專利名稱：固定化酶水解粗奶酪和超濾膜分離方法連續(xù)生產(chǎn)酪蛋白磷酸肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及食品產(chǎn)品加工工藝。

背景技術(shù)：
酪蛋白磷酸肽(Casein Phosphopeptides，CPP)是以牛奶酪蛋白為原料，經(jīng)過單一或復(fù)合蛋白酶的水解，再對水解產(chǎn)物分離純化，進(jìn)而干燥后得到的含有磷酸絲氨酸簇的天然生理活性肽。
CPP的核心部位為-SerP-SerP-SerP-Glu-Glu-，具有很強(qiáng)的促鈣以及其它礦物元素吸收的活性，可以與鈣、鐵、鋅等二價和某些三價礦物離子結(jié)合，不僅可以作為鈣的載體，也可以作為鐵、錳、鋅、硒的載體，所以，CPP已被公認(rèn)為應(yīng)用較廣泛的功能性食品添加劑，它能促進(jìn)嬰幼兒與青少年的健康成長和提高對中老年人的保健作用。
谷坤睿等人在陜西科技大學(xué)學(xué)報，No.4，VOI.2l，Aug，2003介紹了固定化胰蛋白酶及其用于制備酪蛋白磷酸肽(CPP)的實驗研究。實驗以殼聚糖作為固定化胰蛋白酶的載體，方法是酪蛋白→酪蛋白水解液→過濾→固定化酶水解→分離→濃縮→干燥→CPP產(chǎn)品。這種方法的特點是酶的固定化后可多次使用，節(jié)約了成本；酶不進(jìn)入終產(chǎn)品，提升了產(chǎn)品的風(fēng)味。其缺點是以殼聚糖為載體，載體價格昂貴，費用高，不易工業(yè)化生產(chǎn)。2006-12-8，天津大學(xué)對開展的“高效促鈣吸收因子酪蛋白磷酸肽的連續(xù)制備工藝開發(fā)”項目進(jìn)行了《科技成果鑒定》，并申請了《酶解與膜濾集成連續(xù)制取酪蛋白活性多肽的工藝》發(fā)明專利，申請?zhí)枮?00310107554.3。本方法針對制備CPP所采用的間歇酶解工藝中普遍存在的反應(yīng)轉(zhuǎn)化率及目標(biāo)多肽產(chǎn)率低、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定、酶耗量大、工藝成本高等共性問題，提出酶膜耦合一步法連續(xù)生產(chǎn)新方法，設(shè)計并安裝了一套由20L酶解罐與不同截留分子量的超濾膜件組合而成的多級酶膜耦合反應(yīng)器擴(kuò)試系統(tǒng)；確定了間歇與連續(xù)酶解制備CPP的工藝路線，并優(yōu)化了操作參數(shù)；完成了20L罐間歇水解和40L/hr長時間連續(xù)、穩(wěn)定、高效制取CPP的擴(kuò)試開發(fā)，酶耗量比傳統(tǒng)方法降低3倍，反應(yīng)器生產(chǎn)能力提高1倍；并對離子交換樹脂純化工藝進(jìn)行了設(shè)計與優(yōu)化；各級產(chǎn)品經(jīng)權(quán)威機(jī)構(gòu)檢測證明體外持鈣能力效果明顯，各項指標(biāo)均達(dá)到國家保健(功能)食品通用標(biāo)準(zhǔn)。但是，該方法不足之處是水解過程于一個反應(yīng)釜中，易造成底物多次水解產(chǎn)生小肽，為后續(xù)分離帶來困難，并影響終產(chǎn)品風(fēng)味和品質(zhì)。


發(fā)明內(nèi)容
“曲拉”是藏區(qū)牧民將牛奶自然發(fā)酵后，經(jīng)加熱沉淀出蛋白質(zhì)，然后自然干燥后制成牦牛粗奶酪，俗稱“曲拉”。其主要成分為蛋白質(zhì)，它是藏區(qū)游牧民的重要食物來源。
