專利名稱：超高濃啤酒釀造菌種及篩選該菌種的培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到一種超高濃啤酒釀造用菌種及其篩選方法以及用到的培養(yǎng)基，優(yōu)選 的該菌種適用于超高濃啤酒為原麥汁濃度在20° P以上的啤酒釀造工藝。
背景技術(shù)：
超高濃釀制啤酒在我國，甚至在德國都是一個新課題。啤酒高濃度釀造(High GravityBrewing)是指在啤酒釀造過程中糖化得到較高的麥芽汁濃度(15° P_18° P)，在 糖化以后的工序中再加水稀釋到正常濃度(10-12° P)。對于18° P以上的麥汁稱為VHG 麥汁(Very HighGravity)，即超高濃度麥汁。采用高濃度釀造后稀釋技術(shù)，能大大提高糖 化，發(fā)酵設(shè)備的利用率，可以在投資和運行成本降低的情況下，增加產(chǎn)量20% 40%。國內(nèi) 一般的啤酒生產(chǎn)商的高濃釀造幾乎在13-16° P之間，很少有超過18° P的高濃釀造。當(dāng)前的超高濃釀造過程中，由于滲透壓的增加、酒精含量的提高以及營養(yǎng)平衡的 改變，都對啤酒酵母的性能產(chǎn)生較大的影響如細胞形態(tài)的變化、細胞活性降低，發(fā)酵性能 的降低。啤酒企業(yè)使用中最直接的感受是存在酵母伴隨使用代數(shù)增加，性能降低，凝聚性變 差，酵母自溶等問題。另外，高濃釀造啤酒在稀釋至與常濃釀造啤酒乙醇濃度相當(dāng)時酒體較 淡，因此風(fēng)味難以與常濃釀造啤酒相比，且往往比常濃釀造啤酒的泡持性要差。本發(fā)明提供 一種篩選出的超高濃啤酒釀造菌種有益的解決了上述問題，改善了釀造后的超高濃啤酒的 品質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種用于篩選超高濃啤酒發(fā)酵菌種的YPM培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基成分 包含酵母浸出物0.5% _2 %，蛋白胨-3%，麥芽糖0.5% -2%，2-脫氧-D-葡萄糖 0. 02% -0. 1%，瓊脂。上述YPM培養(yǎng)基，其中培養(yǎng)基成分優(yōu)選為酵母浸出物1%，蛋白胨2%，麥芽糖1%， 2_脫氧-D-葡萄糖0.05%。本發(fā)明還提供一種篩選超高濃啤酒菌種的方法，其包括菌種馴化、培養(yǎng)、連續(xù)分 離、二次篩選、評價步驟，其在培養(yǎng)步驟中使用上述YPM培養(yǎng)基。本發(fā)明還提供一種通過上述方法篩選出的超高濃啤酒發(fā)酵菌種，其抵制2-脫 氧-D-葡萄糖，可以同時利用葡萄糖和麥芽糖，麥芽三糖。該超高濃啤酒發(fā)酵菌種優(yōu)選為一 種釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，該釀酒酵母Y(2010年1月11日在中國微生物 菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCC No. 3566)除具有上述發(fā)酵超高 濃啤酒的性質(zhì)外，還具有還原雙乙酰能力強，耐酒精的性質(zhì)。本發(fā)明還提供一種通過接種上述菌種釀造超高濃啤酒的方法，其包括糖化、發(fā)酵、 稀釋步驟。正常酵母對糖的利用順序是先利用果糖和葡萄糖，等果糖和葡萄糖利用完后，再 利用麥芽糖和麥芽三糖，一般麥芽糖和麥芽三糖比葡萄糖要晚利用24-36小時。這一點在高濃釀造中表現(xiàn)的尤為明顯。