專利名稱：支原體清除試劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及支原體清除試劑及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
支原體是細(xì)胞培養(yǎng)中最常見、不易被察覺和干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果的污染物，約有 30. 3% 50. 5%的細(xì)胞培養(yǎng)物中有支原體污染。培養(yǎng)細(xì)胞中支原體污染的來(lái)源包括所使 用的動(dòng)物來(lái)源的一些產(chǎn)品如血清或已被支原體污染的細(xì)胞株系。細(xì)胞培養(yǎng)上清液中支原 體的濃度可達(dá)107個(gè)/ml，而培養(yǎng)的細(xì)胞看起來(lái)很正常，在肉眼觀察或普通光學(xué)顯微鏡下觀 察，受污染的細(xì)胞可無(wú)明顯變化。由于競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)及支原體有毒的代謝產(chǎn)物，支原體污染可顯 著影響培養(yǎng)細(xì)胞的生理活性，使研究結(jié)果的真實(shí)性和可靠性大大下降。多數(shù)支原體適合于偏堿條件下生存(pH7. 6-8. 0)，對(duì)酸耐受性差，對(duì)熱比較敏感， 對(duì)一般抗生素不敏感。支原體最突出的結(jié)構(gòu)特征是沒有細(xì)胞壁，對(duì)作用于細(xì)胞壁生物合成 的抗生素，如內(nèi)酰胺類、萬(wàn)古霉素等完全不敏感，對(duì)多粘菌素、磺胺藥物普遍耐藥。對(duì)支 原體最具抑制活性，臨床常用干擾蛋白合成的抗生素四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類和阻止DNA復(fù) 制的抗生素喹諾酮類；氨基糖苷類、氯霉素有較小抑制作用；雙萜烯類-Tiamulin，其活性 優(yōu)于其它抗生素；抗腫瘤類絲裂霉素C、放線菌素D也有突出的抑制作用。但是實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞 培養(yǎng)不同于臨床應(yīng)用，而且細(xì)胞培養(yǎng)中，支原體很容易反復(fù)感染，對(duì)于正在實(shí)驗(yàn)的重要細(xì)胞 株，有必要盡快清除支原體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的既是開發(fā)一種支原體清除試劑，能有效地清除支原體，不影響細(xì)胞 本身的代謝。本發(fā)明的支原體清除試劑包括下列重量百分比的組分氟喹諾酮類抗生素1.3-1.5%四環(huán)素類衍生物0.3-0.5%大環(huán)內(nèi)酯類抗生素0.1-0.3%緩沖液97.7-98.3%。較佳的，所述氟喹諾酮類抗生素選自莫西沙星、克林沙星和吉米沙星中的一種或 多種，最佳的，所述氟喹諾酮類抗生素為吉米沙星。較佳的，所述四環(huán)素類衍生物選自強(qiáng)力霉素、米諾環(huán)素、氫吡四環(huán)素、替加環(huán)素中 的一種或多種，最佳的，所述四環(huán)素類衍生物為米諾環(huán)素。較佳的，所述大環(huán)內(nèi)酯類抗生素選自阿奇霉素、克拉霉素、羅紅霉素中的一種或多 種，最佳的，所述大環(huán)內(nèi)酯類抗生素為阿奇霉素。優(yōu)選的，所述緩沖液包括下列重量百分比的組分NaOH0. 2-0. 6%NaCl0. 9-1%
