 X 107 至 IX 1080? 11./1)菌懸液，該菌懸液現(xiàn)用現(xiàn)配。
[0036](3)羊血布式培養(yǎng)基的制備
[0037]稱量81*11(361121培養(yǎng)基28.8并添加1000111[蒸餾水中，調(diào)節(jié)邱值為7.0±0丨2，分裝為每瓶1001111,另加瓊脂2呂在121滅囷15111111,臨用如加7%無囷羊血。
[0038](4)最低抑菌濃度測定(祖0
[0039]取409 [的75%乙醇加到96孔板八1412中作為陰性對照，于812412加甲硝唑作為陽性對照。取等體積的供試樣品加到81-811中，以移液槍按列對各樣液進行2倍連續(xù)稀釋，蓋上板蓋，紫外下?lián)]干后，用移液槍吸100 ^ I羊血布氏培養(yǎng)基于96孔平板中，于41冰箱放置2處后紫外線照射約1501?。?。接下來用無菌棉棒蘸取幽門螺旋桿菌菌懸液，依次接種于各孔中的培養(yǎng)基表面，放入培養(yǎng)箱中汍:5%；002:15%；^2:80% ), 371恒溫培養(yǎng)72匕。以體視顯微鏡下觀察各孔培養(yǎng)基表面，無細菌生長的為最低藥物稀釋濃度即IX。
[0040](5)實驗結(jié)果
[0041〕 實施例1制備的猴頭菌水提物對幽門螺旋桿菌的110101^/111匕實施例2得到的猴頭菌乙醇提取物對幽門螺旋桿菌的IX分別為0.5-1呢/此(^0-100)、1-2^/1111 (^0-400) ,0.75-1.5^/1111 (0101)和 0.6-1.2呢/11^8-8)，結(jié)果表明使用大孔樹脂^0-100吸附洗脫后得到的猴頭菌乙醇提取物對11.^101-1 ^100的最低抑制濃度小于使用大孔樹脂！！？0-400、八8-8和0101得到的乙醇提取物的最低抑菌濃度，并且與吸附前水提取相比，抑菌活性分別提高了 10倍以上，吸附活性效果較好。
[0042]實施例4
[0043]不同體積分數(shù)乙醇的洗脫效果
[0044](1)靜態(tài)洗脫
[0045]取已吸附的樹脂?。?？0-100、八8-8，經(jīng)3倍柱床體積的蒸餾水洗脫后，依次用10%、30%、50%、70%、90%和100%乙醇溶液各4倍柱床體積置恒溫搖床1101~卿，251，2卜的條件下進行梯度洗脫，顏色由深至淺，分別洗至無色，收集洗脫液，濃縮至膏。濃縮膏稀釋一定的倍數(shù)，測對只.￠7101-1的抑菌活性。
[0046](2)動態(tài)洗脫
[0047]孔樹脂裝柱子(徑高比1:8),經(jīng)3倍柱床體積的蒸餾水洗脫后，依次用10%、30%、50%、70%、90%和100%乙醇溶液各4倍柱床體積進行梯度洗脫，猴頭菌水提取液上樣濃度為0.14/1，樹脂上樣量為14/1匕流速為1.54/111111分別洗至無色，分段收集洗脫液，并濃縮成膏。用濃縮膏稀釋一定的倍數(shù)測定對0.1)7101*1的抑菌活性。
[0048](3)實驗結(jié)果
[0049]結(jié)果表明，兩種洗脫條件對抑菌活性的效果相同，使用蒸餾水洗脫時IX均大于1mg/mL，而使用1 %、30 %、50 %乙醇洗脫時靜態(tài)洗脫和動態(tài)洗脫液的MIC在5-1Omg/mL之間；使用HPD-100和10% -50%乙醇洗脫得到的洗脫液抑菌活性較差MIC均大于2.5mg/mL，而70%、90%和100%洗脫后得到的洗脫液的MIC分別為0.25-0.5mg/mL, 125_250mg/mL，0.25mg/mL，其中90%乙醇洗脫后的提取物抑制H.pylori ATCC的最低抑菌濃度最小為125-250mg/mL。結(jié)果顯示抑制幽門螺旋桿菌的活性成分主要集中在70%，90%，100%乙醇洗脫液中，在70%，90 %，100 %三種體積分數(shù)的乙醇解吸液中，90 %乙醇對H.pylori抑菌活性最好，并且90%乙醇、100%乙醇洗脫后得到的洗脫液抑菌效果差別不大。
[0050] 實施例5
[0051 ] 體外抑制幽門螺旋桿菌驗證實驗
[0052]將實施例1制備得到的猴頭菌粗提物浸膏配制成100mg/ml的水提取物溶液，然后進行如下方法提取。
[0053](I)HPD-1OO樹脂提取:加入5L已預處理的大孔樹脂HPD-100到溶解液中吸附24h，期間需不時攪拌，去上清，得到吸附后的大孔樹脂，把吸附后的大孔樹脂裝柱子(徑高比1:8)，依次用蒸餾水、50%乙醇溶液各4倍柱床體積進行梯度解吸，流速為1.5mL/min分別洗至無色，再用95%乙醇洗脫并濃縮成膏。
[0054](2)實驗結(jié)果