本發(fā)明以藏區(qū)豐富的低成本“曲拉”——粗奶酪為原料，結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)點，其目的是提供一種固定化酶水解粗奶酪和超濾膜分離方法連續(xù)生產(chǎn)酪蛋白磷酸肽。該方法以固定化酶水解粗奶酪，并對水解液進(jìn)行有效分離提取以獲得高純度的CPP產(chǎn)品，提升產(chǎn)品風(fēng)味，提高生產(chǎn)工藝的連續(xù)性，降低生產(chǎn)能耗和產(chǎn)品成本。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn) 一種固定化酶水解粗奶酪和超濾膜分離方法連續(xù)生產(chǎn)酪蛋白磷酸肽，其步驟分為 a.胰蛋白酶的提取方法 i.將新鮮牛胰臟剔出脂肪、結(jié)締組織后，浸入硫酸銨溶液，攪拌，壓濾，得到浸提濾液； ii.在浸提濾液中加入固體硫酸銨，攪拌、靜置、去沉淀，過濾后得到上清液； iii.上清液調(diào)pH值至3.0以下，保持溶液中的硫酸銨濃度在3.0～3.5mol/L，攪拌均勻后靜置沉淀，棄上清，沉淀物為胰蛋白酶原粗品； iv.胰蛋白酶原粗品加入乙醇，CaCl2，溶解、靜置活化，再加入乙醇，攪拌、靜置、沉淀，過濾后即得胰蛋白酶。
本工藝可得到水解“曲拉”——粗奶酪所需要的胰蛋白酶原料。
b.制備胰蛋白酶固定化反應(yīng)柱 弱堿性苯乙稀陰離子樹脂加入2.5％戊二醛，在10℃～20℃下交聯(lián)反應(yīng)10～12小時，再加入1～4％胰蛋白酶，在10℃～15℃下固定化20小時，裝入直徑∶高度＝1∶10的不銹鋼反應(yīng)柱； c.水解粗奶酪 粗奶酪用10～15倍水在55～60℃溶脹1小時，以1mol/L的NaOH調(diào)整pH值不超過8.0，溶解后，經(jīng)過濾、分離脫脂后的蛋白質(zhì)溶液在40℃～60℃下以10L/min的速度逆向通過固定化酶反應(yīng)柱，保持與固定化酶循環(huán)接觸時間為3小時～5小時；然后將水解液經(jīng)熱交換柱冷卻至室溫，壓濾除去沉淀，經(jīng)由硅藻土過濾機(jī)澄清后得到CPP水解液； d.超濾膜分離提純酪蛋白磷酸肽(CPP) CPP水解液經(jīng)過超濾膜過濾設(shè)備兩次分離，其工藝參數(shù)第一次分離膜，截流分子量上限≤50000，膜起始壓力2Bar，終止壓力10Bar，循環(huán)流量200L/hr，平均循環(huán)時間2～5小時；第二次超濾膜，分離膜截流分子量下限≤1000，膜起始壓力4Bar，終止壓力15Bar，循環(huán)流量150L/hr，平均循環(huán)時間3～6小時； e.將CPP的超濾液進(jìn)行柱層析 分離后的水解液用20～40目的顆?；钚蕴恐M(jìn)行層析吸咐，流速為20L/hr，壓力為1.2Bar～5Bar，然后將水解液經(jīng)低溫真空濃縮，真空度40mmHg～60mmHg、溫度30℃～40℃，至固形物含量30％～40％，再噴霧干燥，壓力6Bar，溫度60℃～70℃，即得到酪蛋白磷酸肽(CPP)產(chǎn)品。
本發(fā)明的優(yōu)點和產(chǎn)生的有益效果是 1、與現(xiàn)有技術(shù)比較，本發(fā)明蛋白質(zhì)液體經(jīng)逆向注入固定化酶反應(yīng)柱進(jìn)行連續(xù)循環(huán)水解，水解過程可由2～3個串聯(lián)的反應(yīng)柱完成，每次底物水解完成進(jìn)入下步工序后，酶反應(yīng)柱可再進(jìn)行下次的水解過程，固定化酶重復(fù)水解次數(shù)一般為8～10次。利用胰蛋白酶固定化反應(yīng)柱，提高酶的利用率，節(jié)約酶用量比一次酶解法少5～8陪，并降低了酶的固定化成本。反應(yīng)過程不需要加熱使酶失活，酶及酶自身分解帶來的附產(chǎn)物也不進(jìn)入終產(chǎn)品。另外，采用直接提取蛋白酶進(jìn)行固定化，利用處理后以弱堿性苯乙稀陰離子樹脂作為載體，替代價格昂貴的殼聚糖，降低了生產(chǎn)成本，易于工業(yè)化生產(chǎn)。
