專利名稱：產(chǎn)生抗真菌脂肽的微生物及其抗真菌脂肽制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及產(chǎn)生抗真菌脂肽的微生物及其抗真菌脂肽制備方 法與應(yīng)用。更具體的說是一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)抗真菌脂肽的菌種，該菌種是本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的 一株能有效生產(chǎn)抗真菌脂肽的新菌株，用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)抗真菌脂肽可以有效的用于治療 皮膚癬病。
背景技術(shù)：
脂肽是革蘭氏陽性芽孢桿菌產(chǎn)生的一種次生代謝產(chǎn)物。脂肽的分子是由親水的肽 鍵和親油的脂肪烴鏈兩部分組成，由于其特殊的化學(xué)組成和兩親型分子結(jié)構(gòu)，具有生物表 面活性劑的特性，在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、食品及化妝品、石油開采和環(huán)境治理等領(lǐng)域有重要的應(yīng)用 前景，已引起廣泛的關(guān)注。另外，大多脂肽數(shù)具有抗微生物作用，也被稱為抗生素。目前發(fā)現(xiàn) 的抗菌脂肽主要有表面活性素(surfactin)、芬薺素(fengycin)、伊枯草菌素(iturin)和 桿菌霉素(bacillomycin)、抗霉枯草菌素(mycosubtilin)、制磷月旨菌素(plipstatin)等?？咕氖峭ㄟ^在細(xì)胞膜上形成離子通道造成內(nèi)容物大量外泄而致細(xì)胞死亡。 Christeson等認(rèn)為，抗菌肽首先通過靜電作用被吸引到膜表面，然后疏水尾部插入細(xì)胞膜 中的疏水區(qū)域，通過改變膜構(gòu)象，多個抗菌肽聚合在膜上形成離子通道，造成細(xì)胞內(nèi)容物 泄露致細(xì)胞死亡。Fink等認(rèn)為只有C端的疏水螺旋插入膜中，而N端的雙親螺旋只結(jié)合 在膜表面。JuVVadi(1997)推測抗菌作用的第1步是抗菌肽的陽離子與膜上磷脂基團(tuán)的 陰離子之間相互作用，再與膜上碳?xì)浠衔锘プ鳎缓笫杷菪迦肽ど?，聚合形成孔道?Park(1997)發(fā)現(xiàn)蛙的1種抗菌肽Buforin具有完全不同的抗菌機(jī)理，它不裂解細(xì)胞膜，而 是穿過膜后與DNA、RNA結(jié)合，快速導(dǎo)致細(xì)胞死亡。此外，人們還發(fā)現(xiàn)抗菌肽可通過抑制細(xì)胞 呼吸、抑制細(xì)胞外膜蛋白的合成或抑制細(xì)胞壁的形成等機(jī)制來殺死細(xì)菌。目前對抗菌肽抗 真菌的機(jī)理研究較少，CaVallarin(1998)發(fā)現(xiàn)位于Cecropins衍生物N末端螺旋區(qū)域的11 個氨基酸順序與抗真菌活力有關(guān)；Lee等(1989)則觀察到真菌受抗菌肽作用后，細(xì)胞膜上 有空洞形成，推測其與抑殺細(xì)菌的機(jī)理類同。本發(fā)明的抗真菌脂肽的殺菌機(jī)理主要是使細(xì) 胞膜形成離子通道破壞膜結(jié)構(gòu)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。皮膚癬病皮膚癬屬于致病真菌感染的皮膚疾病，癥狀是皮膚非常痕瘁，出現(xiàn)紅疹 或小紅斑塊，越搔皮膚越發(fā)紅瘁，患處范圍會進(jìn)一步擴(kuò)大。癬患處經(jīng)常出現(xiàn)在出汗較多的地 方，如腳部、大腿內(nèi)側(cè)等。皮膚癬病和甲癬是常見的淺部真菌病，其中包括足癬、體癬、股 癬、手癬和花斑癬等；甲癬俗稱“灰指(趾)甲”，以上疾病都是由真菌感染引起的，主要是白 色念球菌、紅毛癬菌和須毛癬菌。在我們生活的環(huán)境中和我們的皮膚上都有包括真菌在內(nèi)的數(shù)百萬計的微生物的 存在，一旦天氣轉(zhuǎn)暖，有適于真菌生長的條件時，真菌便會乘虛而入，侵害我們的皮膚，引起 皮膚癬病。據(jù)統(tǒng)計，世界上約有1/4的人受到皮膚癬病的困擾。皮膚癬病還會在人與人之 間相互傳染，甚至可以在同一人的不同身體部位間傳染。目前對皮膚癬病的治療藥物是含 酮康唑或克霉唑的軟膏劑，屬于化學(xué)合成類藥物，長期使用導(dǎo)致致病真菌的耐藥性。
