專利名稱：利用昆蟲系統(tǒng)表達白藜蘆醇芪合酶和制備白藜蘆醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，尤其涉及一種從昆蟲表達系統(tǒng)表達的白藜蘆醇芪合酶制備白藜蘆醇的方法，即利用昆蟲系統(tǒng)表達的白藜蘆醇合成的關(guān)鍵酶(芪合酶)，以西瓜皮或哈密瓜皮或葡萄皮等的提取液為底物在體外合成白藜蘆醇的方法。
背景技術(shù)：
白藜蘆醇藥用價值的研究越來越受到國內(nèi)外學者的青睞，Jang等在Science雜志上對白藜蘆醇在癌癥的始發(fā)、促進及發(fā)展階段表現(xiàn)出的抑制作用進行了系列報道，從而使白藜蘆醇成為癌癥化學預(yù)防和化學治療領(lǐng)域的一個研究熱點。體外試驗證實白藜蘆醇可以抑制血小板功能和內(nèi)皮細胞TF的表達，從而減少血栓形成。體外試驗還證實白藜蘆醇由于抑制了類花生酸的合成和血小板鈣通道，從而抑制了由血栓素、ADP和膠原誘導的血小板聚集。在誘發(fā)心血管疾患的內(nèi)皮源性介質(zhì)中，21個氨基酸的內(nèi)皮素21(ET21)是一個重要的先行分子。白藜蘆醇已被發(fā)現(xiàn)可作為ET21的拮抗劑，可以拮抗ET21對大鼠的殺傷效應(yīng)，并能夠抑制由ET21所致的血壓升高。在高膽固醇血癥的兔子模型中，白藜蘆醇可減少血漿ET21水平，并顯著升高NO水平。這些研究結(jié)果顯示白藜蘆醇可改善內(nèi)皮細胞功能，也是白藜蘆醇發(fā)揮非酒精依賴性的心血管保護效應(yīng)的機制之一。Orgogozo等調(diào)查后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)常飲用紅葡萄酒的老年人罹患老年癡呆病的幾率顯著下降，推測紅酒具有神經(jīng)保護作用。之后，大量實驗證實白藜蘆醇是紅葡萄酒中發(fā)揮神經(jīng)保護作用的主要物質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可以標識激酶和神經(jīng)細胞，通過葡萄酒攝入白藜蘆醇，對于老年人的退化病，如帕金森癥、癡呆癥、風濕性疾病都有較好的預(yù)防和治療作用。多羥基芪類物質(zhì)大都具有抗氧化、抗自由基作用。研究證明，白藜蘆醇具有抗氧化、抗自由基及影響花生四烯酸代謝的藥理作用。這也是其具有多重生物學效應(yīng)的重要機制之一。有研究表明，白藜蘆醇能顯著抑制肝微粒體、腦線粒體及突觸體氧化損傷過程中 DNA的生成，對病毒性肝炎、帕金森病、阿爾茨海默病等疾病有很好的防治作用。白藜蘆醇及白藜蘆醇苷對脂質(zhì)過氧化有很強的抑制作用，能降低血清和肝臟的脂質(zhì)，減少脂質(zhì)過氧化物在體內(nèi)的堆積，保護肝臟不受損害。另外，白藜蘆醇還能通過選擇性下調(diào)細胞周期蛋白cyclinDl的表達，使星狀細胞靜止在Gl期，從而有利于抑制肝纖維化的形成。綜上所述，白藜蘆醇具有多方面有益于人類健康的生物藥理活性，使其廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健品、化妝品和食品添加劑等領(lǐng)域。其在腫瘤、心腦血管疾病、癡呆、病毒性肝炎、 炎癥疾病等方面的治療及預(yù)防作用也越來越被人們認識，其臨床應(yīng)用前景廣闊，有望成為一種可防治多種疾病的新型藥物。然而，白藜蘆醇市場售價極為昂貴，而且不宜為大多數(shù)人所利用。白藜蘆醇的獲得可以通過化學合成法得到，然而現(xiàn)有的化學合成方法，如Wittig 法和Wittig-Horner法、Perkin反應(yīng)法、Heck反應(yīng)法等都存在著產(chǎn)物的順反異構(gòu)選擇性不高，收率低，生成的副產(chǎn)難以除去，合成路線步驟繁多等缺陷；在生物合成中一般原核表達載體產(chǎn)生的目的蛋白生物活性極低或無生物活性，植物表達系統(tǒng)一般產(chǎn)量低，周期長，難以大規(guī)模投入生產(chǎn)，更難以滿足市場需要；而酵母和動物表達系統(tǒng)生產(chǎn)藥物成本極高，產(chǎn)量極低，也存在相同的問題。Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)是近年來一種發(fā)展迅速的高效、便捷的新型真核表達系統(tǒng)。通過位點特異的轉(zhuǎn)座可方便地將外源基因插入到桿狀病毒穿梭載體上，然后提取含有外源基因的重組Bacmid，將其轉(zhuǎn)染入昆蟲細胞即可獲得含有外源基因的重組病毒用于表達目的蛋白。Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)已在各領(lǐng)域得到廣泛運用，受到廣泛關(guān)注。Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)經(jīng)過多年的發(fā)展，已分化出面向苜蓿銀紋夜蛾桿狀態(tài)病毒(Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus, AcMNPV) > 家香桿狀病毒(Bombyxmori nuclear polyhedrosis virus, BmNPV)禾口棉鈴蟲桿狀病毒 (Helicoverpa armigera nuclearpolyhedrosis virus, HaNPV)的3個子系統(tǒng)。AcMNPV 的Bac-to-Bac系統(tǒng)發(fā)展最早，研究也最深入，對其他兩個系統(tǒng)的發(fā)展影響很大。近年來， Invitrogen公司應(yīng)用Bac-to-Bac策略已開發(fā)出面向AcMNPV的表達系統(tǒng)。該系統(tǒng)中，Bacmid 包含有mini2F復(fù)制子、卡那霉素抗性篩選標記和細菌轉(zhuǎn)座子Tn7的靶位點(mini-attTn7) 以及編碼β-半乳糖苷酶α肽的部分DNA片段。Bacmid既能像質(zhì)粒一樣在E. coli中復(fù)制，又能像病毒一樣感染昆蟲細胞，供體質(zhì)粒PFastBac含有慶大霉素抗性基因(Gen+)及Tn7的左右兩臂序列，兩臂序列之間是多角體蛋白的啟動子，下游依次是多克隆位點、SV40的PolyA位點。將含有外源基因的供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DHlOBac感受態(tài)細胞(該細胞含有桿狀病毒穿梭載體、Kanr和復(fù)制子以及LacZ肽段編碼基因)，供體質(zhì)粒中的外源基因在輔助質(zhì)粒編碼的轉(zhuǎn)座酶作用下，通過轉(zhuǎn)座插入到桿狀病毒基因組中，破壞了 LacZ的表達。通過含有卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素和X-gal的培養(yǎng)板篩選，重組的Bacmid (即重組病毒基因組)轉(zhuǎn)化體菌落呈白色，而非重組Bacmid轉(zhuǎn)化菌落為藍色。從白色菌落培養(yǎng)物提取Bacmid DNA，用脂質(zhì)介導法轉(zhuǎn)染昆蟲細胞即可獲得重組病毒。Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)具有多方面的優(yōu)勢，其所產(chǎn)生的重組蛋白具有折疊和糖基化，其生物學活性、抗原性和免疫原性都與天然蛋白極為相似；具有較高的重組蛋白表達水平；可容納較大外源DNA插入；可同時表達多個外源基因；能夠可溶性地表達一些原核系統(tǒng)難以表達的大分子量蛋白；較易培養(yǎng)和生長，安全等。這些為進一步研究生物學活性奠定了良好的基礎(chǔ)。目前，在開發(fā)桿狀病毒作為表達載體時，應(yīng)用最多的是將多角體蛋白基因刪除，由外源目的基因替代，利用多角體強啟動子帶動外源基因的表達。由此產(chǎn)生的重組病毒不能形成多角體，重組病毒必需通過經(jīng)皮注射的方式接種家蠶，才能實現(xiàn)病毒的有效感染和外源目的基因的表達。家蠶皮下注射接種不僅技術(shù)要求高，需預(yù)防細菌感染，而且接種工作強度大，效率低下，即使操作熟練的人員也很難在短時間內(nèi)完成大規(guī)模的接種，往往會錯過病毒接種的最佳時機。