專利名稱：異源同種乳清蛋白的分離純化方法
技術領域：
本發(fā)明屬于蛋白的分離純化方法，特別是涉及一種異源同種乳清蛋白的分離 純化方法。
背景技術：
哺乳動物乳液中的許多乳清蛋白含有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值，如為機體 提供各種必需氨基酸、抑菌和誘導腫瘤細胞凋亡。哺乳動物乳液如牛乳中的乳清 蛋白存在過敏原，能夠導致部分嬰幼兒及成年人發(fā)生IgE或非IgE介導的過敏反 應。利用轉基因技術在哺乳動物乳腺反應器中表達轉基因人源乳清蛋白，可以改 善乳液的營養(yǎng)價值，轉基因乳液作為原料純化的人源乳清蛋白可以作為高營養(yǎng)價 值、高經濟附加值的食品添加劑。
轉基因哺乳動物乳液中除轉基因表達的人源乳清蛋白外，還有哺乳動物自身 表達的乳清蛋白，異源同種乳清蛋白結構相似，理化性質接近，難以分離，王建 武(重組人a-乳清白蛋白轉基因牛鑒定與分析，中國農業(yè)大學博士論文，2007) 報道用陰離子交換等度洗脫的方法分離牛源和人源a-乳清白蛋白，但是難以進行 有效的放大。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種異源同種乳清蛋白的分離純化方法。
本發(fā)明采用的技術方案步驟如下
1) 選取至少含有一種異源同種乳清蛋白的轉基因哺乳動物乳液為原料，離 心去除脂類和酪蛋白后收集上清液獲得乳清；
2) 將所得乳清經預處理去除免疫球蛋白、剩余的酪蛋白等大分子雜質；
3) 將乳清或預處理后的乳清經過疏水作用層析和凝膠過濾層析聯(lián)用的組合 層析工藝或經過單步疏水作用層析工藝，分離得到異源同種乳清蛋白。
本發(fā)明所述的轉基因哺乳動物乳液優(yōu)選為牛乳，所述的異源同種乳清蛋白優(yōu)
選為轉基因人源a-乳清白蛋白、乳轉鐵蛋白、溶菌酶和牛自身表達的牛源a-乳
清白蛋白、乳轉鐵蛋白、溶菌酶等；以下僅以一種蛋白的分離來加以說明，但本
發(fā)明的保護不局限與此；牛乳中總蛋白濃度為30-38g/L異源同種乳清蛋白總濃 度1.0-4.0g/L，優(yōu)選蛋白總濃度為1.5-3.5g/L。
本發(fā)明所述的乳清預處理步驟可采用硫酸銨沉淀或超濾的方法。在采用硫酸 銨沉淀時，需在室溫下將乳清調節(jié)pH到5.0-10.0，優(yōu)選的pH值為6.0-8.0，并通 過加入硫酸銨粉末使得乳清中硫酸銨飽和度為20%-60%，以摩爾數計為 0.86-2.95M,優(yōu)選的硫酸銨飽和度為30%-60%，以摩爾數計為1.33-2.37M，振蕩 2小吋，離心收集上清液。在采用超濾時，需將乳清調節(jié)pH值到5.0-10.0，優(yōu)選 的pH值為6.0-8.0,優(yōu)選采用截留分子量30-200KD的超濾膜超濾，收集濾出液。
本發(fā)明所述的疏水作用層析中，疏水作用層析介質采用瓊脂糖材料為基質， 所述的配基可為丁基、苯基、辛基，優(yōu)選為丁基。
本發(fā)明所述的疏水作用層析中，可采用的疏水鹽為硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉 等，優(yōu)選采用硫酸銨；
本發(fā)明所述的疏水作用層析中，緩沖液體系可采用磷酸鹽緩沖液、三羥甲基 氨基甲垸-鹽酸緩沖液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，優(yōu)選為磷酸鹽緩沖液；低鹽 緩沖液優(yōu)選為20-100mM， pH6.0-8.0的磷酸鹽緩沖液，緩沖液無疏水鹽或疏水鹽 濃度在0.5M以下；高鹽緩沖液優(yōu)選為20-100mM， pH6.0-8.0的磷酸鹽緩沖液， 疏水鹽濃度為0.5-2.0M，優(yōu)選濃度為0.6-1.2M。
