專利名稱：一種以石榴皮為原料固態(tài)發(fā)酵制備鞣花酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以石榴皮為原料固態(tài)發(fā)酵制備鞣花酸的方法，屬藥品、保健品技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
鞣花酸(ellagic acid)，分子式C14H6O8，是一種廣泛存在于各種堅果、軟果中的天然多酚類化合物。它是沒食子酸的二聚衍生物，是一種多酚二內(nèi)酯。它不僅能以游離的形式存在，而且更多的是以縮合形式(如鞣花單寧、苷等)存在。純鞣花酸是一種黃色針狀晶體，微溶于水、醇，溶于堿、吡啶，不溶于醚。鞣花酸具有較強(qiáng)的抗脂質(zhì)過氧化、捕捉自由基的能力，可以抑制多環(huán)芳香烴、黃曲霉毒素和芳香胺等引發(fā)變的癌變。其主要功能為(1)抗癌/抗突變性能抑制致癌劑的代謝活動，解除致癌物的毒性，致癌物清除劑，占據(jù)DNA上可能和致癌物質(zhì)或其代謝物反應(yīng)的位置；(2)對人體免疫缺陷病毒具有抑制作用；(3)抗氧化作用；(4)其它作用具有胃腸動力學(xué)和泌尿生殖動力學(xué)作用，具有凝血功能，具有降壓、鎮(zhèn)靜作用。鞣花酸可以通過化學(xué)合成法和天然產(chǎn)物降解法得到，其制備方法主要有以下幾種
一種是從植物中提取鞣花酸。在樹莓、草莓、石榴以及蕨類等植物中含有少量游離的鞣花酸(1% )，用此工藝可生產(chǎn)高純度的鞣花酸。但由于原料成本較高、且鞣花酸含量低而實際意義不大。一種是通過倍酸(或其酯)的氧化聚合。沒食子酸(酯)在酶的作用下氧化聚合制取鞣花酸。此工藝過程中，鞣花酸的產(chǎn)率為20% 30%。但沒食子酸(酯)的制備過程繁瑣復(fù)雜，酶也需要精制純化，而且產(chǎn)物中還有一種未知的醌類物質(zhì)，其與鞣花酸的比例為 1 2. 4，給產(chǎn)品的分離純化帶來了一定的困難，目前較少用此法進(jìn)行鞣花酸的生產(chǎn)。目前公開了兩種以石榴皮為原料的鞣花酸制備方法。一種是酸水解法制備鞣花酸的工藝(專利號200510002081.x)，此法具有較高的產(chǎn)率和純度，但對設(shè)備抗腐蝕能力要求很高；另一種是酶催化法(專利號200810056007. X)，其主要過程分為兩步液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶階段和酶促轉(zhuǎn)化階段，此法過程繁瑣，且酶促轉(zhuǎn)化條件要求嚴(yán)格，不易控制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種以石榴皮為底物固態(tài)發(fā)酵制備鞣花酸的方法。通過直接以石榴皮粉末為發(fā)酵底物，黑曲霉固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)鞣花酸，經(jīng)純化得到高純度鞣花酸。此方法操作簡單，得到的鞣花酸產(chǎn)品具有很高的純度和產(chǎn)率。本發(fā)明以黑曲霉(購買自工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)，菌種編號3. 316)
3為發(fā)酵菌種，以石榴皮為發(fā)酵底物，進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵。發(fā)酵過程中，黑曲霉合成單寧酶并將其分泌到胞外，酶催化石榴皮中的鞣花單寧降解生成鞣花酸，發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)純化和脫水后獲得高純度鞣花酸，包括以下步驟(1)石榴皮的固態(tài)發(fā)酵將石榴皮粉末置于發(fā)酵罐中，石榴皮用占總重量47% 60%的初始潤濕水溶液潤濕，所用潤濕液中加有0. 1 % NaCUO. 1 % MgSO4和0. 