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1968年Arima等首次發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌(B. subtilis)能夠產(chǎn)生抗菌脂肽 surfactin以來，抗菌脂肽產(chǎn)生菌的篩選主要集中在枯草芽孢桿菌的不同菌株之間。近 年來，進(jìn)一步的研究表明，除枯草芽孢桿菌外，淀粉液化桿菌(B.amyloliquefaciens)、短 小芽孢桿菌(B. pumilus)、地衣芽孢桿菌(B. lichemformis)、蠟樣芽孢桿菌(B. cereus)、 Bacillusthruingiensis、類芽f包桿菌(Paenibacillus)禾口環(huán)#芽f包桿菌(B. circulan)等 也能產(chǎn)生抗菌脂肽。不同種的菌株可以產(chǎn)生不同或相同的抗菌脂肽，同一種細(xì)菌的不同菌 株也能產(chǎn)生幾種不同的抗菌脂肽，如枯草芽孢桿菌的某些菌株只能產(chǎn)生surfactin，而有些 菌株去口會邑同時產(chǎn)生 surfactin、fengycin 禾口 iturin 或 bacillomycin 禾口 plipastatin。而 且，即使同一種菌株產(chǎn)生的同一種抗菌脂肽也不是純的單一化合物，而是由幾個或許多結(jié) 構(gòu)類似的同系物組成。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)抗真菌脂肽的菌種，其分類屬枯草 芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BIl，保藏號為 CGMCCNo. 3412。本發(fā)明的另一個目的是公開了采用CGMCC No. 3412菌種制備抗真菌脂肽的方法。本發(fā)明還一個目的是公開了的采用CGMCC No. 3412菌種發(fā)酵生產(chǎn)的抗真菌脂肽在 抗真菌藥物方面的應(yīng)用。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開的技術(shù)內(nèi)容如下一種抗真菌脂肽微生物發(fā)酵菌株，其分類屬枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) BI1，保藏號為 CGMCC No. 3412。本發(fā)明提供的CGMCC No. 3412菌株是一株能生產(chǎn)抗真菌脂肽的新菌株，用該菌株 發(fā)酵糖質(zhì)原料生產(chǎn)抗真菌脂肽?？拐婢奈⑸锇l(fā)酵菌株，其分類屬枯草芽孢桿菌(BaCillUSSUbtiliS)BIl，保 藏號為CGMCC No. 3412，保藏日期2009年11月6日。保藏地點中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中心。該菌細(xì)胞為桿狀，革蘭染色均勻，且為陽性，產(chǎn)生芽孢。在肉湯培 養(yǎng)基平板上菌落呈圓形或不規(guī)則狀，表面褶皺，不透明，干燥，菌落呈淺黃色。在液體靜止培 養(yǎng)時有菌膜形成。本發(fā)明公開的采用CGMCC No. 3412菌株制備抗真菌脂肽的方法，其特征在于(1)采用的發(fā)酵菌株為CGMCC No. 3412，發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(g/L)糖質(zhì)原料5 50g，氮源 2 20g，檸檬酸鈉 1 3g，MgS04 7H200. 1 0. 2g，K2HP042 6g，KH2P043 9g， pH 7. 0 7. 2 ;(2)發(fā)酵培養(yǎng)按-10% (v/v)的接種量將培養(yǎng)好的種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基，培 養(yǎng)溫度30 40°C，發(fā)酵通氣量為5 13m7h，罐壓0. 02 0. 09MPa,攪拌速度100-150轉(zhuǎn) /分鐘，發(fā)酵時間30 60小時，發(fā)酵過程中通入無菌空氣，用氨水或液堿維持發(fā)酵液pH在 6. 5 7. 5，發(fā)酵液中抗真菌脂肽產(chǎn)量為1 2g/L。本發(fā)明所述的制備方法，其中糖質(zhì)原料包括葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、可溶性 淀粉糖化液、玉米粉糖化液或麩皮糖化液。本發(fā)明所述的制備方法，其中氮源原料包括硫酸銨、硝酸銨、硝酸鈉、蛋白胨、胰 蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母粉、牛肉膏或大豆粉。