本發(fā)明所述的疏水作用層析中，將預處理得到的乳清溶液調節(jié)pH到 5.0-10.0，優(yōu)選的pH值為6.0-8.0;并將乳清溶液調節(jié)疏水鹽濃度為0.5-2.0M，優(yōu) 選濃度為0.6-1.5M,疏水鹽濃度可采用低鹽緩沖液或者疏水鹽粉末調節(jié)。
本發(fā)明所述的疏水作用層析中，本領域技術人員可根據異源同種乳清蛋白的 類型選擇合適的疏水層析介質、層析柱和進樣速度將經預處理后的乳清溶液進樣 到用高鹽緩沖液平衡好的疏水層析柱中，層析過程使用280nm紫外吸收波長進 行蛋白檢測，進樣的乳清溶液體積為0.5-5.0倍層析柱體積，優(yōu)選為1.0-3.0倍層 析柱體積；乳清中異源同種乳清蛋白中的一種在適宜的高鹽濃度下變構同疏水介 質的配基相結合保留在柱中，而低疏水性的另一種異源同種乳清蛋白和其它雜質 蛋白則無法保留，全部樣品進樣完畢后，用高鹽緩沖液沖洗去疏水作用層析柱中 未保留的蛋白，直到紫外吸收波長回到基線；再用低鹽緩沖液洗脫，洗脫方式可 為一歩洗脫、階段洗脫、線形洗脫，收集洗脫液以得到異源同種乳清蛋白的一種， 本領域技術人員可調節(jié)工藝參數以得到不同的異源同種乳清蛋白的初步純化產 品或純品；由于異源同種乳清蛋白的疏水性強弱不同，通過本步驟已將異源同種 乳清蛋白分開。
本發(fā)明所述的凝膠過濾層析中，將不同的異源同種乳清蛋白的初步純化產品 再經凝膠過濾層析除去剩余雜質以得到純品，凝膠過濾層析介質為瓊脂糖介質， 優(yōu)選為Superdex 75。
本發(fā)明相對于現有技術，由于采用了疏水層析技術，可根據異源同種乳清蛋 白之間構象和疏水性質的差異分離，可調節(jié)具體疏水層析的工藝條件，得到不同 的異源同種乳清蛋白初步純化產品或純品；采用了凝膠過濾層析對初步純化產品 進行了進一步的精制純化，得到了高純度的異源同種乳清蛋白純品；采用了直接 的方法，簡化了去除酪蛋白的步驟，提高了牛乳預處理過程中的乳清蛋白的回收 率；采用以疏水層析為核心的復合工藝方法，生產工藝穩(wěn)定，適于進行轉基因異 源同種乳清蛋白的規(guī)?；a，產品純度高，工藝回收率高。


圖1為分離純化工藝流程圖
A為乳清經處理后進行疏水層析的工藝流程圖
B為乳清直接進行組合層析的工藝流程圖
圖2為Butyl Sepharose 4FF疏水層析分離純化人源a-LA。
圖3為Superdex 75凝膠過濾分離純化人源a-LA。
圖4為SDS-PAGE鑒定人源a-LA圖譜。
l為經過預處理的乳清，2為疏水層析穿透峰p0， 3為疏水層析洗脫峰即人 源a-乳清白蛋白純品，4為凝膠過濾峰p3即牛源a-乳清白蛋白純品
圖5為反相鑒定人源a-LA液相圖譜，色譜柱為C4 protein,檢測波長280nm。 圖6為質譜鑒定人源a-LA圖譜。
實施例l
取100mL轉基因人源a-乳清白蛋白牛乳，牛乳總蛋白濃度為33g/L，人源a-乳清白蛋白濃度為1.4 g/L，牛源a-乳清白蛋白濃度為1.0 g/L，使用Sigma 3k30 離心機4攝氏度下，調離心力為10000g離心30分鐘去除脂類和酪蛋白后收集上 清液獲得乳清80mL，總蛋白濃度為9.5g/L，人源a-乳清白蛋白濃度為1.7g/L， 牛源a-乳清白蛋白濃度為1.2g/L。使用1M的鹽酸或氫氧化鈉溶液調節(jié)乳清pH