Bac-to-Bac系統(tǒng)與傳統(tǒng)的桿狀病毒表達載體系統(tǒng)(baculovirus expression vector system, BEVS)相比，至少有以下三個優(yōu)勢 大大縮短了重組病毒構(gòu)建所需的時間。Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)只需要不到2周的時間來構(gòu)建和純化重組桿狀病毒，而利用傳統(tǒng)方法即便是技術(shù)熟練的人員也需要 4-6周甚至更長的時間才能獲得重組桿狀病毒。 不需要傳統(tǒng)繁瑣的空斑分析來純化重組病毒，轉(zhuǎn)座率高，純化率達100%。原因在于重組病毒DNA在細菌內(nèi)產(chǎn)生，可根據(jù)菌斑顏色篩選(藍白斑篩選)，不存在野生型和非重組型病毒交叉污染的問題。 能夠快速并同時分離多個重組桿狀病毒，而且適合于蛋白變異體表達的結(jié)構(gòu)或功能研究。在昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)中，以家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)更具優(yōu)越性。利用家蠶表達外源重組蛋白不僅具有廉價、方便、高效的優(yōu)點，而且翻譯后加工也與天然蛋白相似。鄧小昭等選擇微載體Cytodex 3對家蠶BmN細胞進行高密度培養(yǎng)，其綠色熒光蛋白表達量是用方瓶靜止培養(yǎng)的3倍，經(jīng)ELISA法檢測發(fā)現(xiàn)細胞培養(yǎng)液中HBeAg滴度達到1 32000; 李慧等利用Bac-to-Bac在昆蟲細胞表達系統(tǒng)中表達出人FGF29重組蛋白；段宇等利用桿狀病毒載體在家蠶幼蟲中表達有生物學活性的可溶性分泌型重組人胰島素樣生長因子21(rhIGF21)。其它還有如重組人酸性和堿性成纖維細胞生長因子(aFGF，bFGF)、人內(nèi)皮血管生長因子、人生長激素等都成功地在家蠶中得到表達，并都具有很高的生物活性。 Motohashi等成功構(gòu)建了 BmNPV穿梭載體和大腸桿菌DHlOBac轉(zhuǎn)化株，從而首次使BmNPV 穿梭載體系統(tǒng)成為可行。繆云根等運用此原理，成功地構(gòu)建了含蜘蛛絲基因的重組桿狀病毒rBacmid/BmNPV/Flag，蜘蛛絲蛋白在家蠶BmN細胞和家蠶幼蟲中均得到表達。岳萬福等應(yīng)用這種新型的Bac-to-Bac/BmNPV桿狀病毒表達系統(tǒng)使得Mn-SOD在家蠶幼蟲內(nèi)高效表達，為生產(chǎn)上制取超氧化物歧化酶(SOD)提供了良好的基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有的化學合成以及上述提到的生物合成中所遇到的難題，本發(fā)明的一個目的是應(yīng)用昆蟲表達載體來進行白藜蘆醇芪合酶的生產(chǎn)，利用瓜果皮的提取液，在體外進行酶學反應(yīng)，進而制備自藜蘆醇粗制品。既能獲得高活性的目的產(chǎn)物，又能降低成本，可規(guī)?；a(chǎn)，以適應(yīng)市場需求。本發(fā)明利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)高效表達白藜蘆醇合成的關(guān)鍵酶，并分離純化，使其能在體外條件下與底物充分發(fā)生催化反應(yīng)，以得到目的產(chǎn)物。為解決其技術(shù)問題，本發(fā)明利用昆蟲表達系統(tǒng)，同時將白藜蘆醇芪合酶基因5’端的30個堿基替換為家蠶桿狀病毒多角體基因5’端的30個堿基，并采用如下技術(shù)方案制得白藜蘆醇芪合酶1)通過RT-PCR從葡萄組織獲得白藜蘆醇芪合酶(STS)基因(SEQ ID No 1)；并在其5’端加上BamH I酶切位點，3’端加上Sal I酶切位點，獲得重組基因；其中，所使用的上游引物5 ‘ -GGAAGGATCCATGCCGAATTATTCATACACCCCCACCATCCAACGTGCCAAGGGTCCGGC 和下游引物5 ‘ -GGGCGTCGACTTAATTTGTAACCATAGC ；2)把重組基因經(jīng)BamH I和Sal