葡萄糖5-8%H20余量本發(fā)明的支原體清除試劑在常溫下為黃色液體狀，對(duì)光與熱敏感，使用與保存必 須避光，避免反復(fù)凍融，融化后如果出現(xiàn)結(jié)晶時(shí)為正?，F(xiàn)象，搖動(dòng)儲(chǔ)存管至結(jié)晶消失即可正 常使用。本發(fā)明的支原體清除試劑短期內(nèi)使用需避光于4°C冰箱保存，在此溫度下其最高效 價(jià)能夠維持2-3周，如果需要長(zhǎng)期保存使用需避光于-20°C冰箱凍存，在此溫度下其最高效 價(jià)能夠維持一年以上。本發(fā)明還進(jìn)一步公開了本發(fā)明的支原體清除試劑用于清除支原體及預(yù)防支原體 生長(zhǎng)的用途，尤其是去除及預(yù)防細(xì)胞培養(yǎng)中的支原體的用途。本發(fā)明的支原體清除試劑在用于去除細(xì)胞培養(yǎng)中的支原體時(shí)，只需將其加入無(wú)雙 抗的細(xì)胞培養(yǎng)基中，在隨后的傳代時(shí)使用該培養(yǎng)基培養(yǎng)，持續(xù)一周基本可以清除支原體，對(duì) 于污染嚴(yán)重的細(xì)胞可適當(dāng)重復(fù)作用一個(gè)周期以達(dá)到最佳效果，推薦工作濃度為lOug/mL。為 了維持清除效果，可用2 5ug/ml的濃度進(jìn)行維持預(yù)防。本發(fā)明的支原體清除試劑，其中主體抗生素屬于氟喹諾酮類，另外還包括四環(huán)素 類衍生物及部分大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，用特制緩沖液混合而成，能夠最有效抑制并殺死支原 體，作用周期短只需要一周便可全部殺死支原體，不影響細(xì)胞本身的代謝，并且經(jīng)過(guò)處理的 細(xì)胞表面光滑，黑色狀顆?；鞠В?xì)胞不會(huì)輕易被支原體重新感染。


圖1 支原體清除試劑使用示意圖
圖2 使用支原體清除試劑前后對(duì)照?qǐng)D
A:處理前DLD-1細(xì)胞白光視野A，處理后DLD-1細(xì)胞白光視野
B 處理前DLD-1細(xì)胞熒光視野B，處理后DLD-1細(xì)胞熒光視野
C:處理前Hela細(xì)胞白光視野C，處理后Hela細(xì)胞白光視野
D 處理前Hela細(xì)胞熒光視野D，處理后Hela細(xì)胞熒光視野
E:處理前MG-63細(xì)胞白光視野E，處理后MG-63細(xì)胞白光視野
F 處理前MG-63細(xì)胞熒光視野F，處理后MG-63細(xì)胞熒光視野
H 處理前SGC-7901細(xì)胞白光視野H，處理后SGC-7901細(xì)胞白光視野
I 處理前SGC-7901細(xì)胞熒光視野I，處理后SGC-7901細(xì)胞熒光視野
J 處理前SMMC-7721細(xì)胞白光視野J，處理后SMMC-7721細(xì)胞白光視野
K 處理前SMMC-7721細(xì)胞熒光視野K，處理后SMMC-7721細(xì)胞熒光視野
L:處理前Panc-1細(xì)胞白光視野L，處理后Panc-1細(xì)胞白光視野
M 處理前Panc-1細(xì)胞熒光視野M，處理后Panc-1細(xì)胞熒光視野
圖3 實(shí)施例3的巢式PCR檢測(cè)結(jié)果
圖4 支原體清除比較巢式PCR檢測(cè)結(jié)果
泳道上樣說(shuō)明
M :DL250+
1 污染的細(xì)胞上清，未加入藥物去除
2 吉米沙星去除后的細(xì)胞上清
3 米諾環(huán)素去除后的細(xì)胞上清4 阿奇霉素去除后的細(xì)胞上清5 :Mycoplasma-0UT去除后的細(xì)胞上清6:未加入IC與PC7 只加入 IC8:只加入 PC
具體實(shí)施例方式以下列舉具體實(shí)例以進(jìn)一步闡述本發(fā)明，應(yīng)理解，實(shí)例并非用于限制本發(fā)明的保 護(hù)范圍。實(shí)施例1支原體清除試劑的配置按下列配方配制250ul試劑(各組分以重量百分比計(jì))配方1:吉米沙星 1.4%米諾環(huán)素 0.4%阿奇霉素 0.2%緩沖液 98%緩沖液配方NaOH 0. 4%Nacl 0. 9%葡萄糖 5%H20 93. 7%配方2:莫西沙星 1.3%強(qiáng)力霉素 0.5%克拉霉素 0. 1 %緩沖液98.1%緩沖液配方NaOH 0. 2%Nacl 1. 0%葡萄糖 8%H20 90. 8%配方3:克林沙星 1.5%替加環(huán)素 0.3%羅紅霉素 0.3%緩沖液97.9%緩沖液配方NaOH 0. 6%Nacl 0. 9%葡萄糖 5%H20 93. 5%