到8.0,緩慢加入硫酸銨粉末到乳清硫酸銨飽和度為45%，以摩爾記數為2.09M, 在室溫下振蕩2小時后，將沉淀樣品使用Sigma 3k30離心機4攝氏度下，調離 心力為10000g離心30分鐘并收集上清液70mL，上清液總蛋白濃度4.5g/L,人 源a-乳清白蛋白濃度為1.8g/L，牛源a-乳清白蛋白濃度為1.2g/L。
使用20mM， pH7.0磷酸鹽緩沖液調節(jié)乳清預處理樣品硫酸銨濃度達到 0.8M，使用1M鹽酸或氫氧化鈉溶液調節(jié)乳清預處理樣品pH到7.0，進樣到用 20mM， pH7.0含0.8M硫酸銨的磷酸鹽緩沖液預平衡好的Butyl S印harose 4FF 疏水層析柱中，柱內徑3.5厘米，柱床高度IO厘米，層析設備GEAKTAExplorer 100，紫外280nm波長吸收檢測，流速10ml/min，上樣完畢后用20mM， pH7.0 含0.8M硫酸銨的磷酸鹽緩沖液繼續(xù)沖洗至280nm紫外吸收信號回到基線，收集 上樣的穿透峰150mL，總蛋白濃度為1.4g/L，人源a-乳清白蛋白濃度為0.01 g/L， 牛源a-乳清白蛋白濃度為0,5g/L;再用20mM， pH7.0的磷酸鹽緩沖液一步洗脫 并收集洗脫峰105mL，總蛋白濃度為1.0g/L，人源a-乳清白蛋白濃度為0.95g/L， 純度95%，工藝回收率71%，牛源a-乳清白蛋白濃度為0.02g/L。
取穿透峰30mL進樣到用20mM， pH7.0含0.1M硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液預 平衡好的Superdex75凝膠過濾層析柱中，柱內徑3.5厘米，柱床高度60厘米， 層析設備GE AKTA Explorer 100，紫外280nm波長吸收檢測，流速2mUmin， 上樣完畢后繼續(xù)用20mM， pH7.0含0.1M硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液沖洗，收集330 mL處的蛋白峰共80mL，總蛋白濃度為0.18g/L，人源a-乳清白蛋白濃度為 0.005g/L，牛源a-乳清白蛋白濃度為0.175g/L，純度97%，工藝回收率70%。 實施例2
取lOOmL轉基因人源a-乳清白蛋白牛乳，牛乳總蛋白濃度為33g/L，人源a-乳清白蛋白濃度為1.4 g/L，牛源a-乳清白蛋白濃度為1.0 g/L，使用Sigma 3k30 離心機4攝氏度下，調離心力為10000g離心30分鐘去除脂類和酪蛋白后收集上 清液獲得乳清80mL，總蛋白濃度為9.5g/L，人源a-乳清白蛋白濃度為1.7 g/L， 牛源a-乳清白蛋白濃度為1.2 g/L。使用1M的鹽酸或氫氧化鈉溶液調節(jié)乳清pH 到7.0，緩慢加入硫酸銨粉末到乳清硫酸銨飽和度為40%，以摩爾記數為1.84M， 在室溫下振蕩2小時后，將沉淀樣品使用Sigma 3k30離心機4攝氏度下，調離 心力為10000g離心30分鐘并收集上清液70mL，上清液總蛋白濃度5.4g/L，人
源a-乳清白蛋白濃度為1.85 g/L，牛源a-乳清白蛋白濃度為1.3 g/L。
