專利名稱：一種具有抗真菌活性的火把梨類甜蛋白基因PpTLP及應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學以及基因工程領(lǐng)域，特別是一種具有抗真菌活性的火把梨 類甜蛋白基因PpTLP及應用。
背景技術(shù)：
在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，植物病害是一個非常棘手的問題，尤其是真菌病害，由其引起的病 害占植物總病害的80%以上。各類病害中以真菌病害的癥狀類型最多，可以出現(xiàn)在植物的 各個部位。傳統(tǒng)的病害防治主要是依靠化學農(nóng)藥和培育抗性品種，雖然也獲得了一定成效， 但是存在嚴重的弊端。常規(guī)育種方法周期長、費時費力，化學農(nóng)藥的高殘留、易對環(huán)境造成 污染、危害人畜健康等缺點限制了傳統(tǒng)病害防治方法的大規(guī)模應用。 隨著重組DNA技術(shù)的創(chuàng)立和發(fā)展，通過轉(zhuǎn)基因培育抗真菌植物新品種可望從根本 上解決真菌病害問題。首先，抗真菌病害基因的獲得及其抗性機理的研究非常重要。近年 來，對植物_病原菌相互識別機制、信號傳導途徑，防衛(wèi)反應的調(diào)控以及抗病和致病基因本 質(zhì)的研究不斷深入，一系列專化抗性和廣譜抗性的抗真菌基因陸續(xù)被克隆，通過轉(zhuǎn)基因改 良植物對真菌病害抗性已取得初步成效。 病程相關(guān)蛋白(pathogenesis-related protein, PR)是普遍存在于高等植物中 的一類防御蛋白，病原體或其他外界因子的剌激能誘導其表達，在植物抵御病原體、響應 外界壓力以適應不良環(huán)境過程中發(fā)揮重要作用。根據(jù)序列相似性、血清或免疫特性以及 酶功能將PRs分為17個家族，其中第5家族PR-5是一組很獨特的蛋白，具有13 -1， 3葡 聚糖酶活性、蛋白酶活性、抗真菌、抑制a淀粉酶以及抑制反轉(zhuǎn)錄酶等多種生物學活性 (Van Loon IX， VanStrien EA. The families of pathogenesis-related proteins, their activities, andcomparative analysis of PR_1 type proteins. Physiological and Molecular PlantPayhology，1999， 22 :5585-5597.)。 類甜蛋白(thaumatin-like proteins, TLPs)屬于PR_5家族，其氨基酸序列與非 洲植物西非竹竽(Tha咖atococcus danielli)的甜蛋白(tha咖atin)高度同源，故稱為類 甜蛋白。兩種蛋白的同源性很高，但其功能完全不一樣，甜蛋白具有甜味無抗真菌活性，而 類甜蛋白無甜味具有抗真菌活性。目前發(fā)現(xiàn)雙子葉植物葡萄、番茄等，單子葉植物大麥、小 麥、燕麥等以及部分真菌都能產(chǎn)生TLPs。 TLPs的分子量范圍在21-26kDa之間，并且不同植 物的TLPs在功能上具有一定的差異性。 從芭蕉中提取的分子量為20kDa的TLP，在瓊脂糖擴散實驗中能抑制尖孢鐮刀 菌和褐斑病菌菌絲體的生長。該TLP對小鼠腫瘤細胞增殖無抑制作用，而對HIV-1的 反轉(zhuǎn)錄酶有輕微的抑制作用(Ho VS， Wong JH， Ng TB. A thaumatin-like antifungal protein fromthe emperor banana. Peptides, 2007， 28 :760-766.)。 膠孢炭疽菌會g弓l起 胡椒的炭疽病，該真菌附著孢的生長范圍以及菌絲的侵染程度在成熟胡椒果實中明顯低 于未成熟果實，實驗表明P印TLP在成熟胡椒的防御中起著重要的作用(Kim YS， Park JY， Kim KS， etal. A thaumatin_like gene in nonclimacteric pepper fruits used as