配置方法1.緩沖液的配置1)超純水103. 4kpa蒸汽壓溫度達(dá)121. 3°C，維持15_20分鐘濕熱滅菌備用2)按照以上配方稱量各組分制劑3)用超純水溶解以上制劑于4°C保存2.按配方稱量氟喹諾酮類抗生素、四環(huán)素類衍生物和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素于50ml 無(wú)菌離心管中，用緩沖液避光溶解3.用millipore 0. 22um孔徑濾器過(guò)濾分裝4.濃度 20mg/mL，250ul/ 盒，4°C保存實(shí)施例2支原體清除試劑清除支原體效果試驗(yàn)采用實(shí)施例1配方1制備的支原體清除試劑，使用方法如圖1所述，包括如下步 驟1.復(fù)蘇細(xì)胞，調(diào)整后進(jìn)行種板，6cm盤中種植lxlO6個(gè)細(xì)胞；2.次日待細(xì)胞貼壁后，按2000x比例將支原體清除試劑稀釋到含5% FBS無(wú)雙抗 培養(yǎng)基中，在隨后的傳代時(shí)使用該培養(yǎng)基培養(yǎng)；3.作用7天，此過(guò)程中注意觀察并記錄細(xì)胞狀態(tài)，換液或傳代時(shí)用含有支原體清 除試劑的培養(yǎng)基維持；4. 7天后換成正常的不含抗生素的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)2天，每盤體積加至4_5ml ；5. 2天后吸取培養(yǎng)上清500ul，進(jìn)行PCR(檢測(cè)步驟詳見吉?jiǎng)P基因GC-PCR Mycoplasma TestKit 操作手冊(cè))；6.檢測(cè)結(jié)果為陰性后的細(xì)胞擴(kuò)大凍存保種或直接進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)。處理對(duì)象為實(shí)驗(yàn)室明確被支原體污染的DLD-1細(xì)胞、He 1 a細(xì)胞、MG-63細(xì)胞、 SGC-7901細(xì)胞、SMMC-7721細(xì)胞和Panc_l細(xì)胞，處理7天前后的細(xì)胞形態(tài)與感染效率比較 照片如圖2所示。由照片可見處理前細(xì)胞表面有碎片，黑色顆粒狀物質(zhì)，背景很臟，部分細(xì)胞變圓， 感染效率較低；處理后細(xì)胞表面碎片與黑色顆粒狀物質(zhì)消失，背景干凈，細(xì)胞完全鋪開，且 感染效率明顯增加。實(shí)施例3支原體清除試劑清除支原體效果試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)器材超鏡臺(tái)水浴鍋離心機(jī)負(fù)80度冰箱PCR儀電泳槽凝膠成像儀電泳儀無(wú)菌PCR管無(wú)菌1. 5ml EP管PCR管架無(wú)菌槍頭棉球移液器(lml200ul 10ul 2ul)實(shí)驗(yàn)試劑無(wú)菌超純水待檢樣品75%消毒酒精去支原體噴霧劑(實(shí)施例1制備)Germ-free test medium巢式PCR支原體快速檢測(cè)試劑盒(上海吉盛制藥公司)2% 瓊脂糖膠 EB 電泳緩沖液 Mark(DL250+)6x Loading Buffer實(shí)驗(yàn)步驟參考實(shí)施2的方法使用支原體清除試劑。
采用下列方法使用巢式PCR支原體快速檢測(cè)試劑盒1.收集需要檢測(cè)的樣品，負(fù)80度冰箱保存2. 95度沸水浴中煮待檢樣品5 lOmin，12000轉(zhuǎn)每分鐘離心2min3.用75%消毒酒精擦拭所有實(shí)驗(yàn)器材與物料，再用去支原體噴霧劑噴灑重要物 料與器材，均勻擦拭表面以徹底去除環(huán)境中的支原體4.取出PCR管若干，1.5ml EP管若干，放置備用5.稀釋引物，PC(Positive Control)與 IC(Internal Control)質(zhì)粒(IC的作用是 與支原體的DNA序列形成競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，當(dāng)沒有支原體污染時(shí)，可以擴(kuò)增出條帶，當(dāng)有污染時(shí)， 它被抑制不被擴(kuò)增)到適當(dāng)濃度6.配置第一輪PCR體系總管，然后每管48ul分裝到事先準(zhǔn)備的PCR管內(nèi)，其中需 添加水對(duì)照與IC對(duì)照7.加入待檢樣品，振蕩器上混勻后進(jìn)行第一輪PCR8.第一輪PCR結(jié)束后，配置第二輪PCR體系總管，然后每管48ul分裝到事先準(zhǔn)備 的PCR管內(nèi)，其中需添加PC對(duì)照9.加入第一輪PCR產(chǎn)物，振蕩器上混勻后進(jìn)行第二輪PCR