[0055]使用HPD-100大孔樹脂和95%乙醇提取得到的猴頭菌乙醇提取物對五種幽門螺旋桿菌的最低抑制濃度分別為 0.5-lmg/mL(Helicobacter pylori ATCC)、0.125-0.25mg/mL (Helicobacter pylori SSI)、0.5-lmg/mL(Helicobacter pylori ff2504)>lmg/mL(Helicobacter pylori DXF)和 0.5mg/mL(Helicobacter pylori 78);而水提取物對五種幽門螺旋桿菌的最低抑菌濃度分別為2.5-5mg/mL (Helicobacter pylori ATCC)、5mg/mL(Helicobacter pylori SSI)、5mg/mL(Helicobacter pylori ff2504)>2.5-5mg/mL (Helicobacter pylori DXF)和 5mg/mL (He I icobacter pylori 78)。綜合分析，使用HPD-100和95%乙醇洗脫得到的猴頭菌乙醇提取物的活性提高了 20倍。
[0056](3)討論
[0057]本實施例采取活性跟蹤的方法對分離猴頭固體發(fā)酵菌絲對H.pylori的抑菌組分進行富集，在選取的四種大孔樹脂中，HPD-100大孔樹脂對猴頭固體菌絲的活性吸附能力最好，并確定了活性物質(zhì)主要集中在50-95%乙醇洗脫液中最小抑菌活性為0.5-lmg/mL，活性比水提物提高了 20倍。這對以后研究HPD-100大孔樹脂對猴頭固體菌絲吸附有效活性物質(zhì)的工藝研究中起到了基礎(chǔ)性研究，而且大孔吸附樹脂吸附分離法具有有機溶劑用量少可回收、可重復性使用、再生簡單，降低成本等諸多優(yōu)點，是一種高效低耗的分離純化工藝，可用于猴頭菌中有效成分的富集分離和大工業(yè)生產(chǎn)。
【權(quán)利要求】
1.一種猴頭菌乙醇提取物的制備方法，包括: (1)取猴頭菌子實體粉碎成顆粒，然后溶于水中沸騰攪拌I?3h，靜置冷卻至室溫后進行超聲提取，然后進行離心，靜置后取上清液，得猴頭菌水提取液；其中猴頭菌顆粒與水的重量比為1:5?10 ; (2)將猴頭菌水提取液加入預處理過的大孔樹脂HPD-100，室溫下吸附，然后使用70%?100%乙醇進行洗脫，干燥后得到猴頭菌乙醇提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種猴頭菌乙醇提取物的制備方法，其特征在于:所述步驟(1)中的離心速度為8000rpm,離心時間為lOmin。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種猴頭菌乙醇提取物的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中的大孔樹脂HPD-100預處理步驟如下:在樹脂柱內(nèi)加入高于樹脂層10厘米的90%乙醇浸泡4小時，放出浸液，用蒸餾水洗滌至流出液在試管中加水稀釋不渾濁并且洗脫液用紫外光譜掃描不得檢出吸收峰為止，再用水洗滌至乙醇含量小于1%，即可。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種猴頭菌乙醇提取物的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中的吸附為靜態(tài)吸附，具體步驟如下:猴頭菌水提取液濃度為100mg/ml，溶液與大孔樹脂的體積比為10:1，搖床llOrpm，吸附12h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種猴頭菌乙醇提取物的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中的洗脫為靜態(tài)洗脫或動態(tài)洗脫。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種猴頭菌乙醇提取物的制備方法，其特征在于:所述靜態(tài)洗脫具體為:將已吸附的大孔樹脂HPD-100，經(jīng)3倍柱床體積的蒸餾水洗脫后，用95%乙醇溶液4倍柱床體積置恒溫搖床110rpm、25°C、2h的條件下進行洗脫，顏色由深至淺，洗至無色；動態(tài)洗脫具體為:采用濕法或干法裝柱的方式裝柱，層析柱規(guī)格為徑高比1:8，猴頭菌水提取液上樣濃度為0.lkg/L，樹脂上樣量為Ikg/1L，流速為1.5mL/min，用95%乙醇溶液進行洗脫。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種猴頭菌乙醇提取物的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中的干燥為冷凍干燥。
【文檔編號】A61P1/04GK104398539SQ201410503816
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年9月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月26日
【發(fā)明者】李亮, 尚曉冬, 譚琦 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學院