I雙酶切后與pFastBac HTA質(zhì)粒載體連接并獲得重組 pFastBac HTA-Ilcjy 質(zhì)粒，Bacmid DNA ；3)轉(zhuǎn)化DH IOBac大腸桿菌感受態(tài)細胞；4)經(jīng)藍白斑篩選(含卡那霉素kanamycin，Kan ；慶大霉素gentamicin，Gen ；四環(huán)素tetracycline，Tet的固體培養(yǎng)基)，挑取含有重組Bacmid的白色菌落，提取重組Bacmid DNA ；5)提取重組Bacmid DNA，用脂質(zhì)體介導法轉(zhuǎn)染昆蟲細胞，獲得重組病毒(中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，CGMCC，保藏編號CGMCC3673)；6)重組病毒的鑒定及大量擴增；7)重組病毒接種家蠶蛹，28°C 士2°C反應(yīng)5到7天，即獲得大量表達白藜蘆醇芪合酶的工程蠶蛹；8)勻漿后純化獲得重組白藜蘆醇芪合酶，蠶蛹用0.85wt%生理鹽水按重量比 1 1混和后勻漿，然后多次離心后用G150分子篩純化并脫鹽后獲得重組白藜蘆醇芪合酶 (SEQ ID No2)。制得的白藜蘆醇芪合酶用于白藜蘆醇的制備，具體如下1)在30°C下，與西瓜皮或哈密瓜皮或葡萄皮及葡萄籽的提取液反應(yīng)6 8小時， 獲得反應(yīng)混合物。 2)反應(yīng)混合物用大孔樹脂純化，使用中極性的粒徑在0. 30 1. 25mm的大孔樹脂 DM-130進行富集，在常溫條件下，用質(zhì)量分數(shù)為60%的乙醇作解吸劑，以2. OmL/min的流速對已吸附了樣品的白藜蘆醇進行洗脫，收集洗脫液，獲得的洗脫液經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，去除有機溶劑，并冷凍干燥，得到白藜蘆醇粗制品。本發(fā)明技術(shù)方案實現(xiàn)的有益效果本發(fā)明利用在昆蟲表達系統(tǒng)中獲得白藜蘆醇芪合酶，然后利用純化得到的該芪合酶經(jīng)轉(zhuǎn)化獲得白藜蘆醇。本發(fā)明技術(shù)方案一是克服了化學合成技術(shù)上所存在的問題，如合成步驟繁雜，副產(chǎn)物難以去除，產(chǎn)物回收率不高，存在順反異構(gòu)體以及不能直接為人類所利用等問題；二是克服了原核表達系統(tǒng)所得產(chǎn)物活性低的問題，酵母表達系統(tǒng)生產(chǎn)的工程成本問題高以及植物表達系統(tǒng)生產(chǎn)藥物的周期長、低轉(zhuǎn)染效率等問題。其操作流程相對簡單， 充分利用果皮廢棄物，符合低碳經(jīng)濟理念，能結(jié)合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)以滿足市場的需要，有較為廣闊的市場前景。


圖1為RT-PCR獲得白藜蘆醇芪合酶基因的PCR產(chǎn)物電泳圖，1為250bp DNA標記， 2為PCR產(chǎn)物分子量1. 2kb。
具體實施例方式本發(fā)明的技術(shù)方案結(jié)合以下附圖詳細描述如下。本發(fā)明所用的試劑若未明確指明，則均購自西格瑪-奧德里奇(Sigma-Aldrich)。實驗例1 白藜蘆醇芪合酶基因的獲得。以葡萄嫩芽為材料，用Trizol法提取總RNA，已Oligo (dT18)為引物逆轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA,并進行RT-PCR擴增白藜蘆醇芪合酶基因，引物如下上游引物5‘ -GGAAGGATCCATGCCGAATTATTCATACACCCCCACCATCCAACGTGCCAAGGGTC C GGC ；下游引物5‘ -GGGCGTCGACTTAATTTGTAACCATAGC。
PCR反應(yīng)體系為
ddH2020 μ L
10 X PCR緩沖液
2. 5μ L
(25mmol/L MgCl2)
2. 5mmol/L dNTP0. 5μ L
Primer 10. 5μ L
Primer 20. 5μ L
Taq聚合酶0. 5μ L
cDNA模板0. 5μ L
Total25 μ L
PCR的反應(yīng)程序為