使用20mM， pH6.0磷酸鹽緩沖液調節(jié)乳清預處理樣品硫酸銨濃度達到 0.7M,使用1M鹽酸或氫氧化鈉溶液調節(jié)乳清預處理樣品pH到6.0，進樣到用 20mM， pH6.0含0.7M硫酸銨的磷酸鹽緩沖液預平衡好的Octyl Sepharose 4FF疏 水層析柱中，柱內徑3.5厘米，柱床高度10厘米，層析設備GE AKTA Explorer 100， 紫外280nm波長吸收檢測，流速10ml/min,上樣完畢后用20mM， pH6.0含0.7M 硫酸銨的磷酸鹽緩沖液繼續(xù)沖洗至280nm紫外吸收信號回到基線，收集上樣的 穿透峰160mL，總蛋白濃度為1.2g/L,人源a-乳清白蛋白濃度為0.01 g/L，牛源 a-乳清白蛋白濃度為0.5g/L;再用20mM， pH6.0的磷酸鹽緩沖液一步洗脫并收 集洗脫峰108mL，總蛋白濃度為1.7g/L，人源a-乳清白蛋白濃度為1.0g/L，純度 58%，工藝回收率77%，牛源a-乳清白蛋白濃度為0.1g/L。 實施例3
取lOOmL轉基因人源a-乳清白蛋白牛乳，牛乳總蛋白濃度為33g/L，人源a-乳清白蛋白濃度為1.4 g/L，牛源a-乳清白蛋白濃度為1.0 g/L,使用Sigma 3k30 離心機4攝氏度下，調離心力為10000g離心30分鐘去除脂類和酪蛋白后收集上 清液獲得乳清80mL，總蛋白濃度為9.5g/L，人源a-乳清白蛋白濃度為1.7 g/L， 牛源a-乳清白蛋白濃度為1.2 g/L。使用1M的鹽酸或氫氧化鈉溶液調節(jié)乳清pH 到7.0，使用上海之信儀器有限公司DDB-300型恒流蠕動泵和Millipore公司 IOOKD中空纖維膜柱進行超濾，循環(huán)5次，循環(huán)緩沖液使用20mM， pH7.0的磷 酸鹽緩沖液，最終收集透出液體80mL，上清液總蛋白濃度3.8g/L，人源a-乳清 白蛋白濃度為1.2g/L，牛源a-乳清白蛋白濃度為0.8g/L。
使用20mM， pH6.0磷酸鹽緩沖液調節(jié)乳清預處理樣品硫酸銨濃度達到 1.2M，使用1M鹽酸或氫氧化鈉溶液調節(jié)乳清預處理樣品pH到6.0，進樣到用 20mM， pH6.0含1.2M硫酸銨的磷酸鹽緩沖液預平衡好的Phenyl S印harose 6FF 疏水層析柱中，柱內徑3.5厘米，柱床高度IO厘米，層析設備GEAKTAExplorer 100，紫外280nm波長吸收檢測，流速1()ml/min，上樣完畢后用20mM， pH6.0 含1.2M硫酸銨的磷酸鹽緩沖液繼續(xù)沖洗至280nm紫外吸收信號回到基線，收集 上樣的穿透峰155mL，總蛋白濃度為1.0g/L，人源a-乳清白蛋白濃度為0.3 g/L， 牛源a-乳清白蛋白濃度為03g/L;再用20mM， pH6.0的磷酸鹽緩沖液一步洗脫
并收集洗脫峰105mL，總蛋白濃度為1.0g/L，人源a-乳清白蛋白濃度為0.5g/L，
純度50%，工藝回收率37.5%，牛源a-乳清白蛋白濃度為0.2g/L。
實施例4
取100mL轉基因人源a-乳清白蛋白牛乳，牛乳總蛋白濃度為33g/L，人源a-乳清白蛋白濃度為1.4 g/L，牛源a-乳清白蛋白濃度為1.0 g/L，使用Sigma 3k30 離心機4攝氏度下，調離心力為10000g離心30分鐘去除脂類和酪蛋白后收集上 清液獲得乳清80mL，總蛋白濃度為9.5g/L，人源a-乳清白蛋白濃度為1.7 g/L, 牛源a-乳清白蛋白濃度為1.2 g/L。使用1M的鹽酸或氫氧化鈉溶液調節(jié)乳清pH 到9.0，使用上海之信儀器有限公司DDB-300型恒流蠕動泵和Millipore公司 150KD中空纖維膜柱進行超濾，循環(huán)5次，循環(huán)緩沖液使用20mM， pH9.0的磷 酸鹽緩沖液，最終收集透出液體85mL，上清液總蛋白濃度4.6g/L，人源a-乳清 白蛋白濃度為1.3g/L，牛源a-乳清白蛋白濃度為0.9g/L。