2、提高工藝生產(chǎn)的連續(xù)性生產(chǎn)過程中除水解工藝產(chǎn)生沉淀利用壓濾和硅藻土過濾澄清后，后續(xù)工藝在得到終產(chǎn)品前全部為液相流動操作，易于控制。反應(yīng)過程中不需要添加底物、酶和其他物質(zhì)，每個過程均為連續(xù)操作，每步流量控制以分配各工藝步驟設(shè)備量和流速來實現(xiàn)，以保證整個工藝中產(chǎn)物流量的均衡。
3、產(chǎn)品純度高，分離效率高，除鹽效果好。本方法以弱堿性苯乙稀陰離子樹脂(樹脂型號包括301～400)作為載體制備固定化胰蛋白酶反應(yīng)柱，以粗奶酪(或“曲拉”)為原料，溶解后的蛋白質(zhì)經(jīng)固定化酶連續(xù)水解后，經(jīng)由兩次超濾膜截留，一次活性炭層析分離，能有效除去產(chǎn)品中的非磷酸肽、鹽、水份和大分子多肽，同時使用活性炭層析吸附去除小肽，產(chǎn)品經(jīng)真空濃縮、噴霧干燥，風(fēng)味得到極大提升，產(chǎn)品中酪蛋白磷酸肽含量可達(dá)到45％，具有促進(jìn)機(jī)體鈣、鐵、鋅吸收和儲留的作用，產(chǎn)品質(zhì)量高于國內(nèi)同類產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)。
4、本發(fā)明工藝設(shè)計合理、操作性強(qiáng)，生產(chǎn)過程短，中間產(chǎn)物濃度高，生產(chǎn)能耗低主要分離純化過程均采用常溫處理，干燥過程蒸發(fā)量少，極大降低了生產(chǎn)中的能耗，節(jié)約了成本。



圖1為本發(fā)明工藝流程圖。

具體實施例方式 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明再作進(jìn)一步的說明 實施例1 一種固定化酶水解粗奶酪和超濾膜分離方法連續(xù)生產(chǎn)酪蛋白磷酸肽，其步驟分為 a.胰蛋白酶的提取取新鮮牛胰臟10kg，人工剔出脂肪、結(jié)締組織，經(jīng)絞肉機(jī)絞碎立即浸入裝有1L 0℃～4℃0.1mol/L硫酸銨溶液的50L夾層反應(yīng)罐中，經(jīng)攪拌后成為漿液，加入漿液2倍體積的0.1mol/L硫酸銨，在0℃～4℃的夾層反應(yīng)罐提取20小時，每隔半小時緩緩攪拌。經(jīng)空氣壓濾機(jī)壓濾，收集濾液，殘渣再以1倍漿液體積的0.1mol/L硫酸銨重復(fù)浸提一次，合并兩次濾液，棄去殘渣。
50L夾層反應(yīng)罐中的濾液在0℃～4℃下加入0.2kg/L固體硫酸銨至濃度1.5mol/L，攪拌后靜置8小時，過濾、去沉淀。在濾液中繼續(xù)加入0.27kg/L固體硫酸銨至濃度3.5mol/L，攪拌后靜置12小時，壓濾后得到上清液，棄去殘渣。
上清液以2mol/L硫酸0.1L調(diào)pH值至3.0以下，并保持溶液中的硫酸銨濃度在3.5mol/L，攪拌均勻后靜置沉淀10小時。壓濾棄去上清后得沉淀。此沉淀即為胰蛋白酶原粗品。
將上述所得胰蛋白酶原粗品(濕重)加入3倍(重量比)的25％乙醇，同時加入胰蛋白酶粗品原料量2％的CaCl2，使其溶解并調(diào)溶液pH值為5-6之間，0℃～4℃靜置活化12小時，然后加入乙醇使其濃度達(dá)到70％以上，充分?jǐn)嚢瑁?℃～4℃靜置充分沉淀3小時，過濾后即得胰蛋白酶。收率在3.0％左右。