94°C預(yù)變性5min
94°C變性45 sec ^60°C退火45 sec 卜 30 cycles72。C延伸90 sec 」
72 0CIOmin
最后保存于4°C。
純化PCR產(chǎn)物即獲得白藜蘆醇芪合酶基因，目的片段大小約
實施例2重組家蠶桿狀狀病毒的制備
l.pFast HTA和純化PCR產(chǎn)物的雙酶切
在無菌的Eppendorf管中，依次加
IOX緩沖液5 μ L
pFastBac HTA42. 5μ L
BamH I1. 5μ L
Sal I1 μ L
Total50 μ L
IOX緩沖液5 μ L
純化后PCR產(chǎn)物42. 5μ L
BamH I1. 5μ L
Sal I1 μ L
Total50 μ L
37°C溫育4h后備用。
2.酶切產(chǎn)物處理
雙酶切后的反應(yīng)體系，70°C水浴IOmin滅活限制性內(nèi)切酶。膠回收PCR酶切后小片段以及pFastBac HTA載體大片段。利用膠回收試劑盒分別純化回收。3.連接反應(yīng)將純化的PCR產(chǎn)物與pET_28a連接，反應(yīng)條件如下2X連接酶緩沖液5yL回收的PCR產(chǎn)物3 μ LT4DNA 連接酶1 μ LpFastBac HTA1 μ L_Total10 μ L4 °C連接過夜。4.連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化1)取 5 μ L 重組質(zhì)粒 pFastBac HTA-llc jy，加到 200 μ L BmDHlOBac 感受態(tài)細胞懸液中，輕輕混勻，冰上放置30min ；2) 42°C水浴熱激45sec，迅速取出置冰上冷卻3_5min ；3)加入ImL 37°C預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基(不含抗生素)，混勻后37°C水浴4h，使細菌恢復(fù)正常生長狀態(tài)；4)將轉(zhuǎn)化好的菌液4000rpm離心lOmin，棄ImL上清，沉淀重懸后取約200 μ L培養(yǎng)液。5)取20μ L菌液稀釋100倍，然后加入5μ L X_gal和5 μ L IPTG混勻，取菌液 100-200 μ L涂布于LB平板(含Tet、Gen和Kan)上，37°C正面向上避光放置30min，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置避光培養(yǎng)48h。5.重組Bacmid的小量制備1)分別取 1. 5mL 培養(yǎng)液倒入 1. 5mL Eppendorf 管中，4°C，14，OOOrpm 離心 Imin ；2)棄盡上清，菌體沉淀重懸于預(yù)冷的300yL溶液I中，用吸液槍反復(fù)輕輕吹打；3)加入新鮮配制的溶液II 300 μ L，輕輕吹打，使其混勻；4)緩慢加入300 μ L ρΗ值為5. 5的醋酸鉀溶液，邊加邊輕輕混勻，冰浴5-lOmin ；5)在 4°C下，14，OOOrpm 離心 IOmin ；6)將上清液輕輕轉(zhuǎn)移到新的Eppendorf管中，加入800 μ L異丙醇，并且輕輕反復(fù)倒置，使液體充分混勻，然后冰浴5-lOmin。室溫，14，OOOrpm離心15min ；7)小心移除上清液，加入500 μ L 70 %的乙醇，將Eppendorf管反復(fù)輕輕倒置幾次，使液體充分混勻；8)在室溫下14，OOOrpm離心5min，使重組Bacmid DNA充分洗滌和沉淀。如果需要的話重復(fù)10-11步。9)將上清液充分移除并且小心以防重組Bacmid DNA的再度溶解，在室溫下將沉淀出的DNA放置5-lOmin晾干。切忌過分干燥。10)將重組Bacmid DNA再次溶解于40 μ L ρΗ值為8. 0的1 X TE Buffer中，避免劇烈搖動以防DNA斷裂。允許輕輕搖晃使位于Eppendorf管底部的DNA充分溶解。11)將重組Bacmid DNA通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到家蠶Bm5細胞中。