5% NH4NO3，其中NH4NO3作為N源，pH 5 7，115°C滅菌30min，冷卻后接入黑曲霉(Aspergillusniger 3.316)孢子懸液，石榴皮和黑曲霉的用量比例為5g石榴皮添加ImL濃度為1 X 101°個/mL的黑曲霉孢子懸液?；靹虿㈧o置培養(yǎng)，30°C發(fā)酵5 7天，得到含有鞣花酸的發(fā)酵產(chǎn)物。(2)鞣花酸的純化發(fā)酵產(chǎn)物烘干粉碎后，加入10 30倍質(zhì)量的純甲醇，70°C萃取，萃取液懸蒸至干， 得到的固體用去離子水洗滌，離心分離，干燥后得到鞣花酸產(chǎn)品。(3)脫水將鞣花酸產(chǎn)品加入無水乙醇，于70 80°C下加熱回流1 3h，過濾，固體干燥，得淡黃色鞣花酸產(chǎn)品。為了提高產(chǎn)率，在步驟O)中，甲醇萃取和水洗過程均分兩次完成，每次1 3小時。本發(fā)明的實質(zhì)是以石榴皮為固態(tài)發(fā)酵底物，黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)單寧酶，其特異性高，專一性的降解鞣花單寧中的酯鍵，使石榴皮中鞣花單寧降解生成鞣花酸，經(jīng)分離純化后獲得高純度的鞣花酸，純度在95%以上。本發(fā)明的優(yōu)點是工藝簡單，制備過程綠色化，三廢排放少，適合大規(guī)模的生產(chǎn)，產(chǎn)品品質(zhì)好，鞣花酸產(chǎn)品收率高和純度高。我國是石榴種植大國，其果皮除被部分用于中藥材以外，大部分都被人們拋棄，造成了很大的浪費。本發(fā)明以石榴皮為原料，原材料成本低，提高農(nóng)產(chǎn)品的附加值。本發(fā)明采用固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)鞣花酸，由于發(fā)酵條件溫和，無需高溫，高壓等操作，改善了生產(chǎn)環(huán)境，大大節(jié)約化學(xué)物質(zhì)的消耗量，且三廢污染小，容易治理。
具體實施例方式實施例1 (1)石榴皮的固態(tài)發(fā)酵將石榴皮粉末置于發(fā)酵罐中，石榴皮用47%初始潤濕水溶液潤濕，所用潤濕液中加有 0. 1% NaCUO. 1% MgSO4 和 0. 5% NH4NO3 作為 N 源，pH 5，115°C滅菌 30min，冷卻后接入黑曲霉(Aspergillus niger 3. 316)孢子懸液，石榴皮和黑曲霉的用量比例為5g石榴皮添加ImL濃度為1 XlOltl個/mL的黑曲霉孢子懸液。混勻并靜置培養(yǎng)，30°C發(fā)酵5天，得到含有鞣花酸的發(fā)酵產(chǎn)物。(2)鞣花酸的純化發(fā)酵產(chǎn)物烘干粉碎后，加入10倍質(zhì)量的純甲醇，70°C萃取兩次，每次1小時。萃取液懸蒸至干，回收甲醇，得到的固體用去離子水洗滌兩次，每次1小時，離心分離，干燥后得到鞣花酸產(chǎn)品。(3)脫水
將鞣花酸產(chǎn)品加入純乙醇，于70°C下加熱回流1小時，過濾，固體干燥，得淡黃色鞣花酸產(chǎn)品，純度96. 6 %，收率75.7%。實施例2 (1)石榴皮的固態(tài)發(fā)酵將石榴皮粉末置于發(fā)酵罐中，石榴皮用占總重量60%的初始潤濕水溶液潤濕，所用潤濕液中加有 0. 1% NaCUO. 1 % MgSO4 和 0. 5% NH4NO3 作為 N 源，pH7，115°C滅菌 30min, 冷卻后接入黑曲霉(Aspergillus niger 3. 316)孢子懸液，石榴皮和黑曲霉的用量比例為 5g石榴皮添加ImL濃度為1 XlOltl個/mL的黑曲霉孢子懸液?；靹虿㈧o置培養(yǎng)，30°C發(fā)酵7 天，得到含有鞣花酸的發(fā)酵產(chǎn)物。(2)鞣花酸的純化發(fā)酵產(chǎn)物烘干粉碎后，加入30倍質(zhì)量的純甲醇，70°C萃取兩次，每次3小時，萃取液懸蒸至干，回收甲醇，得到的固體用去離子水洗滌兩次，每次3小時，離心分離，干燥后得到鞣花酸產(chǎn)品。