使用20mM， pH7.0磷酸鹽緩沖液調節(jié)乳清預處理樣品硫酸銨濃度達到 l.OM,使用1M鹽酸或氫氧化鈉溶液調節(jié)乳清預處理樣品pH到7.0，進樣到用 20mM， pH7.0含l.OM硫酸銨的磷酸鹽緩沖液預平衡好的Octyl Sepharose 4FF疏 水層折柱中，柱內徑3.5厘米，柱床高度10厘米，層析設備GE AKTA Explorer 100， 紫外280nm波長吸收檢測，流速10ml/min，上樣完畢后用20mM， pH7.0含l.OM 硫酸銨的磷酸鹽緩沖液繼續(xù)沖洗至280nm紫外吸收信號回到基線，收集上樣的 穿透峰165mL，總蛋白濃度為1.4g/L，人源a-乳清白蛋白濃度為0.01 g/L，牛源 a-乳清白蛋白濃度為0.3 g/L;再用20mM， pH7.0的磷酸鹽緩沖液一步洗脫并收 集洗脫峰120mL，總蛋白濃度為1.2g/L，人源a-乳清白蛋白濃度為0.9g/L，純度 75%，工藝回收率77%，牛源a-乳清白蛋白濃度為0.2g/L。 實施例5
取lOOmL轉基因人源a-乳清白蛋白牛乳，牛乳總蛋白濃度為33g/L，人源a-乳清白蛋白濃度為1.4 g/L，牛源a-乳清白蛋白濃度為1.0 g/L，使用Sigma 3k30 離心機4攝氏度下，調離心力為10000g離心30分鐘去除脂類和酪蛋白后收集上 清液獲得乳清80mL，總蛋白濃度為9.5g/L，人源a-乳清白蛋白濃度為1.7 g/L， 牛源a-乳清白蛋白濃度為1.2 g/L。
使用硫酸銨粉末調節(jié)乳清樣品硫酸銨濃度達到0.8M,使用1M鹽酸或氫氧 化鈉溶液調節(jié)乳清預處理樣品pH到8.0，進樣到用20mM， pH8.0含0.8M硫酸 銨的磷酸鹽緩沖液預平衡好的Octyl Sepharose 4FF疏水層析柱中，柱內徑3.5 厘米，柱床高度10厘米，層析設備GEAKTA Explorer 100，紫外280nm波長吸 收檢測，流速10ml/min，上樣完畢后用20mM， pH8.0含0.8M硫酸銨的磷酸鹽 緩沖液繼續(xù)沖洗至280nm紫外吸收信號回到基線，收集上樣的穿透峰150mL, 總蛋白濃度為3.8g/L，人源a-乳清白蛋白濃度為0.2 g/L，牛源a-乳清白蛋白濃 度為0.5 g/L;再用20mM， pH8.0的磷酸鹽緩沖液一步洗脫并收集洗脫峰112mL， 總蛋白濃度為1.5g/L，人源a-乳清白蛋白濃度為0.9g/L，牛源a-乳清白蛋白濃度 為0.2 g/L
取洗脫峰30mL進樣到用20mM， pH7.0含0.1M硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液預 平衡好的Superdex75凝膠過濾層析柱中，柱內徑3.5厘米，柱床高度60厘米， 層析設備GE AKTA Explorer 100，紫外280nm波長吸收檢測，流速2mL/min， 上樣完畢后繼續(xù)用20mM, pH7.0含0.1M硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液沖洗，收集330 mL處的蛋白峰共80mL，總蛋白濃度為0.35g/L，人源a-乳清白蛋白濃度為0.3g/L， 純度86%，工藝回收率17%。 實施例6
取100mL轉基因人源乳轉鐵蛋白牛乳，牛乳總蛋白濃度為34g/L，人源乳轉 鐵蛋白濃度為1.7g/L，牛源乳轉鐵蛋白濃度為0.1g/L，使用Sigma 3k30離心機4 攝氏度下，調離心力為10000g離心30分鐘去除脂類和酪蛋白后收集上清液獲得 乳清80mL，總蛋白濃度為98g/L，人源乳轉鐵蛋白濃度為2.0 g/L，牛源乳轉鐵 蛋白濃度為O.l g/L。使用1M的鹽酸或氫氧化鈉溶液調節(jié)乳清pH到9.0，緩慢 加入硫酸銨粉末到乳清硫酸銨飽和度為50%，以摩爾記數為2.37M，在室溫下振 蕩2小時后，將沉淀樣品使用Sigma 3k30離心機4攝氏度下，調離心力為10000g 離心30分鐘并收集上清液75mL，上清液總蛋白濃度3.6g/L，人源乳轉鐵蛋白濃 度為1. 5 g/L，牛源乳轉鐵蛋白濃度為0.1 g/L。