b.胰蛋白酶固定化反應(yīng)柱制備 在5L夾層反應(yīng)罐中裝入經(jīng)活化處理后的弱堿性苯乙稀陰離子樹脂1kg，攪拌下緩緩滴加1/5樹脂重的2.5％戊二醛，在10℃～20℃下充分?jǐn)嚢杞宦?lián)反應(yīng)10小時，過濾，水洗去除戊二醛。在2L容器中將0.04kg胰蛋白酶(濕重)加入1L pH6.5～7.0的0.2mol/L醋酸緩沖液中配成約1.5％胰蛋白酶溶液，與反應(yīng)后的樹脂在10～15℃下固定化20小時，然后裝入直徑與高度比為1∶10的反應(yīng)柱中，每柱裝入固定化酶量為0.2kg，并用pH6.5～7.0的0.2mol/L醋酸緩沖液洗去未固定化的酶，測定酶活力，備用。
游離酶活力定義在反應(yīng)條件下，每分鐘酶水解酪氨酸后的濾液光吸收增值與1μmol酪氨酸在275nm處吸光度相當(dāng)時的酶量為一個胰蛋白酶活力單位(U/mg)。
固定化酶的活力定義在相同反應(yīng)條件下，固定化酶的活力與游離酶活力的比值為固定化酶的相對活力。
相對活力(％)＝(固定化酶的活力/游離酶活力)×100％。
胰蛋白酶活力測定方法以酪蛋白為底物測定。詳見《中華人民共和國藥典》2005年版二部第625頁“胰酶”一欄。
本工藝在于得到水解過程所需要的固定化酶。固定化酶活力約為游離酶活力的75％左右。
c.粗奶酪水解生成CPP 在10L夾層反應(yīng)罐中將0.5kg粗奶酪用10倍、55～60℃的水溶脹1小時，攪拌下緩緩加入1mol/L的氫氧化鈉溶液50mL左右，調(diào)整pH8.0。待蛋白溶解后，經(jīng)過濾器過濾、離心機(jī)分離脫脂。得到的蛋白質(zhì)溶液在40℃～60℃下由壓力泵以0.01L/min的速度壓入固定化酶反應(yīng)柱，保持液體與固定化酶循環(huán)接觸時間為3小時，蛋白質(zhì)水解可由2至3個固定化酶反應(yīng)柱串聯(lián)實現(xiàn)。然后將水解液經(jīng)熱交換柱冷卻至室溫，壓濾除去沉淀，經(jīng)由硅藻土過濾機(jī)澄清后得到CPP水解液4L左右。
d.CPP分離提純 CPP水解液經(jīng)過超濾膜過濾設(shè)備兩次分離，其工藝參數(shù)第一次分離膜截流分子量≤50000，膜起始壓力2Bar，終止壓力10Bar，循環(huán)流量200L/hr，平均循環(huán)時間2小時以上。第二次超濾膜分離膜截流分子量≤1000，膜起始壓力4Bar，終止壓力15Bar，循環(huán)流量1.50L/hr，平均循環(huán)時間3小時以上。
分離后的水解液3.5L左右用裝有原料量0.5％(重量比)的20～40目的顆?；钚蕴恐M(jìn)行層析吸咐，然后將水解液經(jīng)低溫真空濃縮和干燥，即得到CPP產(chǎn)品。
e.產(chǎn)品分析檢測結(jié)果 上述生產(chǎn)方法等到的CPP收率在35％～45％之間，產(chǎn)品中分子量在2000～6000范圍的多肽占45％，產(chǎn)品中CPP含量30％～35％，產(chǎn)品苦味較重。生產(chǎn)成本為120～150元/kg。
產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)符合以下列檢測方法確定的產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)。
酪蛋白磷酸肽(CPP)產(chǎn)品主要檢測方法 ①蛋白質(zhì)的測定用微量凱氏定氮法，見GB5424-85。
②脂肪的測定用索氏抽提法，見GB 5009.6-85。
③水分、灰分的測定用重量法，見GB5424-85。
④磷酸肽的測定用高壓液相色譜和柱色譜測定CPP中的特征吸收峰，以CPP吸收峰面積與總吸收峰面積相比，并用鉬藍(lán)比色法測定磷含量，再與CPP中平均磷含量的2.82相比較。(《功能性食品活性成分測定》，化學(xué)工業(yè)出版社，2005年5月第一版第201頁)。