12)等細胞發(fā)病后，傳代培養(yǎng)重組病毒，并收集備用。實驗例3重組病毒的接種和重組酶的純化1.接種用3日齡蛹作為接種對象，蠶蛹表皮(70%酒精，食用酒精)消毒，按每頭約 IOOpfu重組病毒穿刺接種。在清凈的條件下，28°C放置5-7天，收獲蠶蛹速凍后，_20°C儲存?zhèn)溆谩?.純化重組酶1)蠶蛹勻漿a)原料蠶蛹在4°C解凍(約30min)，與0. 85%生理鹽水按重量比1 1混和；勻漿，時間為9min勻至漿液細致均勻即可；2)低速離心(使用R10A3轉(zhuǎn)頭)，依次為b)將勻漿液加入500ml離心管中，配平，將R10A3轉(zhuǎn)頭放入離心機，3000rpm離心 30min，取上清，小心棄去油脂；c)將3000rpm離心上清液倒入新500ml離心管中，配平，6000rpm離心30min，取上
清，棄油脂；d)取出R10A3轉(zhuǎn)頭，擦拭后倒扣在毛巾上；實驗例4果皮液汁的提取果皮切碎后，用中藥粉碎機打成糊狀，用4層紗布過濾，濾液12000rpm離心IOmin
后上清即為果汁提取液。實驗例5利用重組酶生產(chǎn)白藜蘆醇實例3中的初酶液與實例4中果皮提取液(提取液中4-香豆酰輔酶A的含量大于6 μ g/mL)，按1 6的體積比，于30°C下反應(yīng)6 8小時，收集反應(yīng)混合物。實驗例6反應(yīng)混合物中白藜蘆醇的純化中極性的粒徑在0. 30 1. 25mm的大孔樹脂DM-130進行富集，在常溫條件下，用質(zhì)量分數(shù)為60%的乙醇作解吸劑，以2. OmL/min的流速對已吸附了樣品的白藜蘆醇進行洗脫，收集洗脫液，獲得的洗脫液經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，去除有機溶劑，并冷凍干燥，得到白藜蘆醇產(chǎn)品，用高效液相色譜法測定其含量，產(chǎn)品中白藜蘆醇量不低于70 %。
序列表
<110>上?？茞凵锛夹g(shù)有限公司
<120>利用昆蟲系統(tǒng)表達白藜蘆醇芪合酶和制備白藜蘆醇的方法 <130> MKA. HF. 9001 <160> 2
<170> PatentIn version 3.3 <210> SEQ ID No 1 <211> 1179 <212> DNA
<213>白藜蘆醇芪合酶基因 <400> 1
atgccgaatt attcatacac ccccaccatc caacgtgcca agggtccggc cactatccta60gccattggca cagctactcc ttcagggtca ctaagagcga gacaaatcaa tgatcaagaa ccaaacattg gtgcttatat gaggtaccta gacttggtag aagtccaaga tcacccatct gattacaaac tcgctaatct catcaagggt gctatgcagg aatgcaggag cacgagttct ccttccgaag atgctttgga gctgtgattg ttggatcaga tcagcagccc aaacatttat gtggggctca cctttcattt aaatgcttga cccaggcttt attgctcacc caggtggccc aaaaagaaac tcgaagcaac tgtgtgttgt ttattctgga acaggtgaag gattggattg actgttgtgc tgcatagcgt 〈210〉 SEQ ID No 2 〈211〉 276 〈212〉 PRT
〈213〉白藜蘆醇芪合酶 〈400〉 2
Met Pro Asn Tyr Ser Tyr 15101520
Ala lie Gly Thr Ala Thr 25303540
Phe Arg Val Thr Lys Ser 45505560
Asp Lys Ser Met lie Lys 65707580
Pro Asn lie Gly Ala Tyr 859095100
Glu Val Pro Arg Leu Gly
105110115120
Lys Ser Lys lie Thr His
125130135140
Asp Tyr Lys Leu Ala Asn