使用20mM， pH6.0磷酸鹽緩沖液調節(jié)乳清預處理樣品硫酸銨濃度達到 l.OM，使用1M鹽酸或氫氧化鈉溶液調節(jié)乳清預處理樣品pH到6.0，進樣到用 20mM， pH6.0含l.OM硫酸銨的磷酸鹽緩沖液預平衡好的Butyl Sepharose 4FF 疏水層析柱中，柱內徑3.5厘米，柱床高度IO厘米，層析設備GEAKTA Explorer
100，紫外280nm波長吸收檢測，流速10ml/min，上樣完畢后用20mM， pH6.0 含l.OM硫酸銨的磷酸鹽緩沖液繼續(xù)沖洗至280nm紫外吸收信號回到基線，收集 上樣的穿透峰148mL，總蛋白濃度為1.6g/L，人源乳轉鐵蛋白濃度為0.2 g/L, 牛源乳轉鐵蛋白濃度為0.05 g/L;再用20mM， pH6.0的磷酸鹽緩沖液一步洗脫 并收集洗脫峰103mL，總蛋白濃度為0.9g/L，人源乳轉鐵蛋白濃度為0.8g/L,純 度89%，工藝回收率48%，牛源乳轉鐵蛋白濃度為0.001 g/L。 實施例7
取100mL轉基因人源乳轉鐵蛋白牛乳，牛乳總蛋白濃度為34g/L，人源乳轉 鐵蛋白濃度為1.7 g/L，牛源乳轉鐵蛋白濃度為0.1 g/L，使用Sigma 3k30離心機 4攝氏度下，調離心力為10000g離心30分鐘去除脂類和酪蛋白后收集上清液獲 得乳清80mL，總蛋白濃度為9.8g/L，人源乳轉鐵蛋白濃度為2.0 g/L，牛源乳轉 鐵蛋白濃度為0.1g/L。使用1M的鹽酸或氫氧化鈉溶液調節(jié)乳清pH到8.0，使用 上海之信儀器有限公司DDB-300型恒流蠕動泵和Millipore公司10KD中空纖維 膜柱進行超濾，循環(huán)5次，循環(huán)緩沖液使用20mM， pH8.0的磷酸鹽緩沖液，最 終收集透出液體77mL，上清液總蛋白濃度4.2g/L，人源乳轉鐵蛋白濃度為1.4 g/L，牛源乳轉鐵蛋白濃度為0.1g/L。
使用20mM， pH7.0磷酸鹽緩沖液調節(jié)乳清預處理樣品硫酸銨濃度達到 0.6M，使用1M鹽酸或氫氧化鈉溶液調節(jié)乳清預處理樣品pH到6.0，進樣到用 20mM， pH7.0含0.6M硫酸銨的磷酸鹽緩沖液預平衡好的Octyl Sepharose 4FF 疏水層析柱中，柱內徑3.5厘米，柱床高度10厘米，層析設備GEAKTAExplorer 100，紫外280nm波長吸收檢測，流速10ml/min，上樣完畢后用20mM， pH6.0 含0.6M硫酸銨的磷酸鹽緩沖液繼續(xù)沖洗至280nm紫外吸收信號回到基線，收集 上樣的穿透峰152mL，總蛋白濃度為1.4g/L，人源乳轉鐵蛋白濃度為0.3 g/L， 牛源乳轉鐵蛋白濃度為0.04 g/U再用20mM， pH7.0的磷酸鹽緩沖液一步洗脫 并收集洗脫峰106mL，總蛋白濃度為1.0g/L，人源乳轉鐵蛋白濃度為0.5g/L，純 度50%,工藝回收率31%，牛源乳轉鐵蛋白濃度為0.02g/L。 實施例8
取100mL轉基因人源溶菌酶牛乳，牛乳總蛋白濃度為32g/L，人源溶菌酶濃 度為1.5 g/L，牛源溶菌酶濃度為0.01 g/L，使用Sigma 3k30離心機4攝氏度下，