(3)脫水將鞣花酸產(chǎn)品加入純乙醇，于80°C下加熱回流2小時，過濾，干燥，得淡黃色鞣花酸產(chǎn)品，純度97.5%，收率78. 3 %。實施例3 (1)石榴皮的固態(tài)發(fā)酵將石榴皮粉末置于發(fā)酵罐中，石榴皮用占總重量53%的初始潤濕水溶液潤濕，所用潤濕液中加有 0. 1% NaCUO. 1 % MgSO4 和 0. 5% NH4NO3 作為 N 源，pH6，115°C滅菌 30min, 冷卻后接入黑曲霉(Aspergillus niger 3. 316)孢子懸液，石榴皮和黑曲霉的用量比例為 5g石榴皮添加ImL濃度為1 XlOltl個/mL的黑曲霉孢子懸液。混勻并靜置培養(yǎng)，30°C發(fā)酵6 天，得到含有鞣花酸的發(fā)酵產(chǎn)物。(2)鞣花酸的純化發(fā)酵產(chǎn)物烘干粉碎后，加入20倍質(zhì)量的純甲醇，70°C萃取兩次，每次2小時。萃取液懸蒸至干，回收甲醇，得到的固體用去離子水洗滌兩次，每次2小時，離心分離，干燥后得到鞣花酸產(chǎn)品。(3)脫水將鞣花酸產(chǎn)品加入純乙醇，于75°C下加熱回流2小時，過濾，干燥，得淡黃色鞣花酸產(chǎn)品，純度98. 3 %，收率80. 3 %。
權(quán)利要求
1.一種以石榴皮為原料固態(tài)發(fā)酵制備鞣花酸的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)石榴皮的固態(tài)發(fā)酵將石榴皮粉末置于發(fā)酵罐中，石榴皮用占總重量47% 60%的初始潤濕水溶液潤濕， 所用潤濕液中加有0. 1 % NaCUO. 1 % MgSO4和0. 5% NH4NO3，其中NH4NO3作為N源，pH 5 7，115°C滅菌30min，冷卻后接入黑曲霉(Aspergillusniger 3.316)孢子懸液，石榴皮和黑曲霉的用量比例為5g石榴皮添加ImL濃度為1 XlOltl個/mL的黑曲霉孢子懸液，混勻并靜置培養(yǎng)，30°C發(fā)酵5 7天，得到含有鞣花酸的發(fā)酵產(chǎn)物；(2)鞣花酸的純化發(fā)酵產(chǎn)物烘干粉碎后，加入10 30倍質(zhì)量的純甲醇，70°C萃取，萃取液懸蒸至干，得到的固體用去離子水洗滌，離心分離，干燥后得到鞣花酸產(chǎn)品；(3)脫水將鞣花酸產(chǎn)品加入無水乙醇，于70 80°C下加熱回流1 3h，過濾，固體干燥，得淡黃色鞣花酸產(chǎn)品。
2.權(quán)利要求1的一種以石榴皮為原料固態(tài)發(fā)酵制備鞣花酸的方法，其特征在于，甲醇萃取和水洗過程均兩次完成，每次1 3小時。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種以石榴皮為原料固態(tài)發(fā)酵制備鞣花酸的方法，屬藥品、保健品領(lǐng)域。該方法采用以石榴皮為主要成分的培養(yǎng)基，選用黑曲霉(Aspergillusniger 3.316)作為發(fā)酵菌種，進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵。石榴皮固態(tài)發(fā)酵條件為pH 5～7，47％～60％初始水潤濕，潤濕液中加入0.5％的NH4NO3作為N源，30℃發(fā)酵5～7天。發(fā)酵后產(chǎn)物經(jīng)過純化和脫水步驟，可獲得高品質(zhì)的鞣花酸產(chǎn)品。以石榴皮作為原料價格低廉，既保證了鞣花酸產(chǎn)品的高收率和高純度，又具有突出的成本優(yōu)勢，適合大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號C12P17/18GK102250981SQ201010178430
公開日2011年11月23日 申請日期2010年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月21日
發(fā)明者劉春國, 廖亮, 梁浩, 袁其朋, 黃燕 申請人:北京化工大學(xué)