⑤衛(wèi)生指標(biāo)及微生物指標(biāo)測定以國家食品及添加劑衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)為準(zhǔn)。主要標(biāo)準(zhǔn)有GB/T 5009.11-2003《食品中總砷及無機(jī)砷的測定》、GB/T5009.12-2003《食品中鉛的測定方法》、GB/T 4789.2-2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》、GB/T 5009.46-2003《乳與乳制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》、GB 2760-2007《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》。
⑥酪蛋白磷酸肽(CPP)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)見表1-3 表1感官指標(biāo)
表2理化指標(biāo) 表3衛(wèi)生及微生物指標(biāo) 產(chǎn)品用內(nèi)襯牛皮紙袋包裝，裝量為1Kg、5Kg和10Kg三種。貯存于干燥的環(huán)境中，注意防潮。
實施例2 a.胰蛋白酶的提取 取新鮮牛胰臟100kg，人工剔出脂肪、結(jié)締組織，經(jīng)絞肉機(jī)絞碎立即浸入裝有10L 0℃～4℃的0.1mol/L硫酸銨溶液的500L夾層反應(yīng)罐中，經(jīng)攪拌后成為漿液，加入漿液3倍體積的0.1mol/L硫酸銨在0℃～4℃的夾層反應(yīng)罐提取30小時，每隔半小時緩緩攪拌。經(jīng)空氣壓濾機(jī)壓濾，收集濾液，殘渣再以1倍漿液體積的0.1mol/L硫酸銨重復(fù)浸提一次，合并兩次濾液，棄去殘渣。
500L夾層反應(yīng)罐中的濾液在0℃～4℃下加入0.2kg/L固體硫酸銨至濃度1.5mol/L，攪拌后靜置10小時，過濾、去沉淀。在濾液中繼續(xù)加入0.27kg/L固體硫酸銨至濃度3.5mol/L，攪拌后靜置14小時，壓濾后得到上清液，棄去殘渣。
上清液以2mol/L硫酸1.0L/100L調(diào)pH值至3.0以下，并保持溶液中的硫酸銨濃度在3.5mol/L，攪拌均勻后靜置沉淀12小時。壓濾棄去上清后得沉淀。此沉淀即為胰蛋白酶原粗品。
將上述所得胰蛋白酶原粗品(濕重)加入5倍(重量比)的25％乙醇，同時加入胰蛋白酶粗品原料量2％的CaCl2，使其溶解并調(diào)溶液pH值為5-6之間，0℃～4℃靜置活化14小時，然后加入乙醇使其濃度達(dá)到70％以上，充分?jǐn)嚢瑁?℃～4℃靜置充分沉淀4小時，過濾后即得胰蛋白酶。收率在5.0％左右。
b.胰蛋白酶固定化反應(yīng)柱制備 在500L夾層反應(yīng)罐中裝入經(jīng)活化處理后的弱堿性苯乙稀陰離子樹脂100kg，攪拌下緩緩滴加1/5樹脂重的2.5％戊二醛，在10℃～20℃下充分?jǐn)嚢杞宦?lián)反應(yīng)12小時，在200L貯罐中將4kg胰蛋白酶(濕重)加入100L pH6.5～7.0的0.2mol/L醋酸緩沖液中配成約1.5％胰蛋白酶溶液，與反應(yīng)后的樹脂在夾層反應(yīng)罐中10～15℃下固定化20小時，然后裝入直徑與高度比為1∶10的不銹鋼反應(yīng)柱，每柱裝入固定化酶量為20kg，并用pH6.5～7.0的0.2mol/L醋酸緩沖液洗去未固定化的酶，測定酶活力，備用。
酶活力定義和測定方法同實施例1。
