專利名稱：輔助鑒定具有不同體重性狀的雞群體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及輔助鑒定具有不同體重性狀的雞群體的方法。
背景技術(shù)：
SNP(single nucleotide polymorphism單核苷酸多態(tài)性)主要是指在基因組水平上，由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列的多態(tài)性，包括轉(zhuǎn)換、顛換、插入或缺失。在基因組中分布密集的SNP，因其攜帶巨大的遺傳信息量，被認為是應用前景最好的遺傳標記物， 人類SNP標記的檢測已經(jīng)成為基因診斷的重要手段。SNP標記的遺傳圖譜的研究，對分子輔助育種有巨大的促進作用，農(nóng)業(yè)動物中很多重要性狀的基因已經(jīng)定位。SNP的檢測常采用一些已有的成熟技術(shù)，如DNA測序(Sanger測序法和焦磷酸測序法)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)、限制性酶切片段長度多態(tài)性(RFLP)、等位基因特異的寡聚核苷酸雜交(ASO)、寡聚核苷酸特異的連接、DNA芯片以及Taqman探針等技術(shù)手段。1991 年 Bradham 等(Bradham DM, Igarashi A, Potter RL, et al. Connectivetissue growth factor -.a cysteine-rich mitogen secreted by human vascularendothelial cells is related to the SRC-induced immediate early gene productCEF-10[J], J Cell Biol, 1991，114(6) :1285.)首次發(fā)現(xiàn)了人類結(jié)締組織生長因子 (connective tissue growth factor，CTGF)。CTGF主要由皮膚成纖維細胞、腎小球系膜細胞、肝星狀細胞、肺成纖維細胞、血管平滑肌細胞等間質(zhì)細胞合成分泌。CTGF是CCN(CTGF、 Cefl0/cyr61和Nov的縮寫)家族中的成員。該家族目前包括雞胚成纖維細胞經(jīng)誘導產(chǎn)生的CeflO、3T3細胞經(jīng)誘導產(chǎn)生的Cyr61、3T3細胞受血清刺激后產(chǎn)生的Fisp-12、成年雞腎細胞中表達的Nov、非洲爪蟾成纖維細胞產(chǎn)生的Xnov和人類CTGF。它們均屬于即刻早期基因(immediate early gene)，直接參與生長因子對細胞生長分化的調(diào)控。它們的共同結(jié)構(gòu)特點是具有很高的序列同源性和序列結(jié)構(gòu)的類似性(Bork P. The modular architecture of a new family of growth regula2torsrelated to connective tissue growth factor[J], FEBS Lett,1993,327(2) :125·)。CTGF在生物體中發(fā)揮著重要的作用，參與了多個代謝途徑，主要在以下方面發(fā)揮著作用(劉劍毅，李世榮紀淑興結(jié)締組織生長因子及其生物學作用Chinesejournal of Practical Aesthetic and Plastic Surgery,2004. Vol. 15No. 1)(1)加速DNA合成、促進細胞增殖1991年Bradham等首先發(fā)現(xiàn)人類CTGF對3T3 細胞具有促有絲分裂作用。(2)調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)基因的表達CTGF能夠刺激成纖維細胞增殖、細胞外基質(zhì)產(chǎn)生、肉芽組織形成和纖維化。(3)介導細胞黏附Chen 等(Chen CC, Chen N, Lau L F. The angiogenic factorsCyr6land connective tissue growth factor induce adhesive signaling in primaryhuman skin fibroblasts [J]. J Biol Chem，2001，276 (13) : 10443.)研究發(fā)現(xiàn)CTGF 能夠介導成纖維細胞的黏附，其過程必須要有整合素和硫酸乙酰肝素糖蛋白的參與。
(4)刺激細胞遷移=Bradham等發(fā)現(xiàn)，CTGF可以刺激體外培養(yǎng)的3T3細胞的遷移。Fan 等(Fan WH, Pech Μ, Karnovsky MJ. Connective tissue growth factor (CTGF) stimulates vascular smooth muscle cell growth and migra2tion in vitro[J]. Eur J Cell Biol, 2000, 79 (12) :915.)發(fā)現(xiàn)，如果CTGF表達過度，血管平滑肌細胞的生長率和遷