10.結(jié)束后加入Loading Buffer,配置2%瓊脂糖膠，上樣進(jìn)行電泳，拍照PCR體爾
H20 32ul
5X Buffer (Mg2+) lOul
dNTP 3ul
Primer MIX 2. 5ul
Taq 酶 0. 5ul
Template 2ul
第一輪循環(huán)第二輪循環(huán)
1 循環(huán) 94°C for 2min1 循環(huán) 94°C for 2min
30 循環(huán) cycle 94°C for 30sec30 循環(huán) e 94°C for 30sec
62 °C for lmin53°C for 30sec
72 °C for lmin72°C for 30sec
1 循環(huán) 72°C for lOmin1 循環(huán) 72°C for lOmin
冷卻至4°C冷卻至4°C
實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
結(jié)果如圖3所示
上樣編號(hào)
1 3 :293T細(xì)胞(復(fù)蘇后)；293T細(xì)胞(加藥前)；293T細(xì)胞(加藥后)
4 6 :panc-l細(xì)胞(復(fù)蘇后)；panc-1細(xì)胞(加藥前)；panc-1細(xì)胞(加藥后)
7 9 :SGC-7901細(xì)胞(復(fù)蘇后)；SGC-7901細(xì)胞(加藥前)；SGC-7901細(xì)胞(加藥后)
10 12 :H1299細(xì)胞(復(fù)蘇后)；H1299細(xì)胞(加藥前)；H1299細(xì)胞(加藥后)
13 15 :IC ；IC+PC ；PC
“復(fù)蘇后”的樣品是上一輪PCR的剩余上清；“加藥前”的樣品是細(xì)胞復(fù)蘇傳了 4-5傳后，用含有雙抗的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)到密度 達(dá)到80 90%的細(xì)胞培養(yǎng)上清；“加藥后”的樣品是用藥物處理一周后，換成Germ-free test medium培養(yǎng)2天后 密度達(dá)80 90%的細(xì)胞培養(yǎng)上清。PCR結(jié)果處理前與處理后的細(xì)胞上清形成鮮明對(duì)比，達(dá)到預(yù)期的效果1.本次實(shí)驗(yàn)選擇293T、panc-U SGC-7901、H1299四株細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，每株細(xì)胞設(shè) 置3組(復(fù)蘇后、加藥前、加藥后)，目的就是想看看細(xì)胞在復(fù)蘇傳代過(guò)程的污染深度情況， 用抗生素處理后的細(xì)胞是否還有支原體污染的可能。2.從PCR結(jié)果可以看出，第一輪檢測(cè)有污染的細(xì)胞確實(shí)受到支原體污染，細(xì)胞在 加藥處理后全部轉(zhuǎn)成陰性，說(shuō)明本發(fā)明的支原體清除劑可以用來(lái)快速去除支原體的首選試 劑。3.本發(fā)明的支原體清除劑處理后的細(xì)胞，外表面碎片消失，細(xì)胞通體光滑，折光度 好，細(xì)胞貼壁更開，生長(zhǎng)速度顯著提高，初步實(shí)驗(yàn)證明轉(zhuǎn)染與感染效率提高。實(shí)施例4比較試驗(yàn)
對(duì)比方1
吉米沙星4. 2%
緩沖液余量
配方NaOH0. 4%
Nacl0. 9%
葡萄糖5%
H2093. 7%
對(duì)比方2
米諾環(huán)素1. 2%
緩沖液余量
配方NaOH0. 4%
Nacl0. 9%
葡萄糖5%
H2093. 7%
對(duì)比方3
阿奇霉素0. 6%
緩沖液余量
配方NaOH0. 4%
Nacl0. 9%
葡萄糖5%
H2093. 7%
對(duì)比方4
實(shí)施例1的配方1
實(shí)驗(yàn)過(guò)程