3molecular markerin probing disease resistance,ripening,and sugar accumulation. Plant MolecularBiology，2002，49 :125-135.)。長穗決明的類甜蛋白CdTLP，分子量為 23kDa，不具有類P-l，3葡聚糖酶活性，但對假絲酵母屬微生物具有抑制作用(Vitali A， Pacini L， BordiE， et al. Purification and characterization of an antifungal thaumatin-lik印rotein from Cassia didymobotrya cell culture. Plant Physiology and Biochemistry, 2006， 44 :604-610.)。竹笑TLP與已知TLPs在序列上的同源性較低，分 子量也較低，但該蛋白能抑制尖孢鐮刀菌、褐斑病菌以及灰霉菌的菌絲體生長(Wang HX，Ng TB.Dendrocin， a distinctive antifungal protein from bamboo shoots.Biochemical and BiophysicalResearch Communications,2003，307 :750-755.)。 從感染鐮刀菌的小麥中克隆得到tlp，并通過基因槍法獲得高效表達tlp 的小麥，tip轉(zhuǎn)基因小麥表現(xiàn)出延緩病原體擴散(Anand A， Zhou T， Trick HN， et al. Greenhouse andfield testing of transgenic wheat plants stably expressing genes forthaumatin—like protein, chitinase and glucanase against Fusarium graminearum. Journal of Experimental Botany. 2003,54 :1101-1111.)。 將水禾舀tip轉(zhuǎn) 入大麥中表達，轉(zhuǎn)基因植株的抗真菌能力有所提高[Tobias DJ，Manoharan M， Pritsch C， et al. Co_bombardment， integration and expression of rice chitinase and thaumatin-likeprotein genes in barley (Hordeum vulgare cv.Conlon). Plant Cell R印orts，2007，26 :631-639.]。通過轉(zhuǎn)基因手段獲得轉(zhuǎn)入大麥tlp-1的小麥植株，溫室和 大田的實驗研究結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因小麥對于赤霉病的抗性有所增加(Mackintosh CA， Lewis J， Radmer LE， et al. Overexpression of defense response genes in transgenic wheat enhancesresistance to Fusarium head blight. Plant Cell Reports,2007，26 : 479-488.)。 本發(fā)明的TLP基因來自云南火把梨。火把梨是云南本地的沙梨品種，具有穩(wěn)定遺 傳的紅色果皮表型。火把梨對土壤適應性強，抗黑星病、腐爛病，對梨木虱有較強的抗性，并 且抗晚霜，耐低溫能力也很強。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是從云南火把梨(Pyrus pyrifolia Nakai)中克隆獲得有抗真菌活 性的類甜蛋白的全長基因PpTLP，以及它的應用。 本發(fā)明分離克隆云南火把梨中攜帶的一個抗真菌相關(guān)基因的完整cDNA片段，利 用農(nóng)桿菌介導使目的基因轉(zhuǎn)入受體植物中并過量表達，通過進一步試驗驗證該基因是否 具有抗真菌的活性，為后期利用該基因改良煙草以及其他植物抵御真菌病害的能力奠定基 礎(chǔ)。發(fā)明人將這個基因命名為PpTLP。 TLPs通過改變真菌細胞膜的滲透壓來破壞其細胞膜的完整性，具有抑制真菌生 長、抑制孢子裂解以及減少孢子數(shù)目或降低孢子發(fā)育能力的作用。TLPs同時也具有葡聚糖 酶活性，即結(jié)合并切斷多聚葡聚糖(polymeric glucans)的能力。葡聚糖酶活性使TLPs能 結(jié)合并降解真菌細胞壁的主要組分_ P -1， 3葡聚糖，為TLPs進一步破壞真菌細胞膜奠定了