移率都將有顯著增加。(5)促進新生血管形成Babic 等(Babic AM, Chen CC, Lau L F. Fispl2/ mouseconnective tissue growth factor mediates endothelial cell adhesion andmigration through integrin alphavbeta3, promotes endothelial cell survival, and induces angiogenesis in vivo [J], Mol Cell Biol, 1999,19(4) :2958.)發(fā)現(xiàn)在血管化組織和動脈粥樣硬化斑塊組織中存在CTGF的強陽性表達。(6)促進軟骨發(fā)生和骨骼發(fā)育CTGF可促進軟骨細胞和成骨細胞的增殖 分化，Nakanishi 等(Nakanishi T, Kimura Y, Tamura T, et al. Cloning of a mRNApreferentially expressed in chondrocytes by differential display-PCR from ahuman chondrocytic cell line that is identical with con2nective tissue growthfactor(CTGF)mRNA[J]. Biochem Biophys Res Commun,1997,234(1) :206.)發(fā)現(xiàn) CTGFmRNA的過表達可促進軟骨細胞株HCS-2/8細胞增殖，并促進軟骨聚集蛋白多醣分泌和 X型膠原蛋白表達，而X型膠原是肥大帶軟骨細胞的表型特征。(7)促進細胞存活、免于凋亡=Babic等發(fā)現(xiàn)將內(nèi)皮細胞置于不含生長因子的層黏連蛋白培養(yǎng)基內(nèi)(即在誘導凋亡的情況下)，加入小鼠的CTGF可以促進內(nèi)皮細胞的存活，免
于凋亡。作為生長性狀的體重指標一直是畜牧業(yè)生產(chǎn)中重要的經(jīng)濟性狀之一，也是肉雞品種選育中的重要指標。與1957年相比，2001年的肉雞當代品系的屠體產(chǎn)量提高了 6倍，其中85% -90%要歸功于遺傳學效應，只有10% -15%是由于飼料營養(yǎng)水平的改良造成的。家禽遺傳標記輔助育種研究在不斷深入，大量的性狀已經(jīng)在遺傳水平上確定了候選區(qū)域。我國有豐富的地方雞品種資源，如何對其評估、保護和選育是迫切需要解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供輔助鑒定具有不同體重性狀的雞群體的方法。本發(fā)明提供了序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成的引物對。所述引物對可應用于輔助鑒定具有不同體重性狀的雞群體。所述引物對還可應用于制備輔助鑒定具有不同體重性狀的雞群體的試劑盒。本發(fā)明同時保護含有所述引物對的輔助鑒定具有不同體重性狀的雞群體的試劑盒。本發(fā)明提供的輔助鑒定具有不同體重性狀的雞群體的方法，包括如下步驟分別以每只待測雞的基因組DNA為模板，用序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA 組成的引物對進行PCR擴增，用限制性內(nèi)切酶HhaI酶切PCR產(chǎn)物；如果得到兩條DNA片段， 待測雞的基因型為BB ；如果得到三條DNA片段，待測雞的基因型為AB ；BB基因型雞群體的平均體重在統(tǒng)計學上低于AB基因型的雞群體的平均體重。
所述兩條DNA片段具體為45bp的DNA片段和19Ibp的DNA片段；所述三條DNA片段具體為236bp的DNA片段、45bp的DNA片段和191bp的DNA片段。本發(fā)明提供的一種輔助鑒定具有不同體重性狀的雞群體的方法，包括如下步驟 分別檢測每只待測雞的基因組DNA中是否具有序列表的序列1所示DNA片段和序列表的序列2所示DNA片段；如果待測雞為序列1所示DNA片段的純合體，其基因型為BB ；如果待測雞為序列1和2所示DNA片段的雜合體，其基因型為AB ；BB基因型雞群體的平均體重在統(tǒng)計學上低于AB基因型的雞群體的平均體重。以上任一所述的方法中，還包括選擇待測雞的步驟；所述待測雞為如下兩個群體的雞一個群體中每只待測雞基因組中均同時具有序列表的序列1所示DNA片段和序列表的序列2所示DNA片段；另一個群體中每只待測雞基因組中均具有序列表的序列2所示DNA 片段且不具有序列1所示DNA片段。