1.將檢測(cè)有污染的細(xì)胞進(jìn)行種板(6孔板)，貼壁后培養(yǎng)1-2天2.按實(shí)施例2的方法各自加入相同體積的對(duì)比方1-4到孔板中進(jìn)行去除3.作用一周后，去培養(yǎng)上清按照實(shí)施例3的方法進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示。實(shí)驗(yàn)分析對(duì)比方1-3中各自成分單獨(dú)使用時(shí)對(duì)污染細(xì)胞的支原體都不能很好的去除干凈， 而第五泳道的對(duì)比方4去除后的細(xì)胞培養(yǎng)上清檢測(cè)是陰性，說(shuō)明將氟喹諾酮類抗生素、四 環(huán)素類衍生物和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素合用后，在清除支原體上發(fā)生了協(xié)同作用，使得清除支 原體的效果均優(yōu)于單獨(dú)使用各藥物。且本試劑中采用的緩沖液比常規(guī)緩沖液起到了更好的 保護(hù)細(xì)胞的作用。該結(jié)果表明，本發(fā)明的組方將氟喹諾酮類抗生素、四環(huán)素類衍生物和大環(huán) 內(nèi)酯類抗生素合用后，在清除支原體上發(fā)生了協(xié)同作用，使得清除支原體的效果均優(yōu)于單 獨(dú)使用各藥物。且本試劑中采用的緩沖液比常規(guī)緩沖液起到了更好的保護(hù)細(xì)胞的作用。
權(quán)利要求
一種支原體清除試劑，包括下列重量百分比的組分氟喹諾酮類抗生素 1.3-1.5％四環(huán)素類衍生物0.3-0.5％大環(huán)內(nèi)酯類抗生素 0.1-0.3％緩沖液97.7-98.3％。
2.如權(quán)利要求1所述支原體清除試劑，其特征在于，所述氟喹諾酮類抗生素選自莫西 沙星、克林沙星和吉米沙星中的一種或多種，所述四環(huán)素類衍生物選自強(qiáng)力霉素、米諾環(huán) 素、氫吡四環(huán)素和替加環(huán)素中的一種或多種，所述大環(huán)內(nèi)酯類抗生素選自阿奇霉素、克拉霉 素和羅紅霉素中的一種或多種。
3.如權(quán)利要求1所述支原體清除試劑，其特征在于，所述氟喹諾酮類抗生素為吉米沙 星，所述四環(huán)素類衍生物為米諾環(huán)素，所述大環(huán)內(nèi)酯類抗生素為阿奇霉素。
4.如權(quán)利要求1-3任一所述支原體清除試劑，其特征在于，所述緩沖液包括下列重量 百分比的組分NaOH0. 2-0. 6%NaCl0.9-1%葡萄糖5-8%H2O余量。
5.如權(quán)利要求1-4任一所述支原體清除試劑用于清除支原體及預(yù)防支原體生長(zhǎng)的用途。
6.如權(quán)利要求5所述支原體清除試劑的用途，其特征在于，將所述支原體清除試劑用 于去除及預(yù)防細(xì)胞培養(yǎng)中的支原體。
7.如權(quán)利要求1-4任一所述支原體清除試劑在用于去除細(xì)胞培養(yǎng)中的支原體時(shí)的使 用方法，包括如下步驟將所述支原體清除試劑加入無(wú)雙抗的細(xì)胞培養(yǎng)基中，在隨后的傳代 時(shí)使用該培養(yǎng)基培養(yǎng)，持續(xù)一周以清除支原體，對(duì)于污染嚴(yán)重的細(xì)胞則再重復(fù)作用一個(gè)周 期。
全文摘要
本發(fā)明涉及支原體清除試劑及其應(yīng)用。本發(fā)明的支原體清除試劑，包括下列重量百分比的組分氟喹諾酮類抗生素1.3-1.5％；四環(huán)素類衍生物0.3-0.5％；大環(huán)內(nèi)酯類抗生素0.1-0.3％；緩沖液97.7-98.3％。本發(fā)明的支原體清除試劑能夠最有效抑制并殺死支原體，作用周期短只需要一周便可全部殺死支原體，不影響細(xì)胞本身的代謝，并且經(jīng)過(guò)處理的細(xì)胞表面光滑，黑色狀顆粒基本消失，細(xì)胞不會(huì)輕易被支原體重新感染。
文檔編號(hào)C12N5/07GK101851603SQ201010148028
公開日2010年10月6日 申請(qǐng)日期2010年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月15日
發(fā)明者曹躍瓊, 王海峰, 韋有恒, 高博 申請(qǐng)人:上海吉盛制藥技術(shù)有限公司