^石出。 本發(fā)明涉及分離包含PpTLP的DNA片段并鑒定其功能，具有該基因片段的植物在一定程度上具有抵抗特定真菌浸染的表型。其中所述DNA片段如序列表SEQ ID所示，或者 基本相當于SEQ ID所示的DNA序列，或者其功能相當于SEQ ID所示序列的部分片段。對該 基因進行序列分析，表明PpTLP全長cDNA為973bp，具有744bp的開放閱讀框(ORF) 、44bp 的5'非翻譯區(qū)和185bp的3'非翻譯區(qū)，編碼含有248個氨基酸的蛋白質(zhì)。PpTLP編碼蛋白 具有甜蛋白超家族的保守結(jié)構(gòu)域，與來自蘋果(Malusx domestica)以及其他物種的TLPs 和PR5蛋白高度相似，表明其屬于火把梨中的TLP。超量表達序列表SEQ ID所示序列可以 增強煙草和其他植物對特定真菌的抗性。 上述基因可以應用于提高植物的真菌抗性，具體操作如下 (1)將上述基因與適宜的植物超表達載體如pCAMBIA1301、pK2GW7、pCAMBIA2300s 等連接，構(gòu)建植物超表達載體。 (2)將上述構(gòu)建的重組載體通過農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)入目標植物中。
(3)以重組載體T-DNA上具有的抗性標記篩選轉(zhuǎn)化子，并通過聚合酶鏈式反應 (Polymerase Chain Reaction, PCR)獲得真正的轉(zhuǎn)基因植株，接種特定真菌或是分析轉(zhuǎn)基 因植物蛋白對真菌生長的抑制活性，最后篩選出對真菌抗性明顯增強的轉(zhuǎn)基因植株。
本發(fā)明為增強植物對真菌病害的抗性提供了一種新的方法，通過基因工程手段培 育抗病植物能克服傳統(tǒng)育種的不足，不僅育種周期短，而且操作簡單，容易獲得高抗材料。 本發(fā)明來自火把梨的PpTLP基因能增強植物對真菌的抗性，將該基因?qū)霟煵?、康乃馨、?桔梗等植物中，可以產(chǎn)生具有真菌抗性的種質(zhì)和品種。利用基因工程技術(shù)防治病害具有明 顯的優(yōu)勢和不可取代的重要性。它可以為作物、花卉等大規(guī)模生產(chǎn)提供方便，大量減少抗病 劑的使用，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)節(jié)約成本且提高管理水平，因此本發(fā)明具有廣闊的市場應用前景。
本發(fā)明通過功能基因組學相關(guān)技術(shù)證實PpTLP基因具有提高植物抗真菌的功能。 將本發(fā)明抗真菌PpTLP基因構(gòu)建到植物表達載體上并轉(zhuǎn)入煙草中過量表達，轉(zhuǎn)基因煙草具 有很強的體外抗真菌活性。表達PpTLP的轉(zhuǎn)基因煙草蛋白對核盤菌、煙草疫霉、擬莖點霉屬 真菌等多種真菌具有明顯的抑制作用。


圖1是部分轉(zhuǎn)基因煙草基因組DNA的PCR檢測結(jié)果。Marker :DL2000 DNA Marker(大連寶生物)，由2， OOObp、 1， 000bp、750bp、500bp、250bp以及l(fā)OObp六條DNA片段 組成。正對照質(zhì)粒pMD-18T-pPTLP為模板的PCR反應；WT :非轉(zhuǎn)基因煙草總DNA為模板進 行的PCR ;空白對照PCR體系中不包含DNA的反應。 圖2是部分陽性轉(zhuǎn)基因煙草中PpTLP轉(zhuǎn)錄水平的表達分析結(jié)果。Marker :DL2000 DNAMarker(大連寶生物)；6、7、8、9、10、11、12U3分別為不同的陽性轉(zhuǎn)基因煙草單株；WT : 非轉(zhuǎn)基因煙草總RNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進行的PCR ;空白對照PCR體系中不包含DNA的 反應。正對照質(zhì)粒pMD-18T-pPTLP為模板的PCR反應； 圖3是PpTLP轉(zhuǎn)基因煙草體外抗真菌活性分析結(jié)果。A、B、C、D、E圖示中的真菌分 別是煙草疫霉、核盤菌、交鏈孢菌、派倫霉屬真菌、擬莖點霉屬真菌，WT為野生型煙草的總蛋 白，空白對照為無蛋白對照(用于提取蛋白的緩沖液)。