以上任一所述的方法中，所述待測雞具體可為CAU資源家系的雞，更具體可為CAU 資源家系的F2代個體。所述待測雞具體可為AB或BB基因型的雞。以上任一所述的方法中，所述體重性狀具體可為初生體重、1周齡體重、3周齡體重、4周齡體重、5周齡體重、6周齡體重或7周齡體重。所述的方法，所述引物對或所述的試劑盒可應用于雞的育種。以待測雞的基因組DNA為模板，用序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成的引物對進行PCR擴增，得到的PCR產(chǎn)物即為序列表的序列1或序列表的序列2 所示的DNA片段。序列1和序列2所示DNA片段僅存在一個核苷酸的差異，序列1所示DNA 片段自5’端第191位核苷酸為C，序列2所示DNA片段自5’端第191位核苷酸為T。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)該SNP(雞的類CTGF基因)與體重具有顯著相關(guān)的特性，可以作為雞的遺傳標記。本發(fā)明提供的方法和產(chǎn)品可進行輔助育種，快速準確的輔助篩選，具有早期篩選、 節(jié)省時間、成本低廉、準確性高的優(yōu)點。


圖1為PCR產(chǎn)物電泳圖譜；M IOObp Marker ；1-12泳道CAU資源家系的12個不同個體；ck:空白對照。圖2為PCR產(chǎn)物酶切后電泳圖譜；M IOObp Marker ；ck 空白對照。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。下述實施例中的％，如無特殊說明，均為質(zhì)量百分含量。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復實驗，結(jié)果取平均值。CAU資源家系由中國農(nóng)業(yè)大學李寧教授課題組1998年建立的用于研究定位影響雞重要經(jīng)濟性狀QTL、尋找克隆主效基因的實驗群體，親本為法國明星肉雞和泰和絲羽烏骨雞；來源為中國農(nóng)業(yè)大學實驗牧場；CAU資源家系參考文獻Deng，Χ. Μ.，Li，J. Y.， Li, N. , and Wu, C. Χ. (2001). [Genetic analysis of important growth traitbased on F-2resource population in chicken], Yi Chuan Xue Bao 28,801-807.；中國農(nóng)業(yè)大學保證向公眾提供。實施例1、SNP與體重相關(guān)性的發(fā)現(xiàn)通過比較基因組學分析，在雞的23號染色體上找到了人的CTGF類似物 (similarto connective tissue growth factor，L0C419598)，與和雞的基因組測序結(jié)果 BLAT,發(fā)現(xiàn)SCTGF位于雞的23號染色體(Chr23 =2887664-2896948)，由4個外顯子組成，轉(zhuǎn)錄本長度為966bp，編碼322個氨基酸。生長性狀是目前關(guān)于雞的QTL研究最多的內(nèi)容之一。在CAU資源家系中測定了 F2代個體1到12周齡的體重，根據(jù)掃描結(jié)果定位了一系列影響雞生長的QTL。其中最值得關(guān)注的是在雞的23號染色體標記ADL0262附近定位了一個影響雞出生重和早期生長(1到 7周齡)體重的QTL，根據(jù)雞的測序信息，分析這一區(qū)域的基因可以找到一些基因作為影響雞早期生長體重的候選基因進行深入研究，結(jié)締組織生長因子(cormectivetissue growth factor, CTGF) (NC_006110)就是首先的候選基因。一、基因型分析實驗材料215個CAU資源家系的F2代個體。1、基因組DNA的提取雞12周齡時翅靜脈采血，抗凝處理后裂解，經(jīng)蛋白酶K消化后，用酚仿抽提，TE溶解-20°C保存。2、PCR 擴增 以步驟1提取的基因組DNA為模板，用引物對CTGFex3H進行PCR擴增。CTGFex3H 正向引物5，-AAATCGAACCATCGGGATTA-3，；反向引物5，-GGTCTGCACCAAGCAGTTCT-3，。PCR反應體系(15μ 1)模板2μ l(40ng基因組DNA)，擴增緩沖液 (IOXbuffer) 1. 5 μ 1，dNTP 1.2 μ 1，正向引物 0. 8pm/ul，反向引物 0. 8pm/ul，DNA 聚合酶 (TaqE)O. 3 μ 1，加水補至 15 μ 1。PCR 反應條件94°C、5min ；94°C、30sec，60°C、30sec，72°C、90sec，40 循環(huán)；72°C、 7min。PCR產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠(見圖1)，回收236bp的DNA片段。3、酶切PCR擴增產(chǎn)物用HhaI進行酶切(37°C 5h)。