tgaccactgt gtctaccagt ctgattatgc gcacatgact gagttgaaga agaagttcaa gcgttacatt cacttgaccg aagaaatgct ggctccatct cttaacatac gccaagagat ggatgcagca ttgaaggctc ttaaagagtg tgtattttgt acaacctccg gtgtagaaat cttaggtctt gaaacatcgg ttagaagggt tggaactgtc cttcgaactg ctaaggatct tgtggtgtgc tctgagatca ctgttgttac ctctttagtt ggccaagccc tttttggtga tccagatgtc tcgattgaac gaccactctt tcctaattca gcaggagcca ttgccggaaa gtggcccaat gtgcctactt tgatttctga tgacccactt ggtattagcg attggaactc tgcaattctc gatgcagttg aagcaaaact taggcatgtg ttaagtgagt acggtaacat tgagatgaga aagaaatcct tgaaggggga gggagtatta tttggttttg ggccgggctt tcctacagtt acaaattaall79
tgattactatl20
tcgcatatgtl80
tgaggagcac240
tatcactgct300
gggccaacca360
gcccggtgcg420
gatgttgtac480
tgcagaaaat540
attccgtggc600
tgggtcttca660
ccaacttgtt720
cttacgtgag780
gaacatagag840
gttattttgg900
caatttagag960
gtcaagtgcal020
aaaggctaccl080
gaccatcgaall40
Thr Pro Thr lie Gln Arg Ala Lys Gly Pro Ala Thr lie Leu
Pro Asp His Cys Val Tyr Gln Ser Asp Tyr Ala Asp Tyr Tyr
Glu His Met Thr Glu Leu Lys Lys Lys Phe Asn Arg lie Cys
Lys Arg Tyr lie His Leu Thr Glu Glu Met Leu Glu Glu His
Met Ala Pro Ser Leu Asn lie Arg Gln Glu lie lie Thr Ala
Arg Asp Ala Ala Leu Lys Ala Leu Lys Glu Trp Gly Gln Pro
Leu Val Phe Cys Thr Thr Ser Gly Val Glu Met Pro Gly Ala
Leu Leu Gly Leu Glu Thr Ser Val Arg Arg Val Met Leu TyrCN 102220350 A
145150155160
His Gln Gly Cys Tyr Ala Gly Gly Thr Val Leu Arg Thr Ala Lys Asp Leu Ala Glu Asn 165170175180
Asn Ala Gly Ala Arg Val Leu Val Val Cys Ser Glu lie Thr Val Val Thr Phe Arg Gly 185190195200
Pro Ser Glu Asp Ala Leu Asp Ser Leu Val Gly Gln Ala Leu Phe Gly Asp Gly Ser Ser 205210215220
Ala Val lie Val Gly Ser Asp Pro Asp Val Ser lie Glu Arg Pro Leu Phe Gln Leu Val 225230235240
Ser Ala Ala Gln Thr Phe lie Pro Asn Ser Ala Gly Ala lie Ala Gly Asn Leu Arg Glu 245250255260
Val Gly Leu Thr Phe His Leu Trp Pro Asn Val Pro Thr Leu lie Ser 265270275