因為高濃需要添加糖漿，而糖漿中大約有30%葡萄糖，所以在 高濃釀造時的表現(xiàn)就是降糖速度慢和發(fā)酵不完全。引起這種現(xiàn)象的原因是葡萄糖的抑制機 理，葡萄糖和果糖能抑制麥芽糖和麥芽三糖的代謝。這種機理通過抑制某些蛋白和酶的合 成導(dǎo)致其他的糖類代謝的途徑比如三羧酸循環(huán)等的失活。某些在葡萄糖抑制方面有缺陷的 酵母可以在葡萄糖的存在下利用麥芽糖和麥芽三糖，從而能夠加快糖的利用率。葡萄糖的 結(jié)構(gòu)類似物2-脫氧-D-葡萄糖能夠引起酵母的葡萄糖抑制，但不被酵母利用。因此，當(dāng)將 2-脫氧-D-葡萄糖加入到只含有麥芽糖的培養(yǎng)基中，酵母是不生長的。如果將抵制2-脫 氧-D-葡萄糖的酵母分離出來，用與高濃發(fā)酵，這種2-脫氧-D-葡萄糖抵制型酵母可以同 時利用葡萄糖和麥芽糖，麥芽三糖，從而加快發(fā)酵速度，使高濃發(fā)酵更完全。本發(fā)明利用物理誘變的手段處理酵母，篩選出抵制2-脫氧-D-葡萄糖的酵母，利 用梯度平板選育出還原雙乙酰能力強，耐酒精的；為了使酵母能夠適應(yīng)高濃的發(fā)酵環(huán)境，將 篩選的酵母在20° P超高濃麥汁中長期馴養(yǎng)，使其逐漸適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境，性能較出發(fā)菌株有 很大的改觀。本發(fā)明優(yōu)選篩選出具有上述性質(zhì)的釀酒酵母Y，保藏號為CGMCC No. 3566。本發(fā)明篩選步驟優(yōu)選為(1)馴化將菌株在高濃環(huán)境中連續(xù)馴化3-5次。(2)培養(yǎng)將馴化好的培養(yǎng)液涂布YPM:酵母浸出物0.5-2%，蛋白胨1_3%，麥芽 糖0. 5-2 %，2-脫氧-D-葡萄糖0. 02-1%,瓊脂(優(yōu)選為酵母浸出物1 %，蛋白胨2 %，麥芽 糖1%，2_脫氧-D-葡萄糖0. 05%，瓊脂)平板，30°C培養(yǎng)2-3天。(3)分離將長出的菌落再在上述平板中劃線培養(yǎng)分離一次，找出單菌落進行單 菌落分離。同時接種10ml液體試管進行活化，采用梯度稀釋法分離單菌落。(4)重復(fù)第三步，連續(xù)分離三代，每代分離酵母十支。(5)篩選在小試管中加入5ml高濃麥汁(20° P)，并在其上覆蓋2ml礦物油造成 微厭氧環(huán)境，將上述選出的菌種接種進行120°C發(fā)酵測定，通過每天測定失重看其發(fā)酵速度 快慢，根據(jù)其生長速度選出10株。(6)篩選進行發(fā)酵栓實驗，12°C發(fā)酵，根據(jù)發(fā)酵性能選出2-3株。(7)評價進行小試線試驗，選出適合高濃釀造的酵母。本發(fā)明通過接種篩選出的菌種釀造超高濃啤酒的步驟優(yōu)選為1)糖化，利用麥芽和大米等制成高濃原麥汁16° P，在煮沸鍋中添加糖漿，調(diào)麥汁 濃度至20° P;2)發(fā)酵，麥汁冷卻后對其充氧量并接種菌種，接種量控制在1. 5 1. 8*107個/ml， 發(fā)酵溫度為14°C，升壓糖度控制在6 7° P；3)稀釋，高濃稀釋工藝稀釋比在80 100%。利用本發(fā)明培養(yǎng)基篩選出的菌種釀造的啤酒，稀釋后的正常濃度的啤酒的理化指 標符合國家標準的要求。啤酒的口感和常規(guī)濃度發(fā)酵的啤酒相比，口感更淡爽，口味更干 凈。