酶切體系(20 μ 1) =PCR產(chǎn)物10 μ 1，10 倍緩沖液2μ 1，2U HhaI (TaKaRa公司)，用水補至20 μ 1。酶切產(chǎn)物用4 %瓊脂糖凝膠檢測(見圖2)。產(chǎn)生三種帶型第一種帶型只有一個條帶，為236bp ；將基因型命名為AA ；第二種帶型有兩個條帶，分別為45bp和191bp ；將基因型命名為BB，45bp片段較小，未能顯示，所以圖2顯示出來一條19Ibp的條帶；第三種帶型有三個條帶，分別為45bp、191bp和236bp ；將基因型命名為AB，45bp 片段較小，未能顯示，所以圖2顯示出來19Ibp和236bp的兩條條帶。統(tǒng)計結(jié)果如表1。表ICTGF基因PCR-HhaI-RFLP鑒定基因型在F2群體中的分布
權(quán)利要求
1.序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成的引物對。
2.權(quán)利要求1所述引物對在輔助鑒定具有不同體重性狀的雞群體中的應用。
3.權(quán)利要求1所述引物對在制備輔助鑒定具有具有不同體重性狀的雞群體的試劑盒中的應用。
4.一種輔助鑒定具有不同體重性狀的雞群體的試劑盒，包括權(quán)利要求1所述引物對。
5.一種輔助鑒定具有不同體重性狀的雞群體的方法，包括如下步驟分別以每只待測雞的基因組DNA為模板，用權(quán)利要求1所述引物對進行PCR擴增，用限制性內(nèi)切酶HhaI酶切PCR產(chǎn)物；如果得到兩條DNA片段，待測雞的基因型為BB ；如果得到三條DNA片段，待測雞的基因型為AB ；BB基因型雞群體的平均體重在統(tǒng)計學上低于AB基因型的雞群體的平均體重。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述兩條DNA片段為45bp的DNA片段和 191bp的DNA片段；所述三條DNA片段為236bp的DNA片段、45bp的DNA片段和191bp的 DNA片段。
7.一種輔助鑒定具有不同體重性狀的雞群體的方法，包括如下步驟分別檢測每只待測雞的基因組DNA中是否具有序列表的序列1所示DNA片段和序列表的序列2所示DNA片段；如果待測雞為序列1所示DNA片段的純合體，其基因型為BB ；如果待測雞為序列1和2 所示DNA片段的雜合體，其基因型為AB ；BB基因型雞群體的平均體重在統(tǒng)計學上低于AB基因型的雞群體的平均體重。
8.如權(quán)利要求5至7中任一所述的方法，其特征在于所述方法還包括選擇待測雞的步驟；所述待測雞為如下兩個群體的雞一個群體中每只待測雞基因組中均同時具有序列表的序列1所示DNA片段和序列表的序列2所示DNA片段；另一個群體中每只待測雞基因組中均具有序列表的序列2所示DNA片段且不具有序列1所示DNA片段。
9.如權(quán)利要求5至8中任一所述的方法，其特征在于所述待測雞為CAU資源家系的雞，優(yōu)選為CAU資源家系的F2代個體；所述體重性狀為初生體重、1周齡體重、3周齡體重、 4周齡體重、5周齡體重、6周齡體重或7周齡體重。
10.權(quán)利要求1所述的引物對，權(quán)利要求4所述的試劑盒或權(quán)利要求5至9中任一所述的方法在雞的育種中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了輔助鑒定具有不同體重性狀的雞群體的方法。本發(fā)明提供了序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成的引物對。所述引物對可應用于輔助鑒定具有不同體重性狀的雞群體。本發(fā)明提供的方法包括如下步驟分別以每只待測雞的基因組DNA為模板，用序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成的引物對進行PCR擴增，用限制性內(nèi)切酶HhaI酶切PCR產(chǎn)物；如果得到兩條DNA片段，待測雞的基因型為BB；如果得到三條DNA片段，待測雞的基因型為AB；BB基因型雞群體的平均體重在統(tǒng)計學上低于AB基因型的雞群體的平均體重。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)雞的SCTGF基因中的SNP(單核苷酸多態(tài)性)與體重具有顯著相關(guān)的特性，可以作為雞的遺傳標記，使用分子生物學手段，進行輔助育種。
文檔編號C12N15/11GK102220314SQ201010147329
公開日2011年10月19日 申請日期2010年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月13日
發(fā)明者宋遲, 李寧, 胡曉湘, 高宇 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學