本發(fā)明進(jìn)一步公開了抗真菌脂肽微生物發(fā)酵菌株在發(fā)酵生產(chǎn)抗真菌脂肽用于制備治療皮膚癬病方面的應(yīng)用。本發(fā)明更加詳細(xì)的描述如下(1)微生物菌株的篩選與鑒定本發(fā)明中，建立了一個快速有效的篩選高產(chǎn)抗真菌脂肽菌株的方法，根據(jù)產(chǎn)抗真 菌脂肽菌株的細(xì)胞產(chǎn)物特點，設(shè)計以白色念球菌為指示菌的YEPD平板，挑選抑菌圈直徑大 的菌株，即為產(chǎn)抗真菌脂肽較好的菌株。本發(fā)明從青貯秸稈飼料中取樣，采用肉湯培養(yǎng)基30°C富集培養(yǎng)2-3次，再涂布于 白色念球菌為指示菌的YEPD選擇性平板，挑選抑菌圈直徑大的菌株，經(jīng)過對多個青貯秸稈 飼料樣品的大量菌株篩選工作，從分離出來的近數(shù)百株細(xì)菌中初步篩選出近30株具有抗 白色念球菌的菌株，最后復(fù)篩得到抑菌圈直徑達(dá)2cm以上，經(jīng)15次傳代后遺傳穩(wěn)定性好的 菌株BI1菌株。本發(fā)明篩選得到的能抑制白色念球菌的菌株BI1，經(jīng)16S rDNA基因序列測定與以 公布的枯草芽孢桿菌16S rDNA基因序列相似性達(dá)99.7%。BI1菌株能氧化葡萄糖產(chǎn)酸，需 氧，V-P反應(yīng)呈陽性，能還原硝酸鹽和水解淀粉(表1)。BI1菌株的生理生化特征均與布坎 南和吉本斯等(1984)編著的《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》第八版和東秀珠、蔡妙英(2001)編著的 《常見細(xì)菌鑒定手冊》中描述的枯草芽孢桿菌相同。認(rèn)為屬于芽孢桿菌科(Bacillaceae)， 芽孢桿菌屬(Bacillus)的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)BIl專利保存號CGMCC3412。 該菌細(xì)胞為桿狀，革蘭染色均勻，且為陽性，產(chǎn)生芽孢。在肉湯培養(yǎng)基平板上菌落呈圓形或 不規(guī)則狀，表面褶皺，不透明，干燥，菌落呈淺黃色。在液體靜止培養(yǎng)時有菌膜形成。表1芽孢桿菌BI1和標(biāo)準(zhǔn)枯草芽孢桿菌生理生化特征比較 注“ + ”代表陽性，“ _ ”代表陰性
本發(fā)明菌種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BIl的抑菌圖譜見表2。表2BI1的抑菌譜 芽孢桿菌BI1對絲狀真菌均有拮抗作用，而對細(xì)菌及非絲狀的酵母菌沒有作用。 表明BI1對絲狀真菌有專一性的抑制作用。(2)微生物菌株的培養(yǎng)與生產(chǎn)抗真菌脂肽的發(fā)酵肉湯培養(yǎng)基(g/L)蛋白胨10. 0，牛肉膏5. 0，NaCl 5. 0，pH7. 2 7. 4 ；固體培養(yǎng)基
7需加20. 0瓊脂。YEPD培養(yǎng)基(g/L)蛋白胨20. 0，酵母粉10. 0，葡萄糖20. 0 ；固體培養(yǎng)基需20. 0瓊脂。斜面和種子培養(yǎng)基的組成(g/L):葡萄糖1 3，胰蛋白胨5 10，酵母粉3 6， NaCl 6 12，去離子水配制，pH 7. 2 7. 5 ；固體培養(yǎng)基需加15g瓊脂粉。發(fā)酵培養(yǎng)基的組成(g/L)糖質(zhì)原料5 50g，氮源2 20g，檸檬酸鈉1 3g， MgS04 7H20 0. 1 0. 2g, K2HP042 6g，KH2P043 9g，pH 7. 0 7. 2。種子培養(yǎng)基和發(fā)酵 培養(yǎng)基的滅菌溫度為113 121°C，20min。將該菌株BI1自斜面接種于裝有50mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，30 40°C、 140r/min搖床培養(yǎng)12 16h。按(v/v)的接種量將培養(yǎng)好的種子接入發(fā)酵培養(yǎng) 基，培養(yǎng)溫度30 40°C，發(fā)酵通氣量為5 13m3/h，罐壓0. 02 0. 09MPa,攪拌速度100-150 轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵時間30 60小時。本發(fā)明用于發(fā)酵的糖質(zhì)原料可以是葡萄糖、蔗糖、果糖、可溶性淀粉、玉米粉、麩皮 糖化液。本發(fā)明用于發(fā)酵的氮源可以是硫酸銨、硝酸銨、硝酸鈉、蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋 白胨、酵母粉、牛肉膏、大豆粉。