具體實施例方式實施例1超高濃度酵母的選育。隨機選取啤酒廠三株啤酒酵母菌株作為出發(fā)酵母菌株經(jīng)過以上方法進行誘變，這三株酵母菌株分別為YJ，F(xiàn)，36，經(jīng)過以下選育步驟1出發(fā)菌株的活化將菌種按3%的添加量接種麥芽汁中，25°C搖床培養(yǎng)24h，至酵母對數(shù)生長期，此 時菌體活力最好，適合誘變。2細胞懸液制備在3500r/min轉(zhuǎn)速下離心活化好的菌液lOmin，收集菌體，用滅菌生理鹽水洗滌一 次，旋渦混合器振蕩lOmin，血球計數(shù)板計數(shù)菌體個數(shù)，再用生理鹽水調(diào)整細胞濃度使之成 為106個/ml的菌懸液。3EMS誘變育種懸浮細胞于lml無菌磷酸緩沖液中(pH=7.0)，W30ul EMS原液，振蕩分散細胞， 置于30°C搖床培養(yǎng)30min ；離心，懸浮細胞于無菌水中，用5% Na2S203洗滌兩次，再懸浮細胞 于lml無菌水中，稀釋到10-3，涂布于完全培養(yǎng)基平板，28°C培養(yǎng)2-3天，對活菌進行計數(shù)。 計算致死率和存活率。5菌種篩選誘變后的菌液涂布初篩培養(yǎng)平板，30°C培養(yǎng)3-4天，至菌落可見；挑取生長出的菌 落轉(zhuǎn)移復(fù)篩培養(yǎng)平板(2-脫氧-D-葡萄糖平板)培養(yǎng)3-4天，在培養(yǎng)基上生長的菌株即為 目的菌株。6發(fā)酵栓實驗對新獲得的誘變菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)挑取上述篩選出的菌種一環(huán)；接入10mL麥汁 中，30°C培養(yǎng)24小時；再將活化好的試管中菌液全部接入裝有300mL20° P麥汁的三角瓶 中，用發(fā)酵栓密封，12°C發(fā)酵9天，每天稱重，記錄每日失重量，當(dāng)單日失重量在0. 2克以內(nèi) 表明發(fā)酵結(jié)束。待發(fā)酵結(jié)束后，檢測發(fā)酵指標。7實驗測定結(jié)果 從以上指標看出，經(jīng)過本發(fā)明培養(yǎng)基使用以上誘變，馴化，選育步驟，選育出菌株 均比出發(fā)菌株的發(fā)酵性能指標都有很大的改善。8將優(yōu)選的Y選育酵母，接種到100L 20° P的麥汁中進行高濃發(fā)酵，原濃20°P主發(fā)酵溫度14°C接種酵母數(shù)1. 76*107個/ml發(fā)酵高峰期酵母數(shù)10*107個/ml發(fā)酵度66%將其稀釋為8° P、10° P、12° P三個濃度，各項指標測定描述如下風(fēng)味指標 口感品評
總的評價高濃釀造的酒體清亮，酒體柔和；口味清爽，有酒花香和麥芽香，還有令人愉快的 酯香味。實施例2超高濃啤酒的發(fā)酵使用以上菌種1，2，A，B通過以下發(fā)酵步驟發(fā)酵1)糖化，利用60 70%麥芽和30 40%大米等制成原麥汁濃度為16° P，在煮 沸鍋中添加糖漿，調(diào)麥汁濃度為20° P;2)發(fā)酵，麥汁冷卻后充氧量為10 12ppm，接種菌種，接種量控制在1.5 1.8*107 個/ml，發(fā)酵溫度為14°C，升壓糖度控制在6 7° P；3)稀釋，高濃稀釋工藝稀釋比在80 100%。發(fā)酵性能指標 實施例3啤酒廠實施某20萬噸啤酒廠(全部生產(chǎn)12° P啤酒)，如采用超高濃發(fā)酵技術(shù)，原麥汁濃 度為20° P，則可以在不增加設(shè)備投資的情況下，與傳統(tǒng)12° P發(fā)酵工藝相比，產(chǎn)能增加 (20-12)712X100 = 75%，大大提高了設(shè)備利用率，降低了生產(chǎn)成本。
權(quán)利要求
一種用于篩選超高濃啤酒發(fā)酵菌種的YPM培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基成分包含酵母浸出物0.5％-2％，蛋白胨1％-3％，麥芽糖0.5％-2％，2-脫氧-D-葡萄糖0.02％-0.1％，瓊脂。