具體實施方式
實施例 l)PpTLP全長基因克隆以及序列分析 用液氮將火把梨的紅色果皮研磨成粉末以后，轉(zhuǎn)入離心管中，采用異硫氰酸胍 法提取總RNA。采用逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV(天根)以總RNA為模板合成cDNA第一鏈，反應體 系和操作過程為取5ii g Total RNA，依次加入50ng oligo (dT) 15、2 y L d證(2.5mM each)、 ddH20 (RNase-free)至反應體積為13. 5 y L ;混勻后，70°C加熱變性5min后迅速 在冰上冷卻5min，然后依次加入4ii L 5XFirst-stand buffer、0. 5 ii L RNasin(200U)、 1 ii LM-MLV (200U) 、 1 y L DTT (0. 1M)，混勻并短時離心，42 °C溫浴1. 5h，取出后95 °C加熱 5min，終止反應。cDNA第一鏈合成后置于-2(TC保存?zhèn)溆谩?以合成的第一鏈cDNA為模板，擴增目的基因PpTLP，所用引物序列分別為5' _GGA TCCGGCAATTAAGACATATTCAATGTCG-3'和5' -GAATTCCTGCATATATAATCCCATTTCGTGC-3 ，。采用 大連寶生物的高保真DNA聚合酶ex taq擴增出目的基因。PCR反應條件94。C 3min ;94°C 30s，60。C 30s，72。C lmin， 32個循環(huán)；72。C 10min。反應體系(20 ii L)為1 ii L cDNA、2yL 10XLong taq Buffer、0. 4 ii L d證(10mM each) 0. 1 ii L正向(20 ii M) 、0. 1 ii L反向弓|物 (20iiM)、0.2iiL ex Taq DNA polymerase (2U/ii L) 16. 2 ii L ddH20。 PCR結(jié)束后，取5 ii L用 于瓊脂糖凝膠電泳，檢測擴增產(chǎn)物的特異性以及大小。 由于PCR產(chǎn)物只有一條DNA帶，故直接對PCR產(chǎn)物進行TA克隆，使用的試劑盒為 pMD18-T vector kit (大連寶生物)，反應體系和操作過程為取1. 5 y L PCR產(chǎn)物，依次加 入liiL pMD18-T vector (50ng/ii L)禾P 2. 5 ii L 2XLigation solution 1，混勻置于16。C 過夜反應。采用熱激轉(zhuǎn)化法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a中。用含有X-Gal、IPTG、氨芐 青霉素(ampicillin， Amp)的LB固體培養(yǎng)基篩選陽性克隆。挑選若干個白色菌落，搖菌后 用擴增PpTLP的特異引物鑒定出多克隆位點插入PpTLP的克隆。將鑒定的克隆進行測序， 最終獲得的PpTLP全長cDNA為791bp，通過NCBI 0RF finder (http: 〃www. ncbi. nlm. nih. gov/gorf/gorf. html)分析發(fā)現(xiàn)其包含一個744bp的開放讀碼框(見序列表)。PpTLP編 碼一個含248個氨基酸的蛋白質(zhì)，PpTLP的分子量為26KDa，等電點4. 45。就整個蛋白質(zhì)的 氨基酸組成而言，疏水氨基酸丙氨酸(A)的含量最高，約為11%。所有中性氨基酸含量為 81 % ，酸性氨基酸含量為13 % ，堿性氨基酸含量為6 % 。半胱氨酸(C)的含量較高，有16個， 占6%。借助生物信息學軟件SignalP 3.0分析PpTLP編碼的蛋白序列，檢測它們是否具有 N端信號肽。結(jié)果表明該蛋白的氨基酸殘基1-27是一段信號肽，說明PpTLP是一種分泌蛋 白。 