發(fā)酵過程通入無菌空氣，用氨水或液堿維持發(fā)酵液的PH在 6. 5 7. 5，發(fā)酵液中抗真菌脂肽產(chǎn)量為1 2g/L。本發(fā)明進(jìn)一步公開了采用CGMCC No. 3412菌種發(fā)酵生產(chǎn)的抗真菌脂肽在抗真菌方 面的應(yīng)用以及不同原料糖化液發(fā)酵產(chǎn)脂肽的情況。1.將正常的白色念珠菌和經(jīng)過BI1發(fā)酵提取的抗真菌脂肽處理的白色念珠菌，用 原子力顯微鏡掃描成像，見圖1和圖2。由圖1可以看出，未被處理的白色念珠菌表面非常 光滑。而被脂肽處理過的白色念珠菌(見圖2)，在原子力顯微鏡下觀察，表面有明顯的凹 陷及穿孔。有研究表明，脂肽是作用于菌體細(xì)胞膜，使細(xì)胞膜的通透性改變而發(fā)揮抗菌活性 的。因此推測，脂肽可能改變白色念珠菌細(xì)胞膜的通透性，使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外泄，導(dǎo)致菌體死 亡。 2.以裸皮小白鼠于皮膚表面接種白念球菌純培養(yǎng)稀釋液，連續(xù)接種三天，每天接 種一次。觀察裸皮小白鼠皮膚接種處表面出現(xiàn)紅斑或鱗屑狀損害，用含有本發(fā)明的真菌脂 肽涂抹劑與2%克霉唑軟膏作病例治療對比試驗，早中晚3次/天涂于患處皮膚。本發(fā)明的涂抹劑治愈率達(dá)到100%，平均治愈時間7天。2%克霉唑軟膏治愈率達(dá) 到90%，平均治愈時間10天。 結(jié)論采用2%克霉唑軟膏和含2%真菌脂肽涂抹劑治療皮膚癬病，平均治愈時間7天。 試驗結(jié)果統(tǒng)計本發(fā)明的涂抹劑治愈率達(dá)到100%，2%克霉唑軟膏治愈率達(dá)到90%。說明本發(fā)明的真菌脂肽涂抹劑可以殺滅致病真菌，治愈率達(dá)100%。3.將3g/L蔗糖、麥芽糖、果糖代替3g/L葡萄糖，接入培養(yǎng)好的枯草芽孢桿菌BI1 種子，發(fā)酵60h，提取發(fā)酵液中抗真菌脂肽。結(jié)果如表3。表3枯草芽孢桿菌以不同糖發(fā)酵產(chǎn)脂肽結(jié)果 4.將20g/L可溶性淀粉糖化液、玉米粉糖化液、麩皮糖化液代替3g/L葡萄糖，接入 培養(yǎng)好的枯草芽孢桿菌BI1種子，發(fā)酵60h，提取發(fā)酵液中抗真菌脂肽，結(jié)果如表4。表4枯草芽孢桿菌以不同原料糖化液發(fā)酵產(chǎn)脂肽結(jié)果 本發(fā)明公開的技術(shù)內(nèi)容與現(xiàn)有技術(shù)相比所具有的積極效果表現(xiàn)在以下方面1、發(fā)現(xiàn)了一株產(chǎn)抗真菌脂肽的新菌枯草芽孢桿菌BI1，其代謝產(chǎn)物抗真菌脂肽只 對絲狀真菌有抗性，對細(xì)菌和乳酸菌沒有抑菌活性，因此作為皮膚擦劑既可以殺滅致病真 菌，又不破壞皮膚表面存在的益生細(xì)菌。2、枯草芽孢桿菌BI1，其代謝產(chǎn)物抗真菌脂肽產(chǎn)量較高達(dá)到l_2g/L。3、枯草芽孢桿菌BI1，發(fā)酵產(chǎn)抗真菌脂肽所需碳源和氮源較廣泛，其中多數(shù)為農(nóng)產(chǎn) 品加工副產(chǎn)物，因此生產(chǎn)原料成本低。更適合大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。


圖1為正常的白色念珠菌表面形態(tài)；圖2經(jīng)脂肽處理過的白色念珠菌形態(tài)。
具體實施例方式為了簡單和清楚的目的，下文恰當(dāng)?shù)氖÷粤斯夹g(shù)的描述，以免那些不必要的 細(xì)節(jié)影響對本技術(shù)方案的描述。以下結(jié)合較佳實施例，對本發(fā)明做進(jìn)一步的描述。實施例1(1)微生物菌株的培養(yǎng)與產(chǎn)抗真菌脂肽的發(fā)酵[肉湯培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10.0，牛肉膏5. 0,NaCl 5. 0，pH7. 2 ；固體培養(yǎng)基需加 20. 0瓊脂。YEPD培養(yǎng)基(g/L)蛋白胨20. 0，酵母粉10. 0，葡萄糖20. 0 ；固體培養(yǎng)基需加20. 0 瓊脂。]此處為公知內(nèi)容可刪去。斜面和種子培養(yǎng)基的組成(g/L):葡萄糖3，胰蛋白胨5，酵母浸出粉6，NaC16，去 離子水配制，PH 7. 5 ；固體培養(yǎng)基需加15g瓊脂粉。