本工藝在于得到水解過程所需要的固定化酶。固定化酶活力約為游離酶活力的80％以上。
c.粗奶酪水解生成CPP 在1000L夾層反應(yīng)罐中將50kg粗奶酪用15倍55～60℃的水溶脹1小時，攪拌下緩緩加入1mol/L的氫氧化鈉溶液5L/100L，調(diào)整pH8.0。待蛋白溶解后，經(jīng)雙聯(lián)過濾器過濾、碟片離心機(jī)分離脫脂。得到的蛋白質(zhì)溶液在40℃～60℃下由壓力泵以10L/min的速度壓入固定化酶反應(yīng)柱，保持液體與固定化酶循環(huán)接觸時間為5小時，水解時可根據(jù)水解效果由3個固定化酶反應(yīng)柱串聯(lián)實現(xiàn)蛋白質(zhì)水解。然后將水解液經(jīng)熱交換柱冷卻至室溫，壓濾除去沉淀，經(jīng)由硅藻土過濾機(jī)澄清后得到CPP水解液700L左右。
d.CPP分離提純 CPP水解液經(jīng)過超濾膜過濾設(shè)備兩次分離，其工藝參數(shù)第一次分離膜截流分子量≤500C0，膜起始壓力2Bar，終止壓力10Bar，循環(huán)流量200L/hr，平均循環(huán)時間2小時以上。第二次超濾膜分離膜截流分子量≤1000，膜起始壓力4Bar，終止壓力15Bar，循環(huán)流量150L/hr，平均循環(huán)時間4小時以上。
分離后的水解液650L左右用裝有原料量6％(重量比)的20～40目的顆粒活性炭柱進(jìn)行層析吸咐，然后將水解液經(jīng)低溫真空濃縮和噴霧干燥，即得到CPP產(chǎn)品。
e.產(chǎn)品分析檢測結(jié)果 產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)和檢測方法同實施例1。
本實施例得到的CPP收率在25％～35％之間，產(chǎn)品中分子量在3000～6000范圍的多肽占45％，產(chǎn)品中CPP含量35％～45％，產(chǎn)品有較淡的苦味。生產(chǎn)成本為180～200元/kg。
本發(fā)明工藝條件的變化對生產(chǎn)過程和產(chǎn)品的影響 1、提取的胰蛋白酶在固定化反應(yīng)中溫度由15℃～20℃提升到25℃以上，固定化酶活力則大大降低，一般情況下只有游離酶活力的50％～55％，水解過程將變得不完全，最終影響到產(chǎn)品收率降到25％以下。
2、溶解的蛋白質(zhì)溶液要以逆向方式流經(jīng)固定化酶反應(yīng)柱，若正向流動，由于在反應(yīng)中產(chǎn)生細(xì)小沉淀會造成反應(yīng)柱堵塞，使工藝過程時間加長，嚴(yán)重時會使工藝不可進(jìn)行。
3、活性炭層析吸附是為了去除分子量小于1000的游離小肽，這些小肽是產(chǎn)品中存在苦味的主要成分，在實施過程中若不采用活性炭層析進(jìn)行吸咐除去苦味肽，雖可降低部分生產(chǎn)成本，但產(chǎn)品中苦味加重，產(chǎn)品風(fēng)味降低。
4、超濾膜截留分子量大小與產(chǎn)品質(zhì)量和收率有直接關(guān)系，膜截留分子量下限為1000，上限為50000。截留分子量大小可分為1000～10000、1000～20000、1000～30000、1000～40000、1000～50000五種范圍，其產(chǎn)品收率從25％到45％依次升高，產(chǎn)品中的CPP含量也從45％到30％依次降低。膜的通透量影響工藝時間和生產(chǎn)成本，生產(chǎn)過程中需保持膜的通透量達(dá)到出廠值的80％以上，否則需對膜進(jìn)行CIP清洗或更換新的超濾膜。
5、產(chǎn)品收率和生產(chǎn)成本與原料粗奶酪(“曲拉”)質(zhì)量有較大關(guān)系，一般要求原料中蛋白質(zhì)含量在70％以上，若蛋白質(zhì)含量低于65％，則CPP收率可低于25％以下。