2)植物表達載體構(gòu)建 采用堿裂解法提取插入PpTLP的大腸桿菌質(zhì)粒pMD-18T-PpTLP以及植物表達 載體pCAMBIA2300S的質(zhì)粒，取1 y L用于瓊脂糖凝膠電泳以檢測所提取質(zhì)粒的完整性和 濃度高低。用EcoRI (Fermentas)和BamHI (Fermentas)分別對質(zhì)粒pMD_18T_PpTLP和 pCAMBIA2300S進行雙酶切(100 y L體系)，反應體系和操作過程為取10 P LpMD-18T-PpTLP 或pCAMBIA2300S質(zhì)粒、依次加入10ii L 10XTango buffer、2yL EcoRI、2yL BamHI、76iiL dc^0，混勻后短時離心，置于37t:過夜反應。將所有酶切產(chǎn)物點于瓊脂糖凝膠中進行電泳， 然后對PpTLP片段和pCAMBIA2300S大片段分別進行膠回收，整個過程使用UNIQ-10柱式 DNA膠回收試劑盒(上海生工)。具體操作流程為切下含有目的DNA條帶的瓊脂糖凝膠塊置于1. 5mL離心管中，按400 ii L/100mg瓊脂糖凝膠的比例加入Binding Buffer II，置 于6(TC水浴10min，使膠徹底融化；將融化的凝膠溶液轉(zhuǎn)移至2mL收集管內(nèi)的UNIQ-10柱 中，室溫放置2min后離心lmin (6， 000g/min);取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的廢液，再將 UNIQ-10柱放入收集管中，加入500 ii L WashSolution,室溫離心lmin (8， 000g/min)，再重 復此步驟一次；取下UNIQ-IO柱，倒掉收集管中的廢液，再將UNIQ-10柱放入收集管中，室溫 離心2min (12， OOOg/min);取下UNIQ-10柱放入新的1. 5mL離心管中，在膜中央加入預熱的 20iiL Elution Buffer，室溫放置2min，室溫離心lmin (12， OOOg/min)，離心管中收集液體 即為回收的DNA片段。取1 L回收產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測回收片段的大小以及濃 度，置于-2(TC保存?zhèn)溆谩?利用T4 DNA Ligase (大連寶生物)，將回收的PpTLP DNA片段和pCAMBIA2300S 載體片段連接起來，反應體系(20 L)和操作過程為取10 L PpTLPDNA片段依次加入 2ii LpCAMBIA2300S載體DNA、2ii L 10XT4 DNA Ligase Buffer、lyL T4 DNA Ligase、 5 ii LddH20，混勻后短時離心，置于16t:金屬浴過夜反應。接著采用熱激轉(zhuǎn)化法將連接產(chǎn)物 轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a中，用含有50mg/L卡那霉素(kanamycin， Km)的固體培養(yǎng)基篩選陽性 克隆。挑選單菌落搖菌，以菌液為模板用擴增PpTLP的特異引物進行PCR，挑選出PpTLP與 pCAMBIA2300S成功連接的克隆，所檢測的菌株若為陽性，加入甘油并置于-S(TC保存?zhèn)溆谩?
用堿裂解法提取并純化上述大腸桿菌中的pCAMBIA2300S-PpTLP質(zhì)粒。并制備農(nóng) 桿菌LBA4404菌株的感受態(tài)細胞，操作過程為將實驗室保存的LBA4404菌株在LB固體培 養(yǎng)基(含利福平20mg/L)上劃線，2『C培養(yǎng)至長出單菌落后，挑取一個單克隆于含20mg/L 利福平的2mL LB液體培養(yǎng)基，28t:振蕩培養(yǎng)至混濁；取5mL菌液轉(zhuǎn)接于含20mg/L利福平 的lOOmL LB液體培養(yǎng)基中，28。C振蕩培養(yǎng)至0D6。。為0. 5 ;4。C離心5min(5， OOOg/min)收集 菌體，棄上清，加入10mL預冷的0. 1M CaCl2，輕輕充分懸浮菌體，冰浴20min ;接著4。C離心 5min (5， 000g/min)收集菌體，棄上清，加入4mL預冷的含15%甘油的0. 1M CaC^溶液，充 分懸浮后分裝于1. 5mL離心管中，每管200ii L，液氮速凍后置于-S(TC保存?zhèn)溆谩?