發(fā)酵培養(yǎng)基的組成(g/L)糖質(zhì)原料(葡萄糖)5g，氮源(硝酸銨)15g，檸檬酸鈉 lg，MgS04. 7H20，0. 5g，K2HP042 6g，KH2P045g, pH 7. 0 7. 2。種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的 滅菌溫度為115°C，20min。將該菌株BI1自斜面接菌于裝有50mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，40°C、140r/ min搖床培養(yǎng)16h。按2% (v/v)的接種量將培養(yǎng)好的種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度40°C， 發(fā)酵通氣量為8m3/h，罐壓0. 05MPa,攪拌速度100 150轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵時間60小時。酵過 程通入無菌空氣，用氨水或液堿維持發(fā)酵液的PH在7，發(fā)酵液中抗真菌脂肽產(chǎn)量為1. 5L。實施例2(1)采用的發(fā)酵菌株為CGMCC No. 3412，發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(g/L):葡萄糖10g，氮 源 20g，檸檬酸鈉 3g，MgS04 7H20，0. 2g，K2HP042g，KH2P043g，pH 7. 0 ；(2)發(fā)酵培養(yǎng)按2% (v/v)的接種量將培養(yǎng)好的種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度 30°C，發(fā)酵通氣量為5m3/h，罐壓0. 03MPa，攪拌速度80轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵時間30小時，發(fā)酵過 程中通入無菌空氣，用氨水維持發(fā)酵液pH在7. 5，種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的滅菌溫度為 12rC，20min。發(fā)酵液中抗真菌脂肽產(chǎn)量為1. 5g/L。實施例3(1)采用的發(fā)酵菌株為CGMCC No. 3412，發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(g/L):玉米粉35，氮源 蛋白胨 15，檬酸鈉 1，MgS04 7H20，0. 8，K2HP044，KH2P046，pH 1.2。(2)發(fā)酵培養(yǎng)按2% (v/v)的接種量將培養(yǎng)好的種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度 30°C，發(fā)酵通氣量為5m3/h，罐壓0. 05Pa,攪拌速度60轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵時間45h，發(fā)酵過程中 通入無菌空氣，用氨水維持發(fā)酵液pH在7. 2，發(fā)酵液中抗真菌脂肽產(chǎn)量為1. 4g/L。實施例4(1)采用的發(fā)酵菌株為CGMCC No. 3412，發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(g/L)糖質(zhì)原料40g， 氮源(牛肉膏)20g，檸檬酸鈉 3g，MgS04 7H20. lg, K2HP045g，KH2P047g，pH 7. 2 ；(2)發(fā)酵培養(yǎng)按8% (v/v)的接種量將培養(yǎng)好的種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度 35°C，發(fā)酵通氣量為8m3/h，罐壓0. 09MPa,攪拌速度100轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵時間50小時，發(fā)酵 過程中通入無菌空氣，用氨水或液堿維持發(fā)酵液pH在6. 5 7. 5，種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基 的滅菌溫度為125°C，20min，發(fā)酵液中抗真菌脂肽產(chǎn)量為2g/L。實施例5(1)采用的發(fā)酵菌株為CGMCC No. 3412，發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(g/L):麥芽糖35g，氮 源(胰蛋白胨)15g，檸檬酸鈉 3g，MgS04 7H20，0. 15g，K2HP044. 5g，KH2P046. 5g，pH 7. 