1權(quán)利要求
1.一種利用昆蟲系統(tǒng)表達白藜蘆醇芪合酶制備的方法，包括1)通過RT-PCR從葡萄組織中獲得白藜蘆醇芪合酶基因，并在其5’端加上BamHI酶切位點，3’端加上Sal I酶切位點，獲得重組基因；2)把步驟1)獲得的重組基因經(jīng)BamHI和Sal I雙酶切后與pFastBac HTA質(zhì)粒載體連接并獲得重組PFastBac ΗΤΑ-llcjy質(zhì)粒；3)把步驟2)得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DHIOBac大腸桿菌感受態(tài)細胞；4)經(jīng)藍白斑篩選，挑取含有重組Bacmid的白色菌落，提取重組BacmidDNA ；5)用脂質(zhì)體介導法轉(zhuǎn)染昆蟲細胞，獲得重組病毒，保藏號CGMCC3673；6)重組病毒的鑒定及大量擴增；7)重組病毒接種家蠶蛹，28°C士2°C反應(yīng)5到7天，即獲得大量表達白藜蘆醇芪合酶的工程蠶蛹；8)蠶蛹用0.85wt%生理鹽水按重量比1 1混和后勻漿，然后多次離心后用G150分子篩純化并脫鹽后獲得重組白藜蘆醇芪合酶。
2.如權(quán)利要求1所述的利用昆蟲系統(tǒng)表達白藜蘆醇芪合酶制備的方法，其特征是所述 RT-PCR 的上游引物為 5 ‘ -GGAAGGATCCATGCCGAATTATTCATACACCCCCACCATCCAACGTGCCAAGGG TCCGGC，下游引物為 5 ‘ -GGGCGTCGACTTAATTTGTAACCATAGC。
3.如權(quán)利要求1所述的利用昆蟲系統(tǒng)表達白藜蘆醇芪合酶制備的方法，其特征是所述藍白斑篩選選擇含卡那霉素、慶大霉素和四環(huán)素的固體培養(yǎng)基。
4.如權(quán)利要求1所述的利用昆蟲系統(tǒng)表達白藜蘆醇芪合酶制備的方法，其特征是所述的重組白藜蘆醇芪合酶如SEQ ID No2。
5.一種白藜蘆醇的制備方法，包括1)在30°C下，把按權(quán)利要求1所述利用昆蟲系統(tǒng)表達白藜蘆醇芪合酶制備的方法制得的白藜蘆醇芪合酶與西瓜皮或哈密瓜皮或葡萄皮及葡萄籽的提取液反應(yīng)6 8小時，獲得反應(yīng)混合物；2)反應(yīng)混合物用大孔樹脂純化。
6.如權(quán)利要求4所述的白藜蘆醇的制備方法，其特征是所述大孔樹脂純化的方法為使用中極性的粒徑在0. 30 1. 25mm的大孔樹脂DM-130進行富集，在常溫條件下，用質(zhì)量分數(shù)為60%的乙醇作解吸劑，以2. OmL/min的流速對已吸附了樣品的白藜蘆醇進行洗脫，收集洗脫液，獲得的洗脫液經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，去除有機溶劑，并冷凍干燥，得到白藜蘆醇粗制品。
全文摘要
一種利用在昆蟲表達系統(tǒng)中獲得白藜蘆醇芪合酶的方法，在采用Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)的同時，將白藜蘆醇芪合酶基因5’端的30個堿基替換為家蠶桿狀病毒多角體基因5’端的30個堿基的方式以增強白藜蘆醇芪合酶基因在昆蟲表達系統(tǒng)中高效表達。白藜蘆醇芪合酶表達產(chǎn)物經(jīng)純化后被用于白藜蘆醇的生物轉(zhuǎn)化。本發(fā)明技術(shù)方案既克服了化學合成技術(shù)上所存在的問題，還克服了原核表達系統(tǒng)所得產(chǎn)物活性低的問題，操作過程簡單，能充分利用果皮廢棄物，符合低碳經(jīng)濟理念，能結(jié)合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)以滿足市場的需要，有較為廣闊的市場前景。
文檔編號C12P7/22GK102220350SQ20101014807
公開日2011年10月19日 申請日期2010年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月15日
發(fā)明者葉甫云, 呂正兵, 高然 申請人:上?？茞凵锛夹g(shù)有限公司