采用液氮凍融法將上述構(gòu)建的植物表達載體pCAMBIA2300S-PpTLP轉(zhuǎn)入所制備的 農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細胞中。操作步驟為取2 ii g pCAMBIA2300S-PpTLP質(zhì)粒加入含有 200iiL感受態(tài)細胞的離心管中，輕輕混勻后冰浴5min，接著轉(zhuǎn)入液氮中冷凍lmin，然后迅 速置于37t:水浴5min，之后立即冰浴2min，加入800 y L LB液體培養(yǎng)基，28。C振蕩培養(yǎng)4h。 將活化后的農(nóng)桿菌涂于含有50mg/L Km的LB固體培養(yǎng)基上，28t:靜止培養(yǎng)。挑選單菌落搖 菌，用擴增PpTLP的特異引物進行PCR，檢測pCAMBIA2300S-PpTLP是否轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。對于 陽性克隆，加入甘油后置于-8(TC保存?zhèn)溆谩?
3)農(nóng)桿菌介導的植物遺傳轉(zhuǎn)化以及轉(zhuǎn)基因植物篩選 本實驗的轉(zhuǎn)基因受體是煙草(Nicotiana tabacum L.)。將煙草種子用75%的酒 精浸泡30s，用無菌水洗滌后用0. 1 %的HgCl2浸泡8min，然后再用無菌水洗滌若干次，播種 于1/2MS培養(yǎng)基上，2『C暗培養(yǎng)5-8d，發(fā)芽后轉(zhuǎn)至光照培養(yǎng)箱(25°C， 16h/d光照)，以后每 月用MS培養(yǎng)基繼代一次。 從-8(TC冰箱中取出保存的含有pCAMBIA2300S-PpTLP質(zhì)粒的農(nóng)桿菌LBA4404菌 種，接種于5mL含有50mg/L Km和20mg/L利福平的LB液體培養(yǎng)基中，28。C培養(yǎng)至渾濁。吸 取lmL渾濁的菌液至含有50mg/L Km的LB固體培養(yǎng)基上，28。C培養(yǎng)48h。將LB固體培養(yǎng)基上的農(nóng)桿菌刮下適量接種于MGL液體培養(yǎng)基中，附加一定量的乙酰丁香酮，28t:振蕩培養(yǎng) 2-3h以活化農(nóng)桿菌。 取煙草無菌苗葉子切成lcm2左右的葉盤，完全浸泡于上述含有活化農(nóng)桿菌的MGL 液體培養(yǎng)基中，浸染時間為15min。用無菌濾紙吸干葉片表面的菌液，將葉盤置于共培養(yǎng)基 上進行室溫培養(yǎng)。煙草轉(zhuǎn)化的共培養(yǎng)基為MS+0. 02mg/L 6-BA+2mg/L NAA+30g/L sucrose, 培養(yǎng)時間為2d。 將共培養(yǎng)后的葉盤轉(zhuǎn)到加有抗生素的MS篩選培養(yǎng)基中分化成苗，同時篩選轉(zhuǎn) 基因植株。煙草篩選培養(yǎng)節(jié)為MS+0. 5mg/L 6-BA+0. lmg/L NAA+30g/L sucrose+50mg/L Km+200mg/L頭孢霉素(cefotaxime sodium salt，Cef);篩選培養(yǎng)時將培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移至光照培 養(yǎng)箱培養(yǎng)(25°C ， 16h/d光照，8h/d黑暗)。出芽后用含有50mg/L Km和200mg/L Cef的MS 培養(yǎng)繼代培養(yǎng)。因煙草愈傷分化率較高，故需要對再生植株進行進一步篩選。將煙草再生 苗移至含有50mg/L Km和200mg/L Cef的MS培養(yǎng)基上使其生根，最后選用生根較好的再生 苗做進一步的分子水平檢測。 采用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因煙草植株葉片的基因組DNA，將提取的基因組DNA取1 y L 通過瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性和濃度。以轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA為模板用擴增 PpTLP的特異弓I物進行PCR。 