2 ；(2)發(fā)酵培養(yǎng)按4. 5% (v/v)的接種量將培養(yǎng)好的種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫 度35°C，發(fā)酵通氣量為10m3/h，罐壓0. 06MPa,攪拌速度80轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵時間40小時，發(fā) 酵過程中通入無菌空氣，用氨水或液堿維持發(fā)酵液pH在6. 5，發(fā)酵液中抗真菌脂肽產(chǎn)量為 1. 2g/L。本發(fā)明在詳細(xì)說明的較佳實施例之后，熟悉該項技術(shù)人士可清楚地了解，在不脫 離上述申請專利范圍與精神下可進(jìn)行各種變化與修改，凡依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實 施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍。且本發(fā)明亦不 受限于說明書中所舉實例的實施方式。
權(quán)利要求
一種抗真菌脂肽微生物發(fā)酵菌株，其分類屬枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)BI1，保藏號為CGMCC No.3412。
2.一種采用權(quán)利要求1所述CGMCC No. 3412菌株制備抗真菌脂肽的方法，其特征在于(1)采用的發(fā)酵菌株為CGMCCNo. 3412，發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(g/L)糖質(zhì)原料5 50g， 氮源 2 20g，檸檬酸鈉 1 3g，MgSO4 · 7Η200· 1 0. 2g，K2HP042 6g，KH2P043 9g，pH 7· 0 7· 2 ；(2)發(fā)酵培養(yǎng)按-10%(ν/ν)的接種量將培養(yǎng)好的種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫 度30 40°C，發(fā)酵通氣量為5 13m7h，罐壓0. 02 0. 09MPa,攪拌速度100-150轉(zhuǎn)/分鐘， 發(fā)酵時間30 60小時，發(fā)酵過程中通入無菌空氣，用氨水或液堿維持發(fā)酵液pH在6. 5 7. 5，發(fā)酵液中抗真菌脂肽產(chǎn)量為1 2g/L。
3 權(quán)利要求2所述的制備方法，其中糖質(zhì)原料包括葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、可溶 性淀粉糖化液、玉米粉糖化液或麩皮糖化液。
4.權(quán)利要求2所述的制備方法，其中氮源原料包括硫酸銨、硝酸銨、硝酸鈉、蛋白胨、 胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母粉、牛肉膏或大豆粉。
5.采用權(quán)利要求2所述方法制備的抗真菌脂肽在制備治療皮膚癬病藥物方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生抗真菌脂肽的微生物及其抗真菌脂肽制備方法與應(yīng)用。其中微生物發(fā)酵生產(chǎn)抗真菌脂肽的菌種分類屬枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BI1，保藏號為CGMCC No.3412。本發(fā)明還涉及發(fā)酵抗真菌脂肽的制備方法，它是采用發(fā)酵菌株BI1，按1％-10％(v/v)的接種量將培養(yǎng)好的種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度30～40℃，發(fā)酵通氣量為5～13m3/h，罐壓0.02～0.09MPa，攪拌速度100-150轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵時間30～60小時，發(fā)酵過程中通入無菌空氣，用氨水或液堿維持發(fā)酵液pH在6.5～7.5，發(fā)酵液中抗真菌脂肽產(chǎn)量為1～2g/L。本發(fā)明還公開了抗真菌脂肽在制備治療皮膚癬病方面的應(yīng)用。
文檔編號C12P21/00GK101892176SQ20101012980
公開日2010年11月24日 申請日期2010年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月23日
發(fā)明者徐進(jìn), 王德培 申請人:天津科技大學(xué)