調離心力為10000g離心30分鐘去除脂類和酪蛋白后收集上清液獲得乳清80mL, 總蛋白濃度為9.3g/L，人源溶菌酶濃度為1.7g/L，牛源溶菌酶濃度為0.01 g/L。 使用1M的鹽酸或氫氧化鈉溶液調節(jié)乳清pH到8.0，使用上海之信儀器有限公司 DDB-300型恒流蠕動泵和Millipore公司150KD中空纖維膜柱進行超濾，循環(huán)5 次，循環(huán)緩沖液使用20mM， pH8.0的磷酸鹽緩沖液，最終收集透出液體85mL， 上清液總蛋白濃度3.4g/L，人源a-乳清白蛋白濃度為1.4g/L，牛源a-乳清白蛋白 濃度為0.008g/L。
使用20mM， pH8.0磷酸鹽緩沖液調節(jié)乳清預處理樣品硫酸銨濃度達到 0.9M，使用1M鹽酸或氫氧化鈉溶液調節(jié)乳清預處理樣品pH到8.0，進樣到用 20mM， pH8.0含0.9M硫酸銨的磷酸鹽緩沖液預平衡好的Octyl Sepharose 4FF 疏水層析柱中，柱內徑3.5厘米，柱床高度IO厘米，層析設備GEAKTAExplorer 100，紫外280nm波長吸收檢測，流速10ml/min，上樣完畢后用20mM， pH8.0 含0.9M硫酸銨的磷酸鹽緩沖液繼續(xù)沖洗至280nm紫外吸收信號回到基線，收集 上樣的穿透峰150mL，總蛋白濃度為1.1g/L，人源溶菌酶濃度為0.35 g/L，牛源 溶菌酶濃度為0.004 g/L;再用20mM， pH8.0的磷酸鹽緩沖液一步洗脫并收集洗 脫峰112mL，總蛋白濃度為0.8g/L，人源溶菌酶濃度為0.5g/L,純度62.5%，工 藝回收率37%，牛源溶菌酶濃度為0.0001 g/L。
權利要求
1.異源同種乳清蛋白的分離純化方法，其步驟包括1)選取至少含有一種異源同種乳清蛋白的轉基因哺乳動物乳液為原料，離心去除脂類和酪蛋白后收集上清液獲得乳清；2)將所得乳清經預處理去除免疫球蛋白、剩余的酪蛋白等大分子雜質；3)將乳清或預處理后的乳清經過疏水作用層析和凝膠過濾層析聯(lián)用的組合層析或單步疏水作用層析，分離得到異源同種乳清蛋白。
2. 如權利要求l所述的方法，其中的哺乳動物乳液為牛乳。
3. 如權利要求l所述的方法，其中所述的異源同種乳清蛋白為人源和牛源a-乳 清白蛋白。
4. 如權利要求l所述的方法，預處理步驟為硫酸銨沉淀法或超濾處理法。
5. 如權利要求l所述的方法，疏水層析介質為瓊脂糖基質，其配基為丁基。
6. 如權利要求l所述的方法，疏水層析所用的鹽為硫酸銨，其濃度為0,5-2M硫 酸銨，優(yōu)選為0.6-L5M硫酸銨。
7. 如權利要求l所述的方法，疏水層析所用的緩沖體系為磷酸鹽緩沖液。
8. 如權利要求l所述的方法，疏水層析單次處理量為2倍柱體積的牛乳原料。
9. 如權利要求l所述的方法，凝膠過濾層析介質為Superdex75。
全文摘要
本發(fā)明一種異源同種乳清蛋白的分離純化方法，其步驟為選取含有一種異源同種乳清蛋白的轉基因哺乳動物乳液為原料，離心去除脂類和酪蛋白后獲得乳清，將所得乳清經預處理去除免疫球蛋白等大分子雜質。將乳清或預處理后的乳清進行疏水作用層析分離操作，乳清中的異源同種乳清蛋白同疏水層析介質相互作用，由于異源同種乳清蛋白之間空間構象和疏水性的不同，兩者可以在疏水層析中分離開，進一步通過凝膠過濾層析得到高純度的異源同種乳清蛋白純品，工藝回收率高，生產工藝穩(wěn)定，適于規(guī)?；a。
文檔編號C07K1/00GK101367864SQ20081011896
公開日2009年2月18日 申請日期2008年8月27日 優(yōu)先權日2008年8月27日
發(fā)明者強 衛(wèi), 焱 張, 堅 羅, 蘇志國, 閉靜秀, 馬光輝 申請人:中國科學院過程工程研究所