PCR結(jié)束后，取8 L產(chǎn)物用于瓊脂糖凝膠電泳以檢測陽性轉(zhuǎn)基 因植株。部分煙草轉(zhuǎn)基因植株的擴增結(jié)果如圖l所示。PpTLP轉(zhuǎn)基因煙草共篩選到20株陽 性轉(zhuǎn)基因植株，分別編號為1 20。 4)PpTLP表達分析以及轉(zhuǎn)基因植株抗真菌活性分析 取陽性轉(zhuǎn)基因單株以及非轉(zhuǎn)基因煙草(野生型)的嫩葉提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄生成 cDNA第一鏈，并以此為模板用擴增PpTLP的特異引物進行PCR，根據(jù)PCR結(jié)果分析各轉(zhuǎn)基因 單株中PpTLP轉(zhuǎn)錄水平的表達?？俁NA提取以及RT-PCR的方法與步驟與1)中相同。PCR 結(jié)束后，取5iiL用于瓊脂糖凝膠電泳，部分單株的檢測結(jié)果如圖2所示。共檢測到10株轉(zhuǎn) 基因單株中PpTLP在轉(zhuǎn)錄水平有表達，這些單株的編號為5、8、9、10、12、14、16、18、19、21。
將實驗室保存的幾種真菌接種于PDA固體培養(yǎng)基(200g/L馬鈴薯，15g/L瓊脂， 20g/L葡萄糖)上，28t:倒置培養(yǎng)，待菌落生長至直徑約為3cm時添加蛋白，分析轉(zhuǎn)基因 植株體外抗真菌活性。供試真菌共有5種煙草疫霉(Phytophthora parasitica var. nicotianae)、核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)、擬蓬點霉屬(Phomopsis sp.)真菌、派 j侖霉屬(Peyroneuaea)真菌禾口交f連 包菌(Alternaria sp.)。 為了防止其它雜菌污染所提取的蛋白，整個植物蛋白提取過程均是無菌操作。首 先取lg轉(zhuǎn)基因煙草單株(5、8、9、10、12、14、16、18、19、21)或野生型葉片放入研缽中，加入 lmL蛋白提取液(1M NaCl，O. 1M乙酸鈉，1 % PVP，pH5)，充分研磨。轉(zhuǎn)入1. 5mL離心管中，混 勻后4t:靜置過夜。4t:離心30min(12，000g/min)，取上清于新的1. 5mL離心管中，并取適 量用紫外分光光度儀測定總蛋白濃度。將轉(zhuǎn)基因和野生型植株的總蛋白濃度調(diào)整至6mg/ mL，然后分別取20 i！ L滴于各真菌培養(yǎng)基的濾紙上。在每個真菌的平板上除了添加不同轉(zhuǎn) 基因煙草植株的總蛋白，同時平行添加野生型煙草的總蛋白和空白對照(提取蛋白所用的 溶液)。2『C培養(yǎng)幾天后觀察各處理抑菌真菌生長的情況，并據(jù)此評價PpTLP轉(zhuǎn)基因煙草的 體外抗真菌活性。結(jié)果如圖3所示，PpTLP轉(zhuǎn)基因煙草蛋白對煙草疫霉、核盤菌、擬莖點霉 屬真菌、派倫霉屬真菌和交鏈孢菌均有明顯的抑制作用。
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序列表(SEQ ID)〈110〉昆明理工大學〈120〉 一種具有抗真菌活性的火把梨類甜蛋白基因PpTLP及應用〈130〉〈160>2〈170>PatentIn version 3. 5〈210>1〈211〉973〈212>DNA〈213>Pyrus pyrifolia Nakai〈220〉〈221>mRNA〈222>(1). . (973)<220>〈221>5，證〈222〉 (1) . (44)〈220〉〈221>CDS〈222>(45). . (788)〈220〉〈221〉3，證〈222〉 (789) . (973)〈220〉〈221〉polyA一site〈222〉 (948).. (973)〈400>1gcaggtagtt aattagcagc aaacaggcaa tt肌gacata ttca atg tcg:atg:atg56Met Ser Met Met1aag aac caa gta get tec etcetc ggc etc acc ttg gcc ateetcttc104Lys Asn Gin Val Ala Ser LeuLeu Gly Leu Thr Leu