權(quán)利要求
1.一種固定化酶水解粗奶酪和超濾膜分離方法連續(xù)生產(chǎn)酪蛋白磷酸肽，其步驟分為
a.胰蛋白酶的提取方法
i.將新鮮牛胰臟剔出脂肪、結(jié)締組織后，浸入硫酸銨溶液，攪拌，壓濾，得到浸提濾液；
ii.在浸提濾液中加入固體硫酸銨，攪拌、靜置、去沉淀，過濾后得到上清液；
iii.上清液調(diào)pH值至3.0以下，保持溶液中的硫酸銨濃度在3.0～3.5mol/L，攪拌均勻后靜置沉淀，棄上清，沉淀物為胰蛋白酶原粗品；
iv.胰蛋白酶原粗品加入乙醇，CaCl2，溶解、靜置活化，再加入乙醇，攪拌、靜置、沉淀，過濾后即得胰蛋白酶；
b.制備胰蛋白酶固定化反應(yīng)柱
弱堿性苯乙稀陰離子樹脂加入2.5％戊二醛，在10℃～20℃下交聯(lián)反應(yīng)10～12小時，再加入1～4％胰蛋白酶，在10～15℃下固定化20小時，裝入直徑∶高度＝1∶10的不銹鋼反應(yīng)柱；
c.水解粗奶酪
粗奶酪用10～15倍水在55～60℃溶脹1小時，以1mol/L的NaOH調(diào)整pH值不超過8.0，溶解后，經(jīng)過濾、分離脫脂后的蛋白質(zhì)溶液在40℃～60℃下以10L/min的速度逆向通過固定化酶反應(yīng)柱，蛋白質(zhì)溶液保持與固定化酶循環(huán)接觸時間為3～5小時；然后將水解液經(jīng)熱交換柱冷卻至室溫，壓濾除去沉淀，經(jīng)由硅藻土過濾機(jī)澄清后得到CPP水解液；
d.超濾膜分離提純酪蛋白磷酸肽(CPP)
CPP水解液經(jīng)過超濾膜過濾設(shè)備兩次分離，其工藝參數(shù)第一次分離膜截流分子量上限≤50000，膜起始壓力2Bar，終止壓力10Bar，循環(huán)流量200L/h r，平均循環(huán)時間2～5小時；第二次超濾膜分離膜截流分子量下限≤1000，膜起始壓力4Bar，終止壓力15Bar，循環(huán)流量150L/hr，平均循環(huán)時間3～6小時；
e.將CPP的超濾液進(jìn)行柱層析
分離后的水解液用20～40目的顆?；钚蕴恐M(jìn)行層析吸咐，流速為20L/hr，壓力為1.2Bar～1.5Bar，然后將水解液經(jīng)低溫真空濃縮，真空度40mmHg～60mmHg、溫度30℃～40℃，至固形物含量30％～40％，再噴霧干燥，壓力為6Ba r，溫度為60℃～70℃，即得到酪蛋白磷酸肽(CPP)產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種固定化酶水解粗奶酪和超濾膜分離方法連續(xù)生產(chǎn)酪蛋白磷酸肽，其步驟包括a.胰蛋白酶的提?。籦.制備胰蛋白酶固定化反應(yīng)柱；c.水解粗奶酪；d.超濾膜分離提純酪蛋白磷酸肽(CPP)；e.將CPP的超濾液進(jìn)行柱層析。本發(fā)明工藝設(shè)計合理、操作性強(qiáng)，生產(chǎn)過程短，中間產(chǎn)物濃度高，生產(chǎn)能耗低主要分離純化過程均采用常溫處理，干燥過程蒸發(fā)量少，極大降低了生產(chǎn)中的能耗，節(jié)約了成本。產(chǎn)品經(jīng)真空濃縮、噴霧干燥得到，其主要成份為小分子生物活性多肽，分子量在2000～6000范圍的多肽占多肽的45％以上。
文檔編號A23J3/10GK101755996SQ201010100138
公開日2010年6月30日 申請日期2010年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月20日
發(fā)明者胡先望, 張瑞貞, 陳朋, 梁寧 申請人:甘南州科瑞乳品開發(fā)有限公司