2.權(quán)利要求1所述的YPM培養(yǎng)基，其中培養(yǎng)基成分優(yōu)選為酵母浸出物1%，蛋白胨2%， 麥芽糖1 %，2-脫氧-D-葡萄糖0.05%。
3.一種篩選超高濃啤酒菌種的方法，其包括菌種馴化、培養(yǎng)、連續(xù)分離、二次篩選、評價 步驟，其特征在于在培養(yǎng)步驟中使用權(quán)利要求1或2所述的YPM培養(yǎng)基。
4.權(quán)利要求3所述方法，其各步驟優(yōu)選為(1)馴化將菌株在高濃麥汁中連續(xù)馴化3-5次；(2)培養(yǎng)將馴化好的菌種培養(yǎng)液涂布YPM培養(yǎng)基平板，30°C培養(yǎng)2-3天；(3)分離將長出的菌落在上述平板中劃線培養(yǎng)分離一次，找出單菌落分離，并接種入 液體試管活化，梯度稀釋法分離單菌落；(4)重復(fù)步驟(3)，連續(xù)分離三代；(5)篩選1在小試管中加入5ml 20° P高濃麥汁，并在其上覆蓋2ml礦物油造成微厭 氧環(huán)境，將上述選出的菌種接種進行12°C發(fā)酵測定，通過每天測定失重看其發(fā)酵速度快慢， 根據(jù)其生長速度選出10株；(6)篩選2發(fā)酵栓實驗，12°C發(fā)酵，根據(jù)發(fā)酵性能選出2-3株；(7)評價小試線試驗，選出適合高濃釀造的酵母。
5.一種通過權(quán)利要求3或4的方法篩選出的超高濃啤酒發(fā)酵菌種，其抵制2-脫 氧-D-葡萄糖，可以同時利用葡萄糖和麥芽糖，麥芽三糖。
6.權(quán)利要求5所述超高濃啤酒發(fā)酵菌種為一種啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，保藏號為 CGMCCNo. 3566。
7.—種通過接種權(quán)利要求5或6所述菌種釀造超高濃啤酒的方法，其包括糖化、發(fā)酵、 稀釋步驟。
8.權(quán)利要求7所述釀造超高濃啤酒的方法，其各步驟優(yōu)選為1)糖化，利用麥芽和大米等制成高濃原麥汁16°P，在煮沸鍋中添加糖漿，調(diào)麥汁濃度 至 20° P;2)發(fā)酵，麥汁冷卻后對其充氧量并接種菌種，接種量控制在1.5 1.8*107個/ml，發(fā) 酵溫度為14°C，升壓糖度控制在6 7° P；3)稀釋，高濃稀釋工藝稀釋比在80 100%。
全文摘要
本發(fā)明提供一種適合超高濃啤酒釀造菌種的培養(yǎng)基，利用該培養(yǎng)基篩選菌種方法及篩選獲得的菌種，并提供利用該超高濃啤酒菌種釀造啤酒的方法。篩選菌種的培養(yǎng)基包括2-脫氧-D-葡萄糖成分。篩選方法包括馴化、培養(yǎng)、連續(xù)分離、篩選、評價步驟，篩選出抵制2-脫氧-D-葡萄糖并且還原雙乙酰能力強，耐酒精，適合20°P超高濃麥汁的菌種。使用本發(fā)明提供的菌種及方法生產(chǎn)的高濃啤酒大大提高設(shè)備利用率，生產(chǎn)成本降低，和常規(guī)濃度發(fā)酵的啤酒相比，口感更淡爽，口味更干凈。
文檔編號C12C12/00GK101851589SQ20101010351
公開日2010年10月6日 申請日期2010年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月1日
發(fā)明者宋緒磊, 張彥青, 李紅, 王異靜, 王德良 申請人:中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院