Ala lieLeuPhe5 101520ttc tea ggt gca cac gca gcg3朋ate act ttc 3C3朋c aactgccct152Phe Ser Gly Ala His Ala AlaLys lie Thr Phe Thr Asn AsnCysPro253035tac act gtc tgg cca gga acctta acc ggt gac c朋朋a cctCElgtta200Tyr Thr Val Trp Pro Gly ThrLeu Thr Gly Asp Gin Lys ProGinLeu4045 50tea etc act ggc ttc gaa etages tec a朋get age c朋teagtgg￡lC248
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245
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Tyr Ala Tyr Asp Asp Lys Asn Ser Thr Phe Thr Cys Ser Gly Gly Pro 225 230 235 240 Asp Tyr Val lie Thr Phe Cys Pro
24權(quán)利要求
一種具有抗真菌活性的火把梨類甜蛋白基因PpTLP，其特征在于它具有序列表中SEQID所述的堿基序列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抗真菌活性的火把梨類甜蛋白基因PpTLP，其特征在于 PpTLP基因的編碼區(qū)是序列表SEQ ID中第45-788位所示的核苷酸序列或是編碼蛋白質(zhì)與 SEQ ID編碼蛋白質(zhì)相同的其它DNA序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的具有抗真菌活性的火把梨類甜蛋白基因PpTLP，其特征 在于PpTLP全長cDNA為973bp，具有744bp的開放閱讀框、44bp的5'非翻譯區(qū)和185bp的 3'非翻譯區(qū)，編碼含有248個氨基酸的蛋白質(zhì)。
4. 權(quán)利要求1或2所述的具有抗真菌活性的火把梨類甜蛋白基因PpTLP在提高煙草對 煙草疫霉多種真菌抗性中的應用。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的具有抗真菌活性的火把梨類甜蛋白基因PpTLP的應用，其特 征在于提高植物的真菌抗性的具體操作如下(1) 將上述基因與適宜的植物超表達載體pCAMBIA1301、 pK2GW7、 pCAMBIA2300s連接， 構(gòu)建植物超表達載體；(2) 將上述構(gòu)建的重組載體通過農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)入目標植物中；(3) 以重組載體T-DNA上具有的抗性標記篩選轉(zhuǎn)化子，并通過聚合酶鏈式反應PCR獲得 真正的轉(zhuǎn)基因植株，接種特定真菌或是分析轉(zhuǎn)基因植物蛋白對真菌生長的抑制活性，最后 篩選出對真菌抗性明顯增強的轉(zhuǎn)基因植株。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有抗真菌活性的火把梨類甜蛋白基因PpTLP及應用。PpTLP基因具有SEQID所述的堿基序列，編碼類甜蛋白。本發(fā)明通過功能基因組學相關(guān)技術(shù)證實PpTLP基因具有提高植物抗真菌的功能。將本發(fā)明抗真菌PpTLP基因構(gòu)建到植物表達載體上并轉(zhuǎn)入煙草中過量表達，轉(zhuǎn)基因煙草具有很強的體外抗真菌活性。表達PpTLP的轉(zhuǎn)基因煙草蛋白對核盤菌、煙草疫霉、擬莖點霉屬真菌等多種真菌具有明顯的抑制作用。
文檔編號C12N15/84GK101736024SQ20101010034
公開日2010年6月16日 申請日期2010年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月22日
發(fā)明者劉迪秋, 方松剛, 李文嫻, 王光勇, 王繼磊, 田榮歡, 葛鋒 申請人:昆明理工大學