專利名稱：利用馬鈴薯淀粉廢水培養(yǎng)枯草芽孢桿菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種利用高濃度有機(jī)廢水培養(yǎng)枯草芽孢桿菌的方法。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，我國(guó)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，在許多地區(qū)都形成了產(chǎn)業(yè)化基地。每年生產(chǎn) 馬鈴薯淀粉總量達(dá)40多萬(wàn)噸，加工馬鈴薯近300萬(wàn)噸，排放廢水800多萬(wàn)噸。這些工藝廢 水大部分排放于河流和水庫(kù)中，造成嚴(yán)重污染。馬鈴薯淀粉廢水中，造成污染的主要是蛋 白液，占廢水總量的25%左右。蛋白液中主要營(yíng)養(yǎng)成分是馬鈴薯本身的蛋白質(zhì)、多糖、礦物 質(zhì)等，總含量為4% _5.5%，其中蛋白質(zhì)含量在0.9% 2. 1%，化學(xué)需氧量(COD)含量在 39000-45000mg/Lo其污染機(jī)理和危害是，蛋白液被排放在河流水庫(kù)中自然發(fā)酵后釋放出硫 化氫、氨氣等氣體，飄在空氣中有一股惡臭味；在水中，由于有機(jī)質(zhì)濃度太高，各種微生物生 長(zhǎng)繁殖很快，其中包括有害的微生物或者致病菌的大量生長(zhǎng)繁殖，不僅可以直接侵害水生 動(dòng)物，而且由于微生物的生長(zhǎng)和有機(jī)質(zhì)的氧化反應(yīng)，水中的溶解氧被消耗殆盡，使水生動(dòng)物 因缺氧而死亡(引自《飼料廣角》2007年第13期，32-34頁(yè))。中國(guó)發(fā)明專利(申請(qǐng)?zhí)?00810063868. 0)公開(kāi)了一種投藥氣浮-UASB-SBR的方 法處理淀粉廢水。該方法主要是通過(guò)氣浮池去除水中的懸浮物，氣浮池出水流入U(xiǎn)ASB厭 氧反應(yīng)器，將大部分的有機(jī)物分解為無(wú)機(jī)小分子物質(zhì)和甲烷，剩余污泥進(jìn)入污泥濃縮池， 出水流入預(yù)曝氣沉淀池，預(yù)曝氣沉淀池的出水自流進(jìn)入SBR進(jìn)行好氧生物處理。中國(guó)實(shí) 用新型專利(申請(qǐng)?zhí)?00820131168.6)公開(kāi)了一種馬鈴薯淀粉生產(chǎn)廢水中蛋白質(zhì)膜法 回收裝置，適用于淀粉生產(chǎn)廢水中蛋白質(zhì)的回收、濃縮、回收率在50%以上。中國(guó)實(shí)用新 型專利(申請(qǐng)?zhí)?00720U6184. 1)公開(kāi)了一種納濾回收馬鈴薯淀粉生產(chǎn)廢水中低聚糖裝 置，適用于廢水中低聚糖的回收、濃縮、回收率在80%以上。中國(guó)實(shí)用新型專利(申請(qǐng)?zhí)?200620005277. 4)公開(kāi)了一種對(duì)馬鈴薯淀粉生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的含有蛋白質(zhì)的廢水進(jìn)行加熱 處理提取蛋白質(zhì)的熱處理設(shè)備。目前尚未發(fā)現(xiàn)文獻(xiàn)報(bào)道用馬鈴薯淀粉廢水培養(yǎng)枯草芽孢桿 菌的方法。枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)N14菌株是我們實(shí)驗(yàn)室從油菜的葉面上分離 篩選出來(lái)的一株具有降解有機(jī)磷農(nóng)藥特性，并且能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)的野生菌株。該菌株保 藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期為2009年11月2日，分類 命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，保藏編號(hào)為CGMCC No. 3374。該菌株的16S rDNA基因序列已經(jīng)遞交到了 GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為GU086422。在http //www. ncbi. nlm. nih. gov/網(wǎng)站上用blast程序與已登錄細(xì)菌菌株的16S rDNA基因序列進(jìn)行比較，結(jié)果 表明與枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的相似性最高，可以達(dá)到99%以上。該菌株可 以利用馬鈴薯淀粉廢水中的有機(jī)質(zhì)為營(yíng)養(yǎng)物快速生長(zhǎng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用馬鈴薯淀粉廢水為主要原料，培養(yǎng)枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)N14菌株的方法，并且配制成菌劑，有利于保存和農(nóng)業(yè)應(yīng)用。本發(fā)明所述的菌劑的生產(chǎn)方法如下1、培養(yǎng)基配制1)菌種保藏培養(yǎng)基(固體)硫酸銨0 3g，磷酸氫二鉀0 2g，硫酸鎂0 0. Ig, 瓊脂20g，加馬鈴薯淀粉廢水至1L，pH7. 0-7. 5 ；2)菌種活化培養(yǎng)基(液體)硫酸銨0 3g，磷酸氫二鉀0 2g，硫酸鎂0 0. Ig, 加馬鈴薯淀粉廢水至1L，pH7. 0-7. 5 ；3)種子培養(yǎng)基(液體)硫酸銨0 30g，磷酸氫二鉀0 20g，硫酸鎂0 1. Og, 加馬鈴薯淀粉廢水至10L，pH7. 0-7. 5 ；4)發(fā)酵培養(yǎng)基(液體)硫酸銨0 0. ^g，磷酸氫二鉀0 0. 4kg，硫酸鎂0 20g，加馬鈴薯淀粉廢水至200L，pH7. 0-7. 5 ；以上培養(yǎng)基均在121°C滅菌15_30min。2、菌種轉(zhuǎn)接與活化挑取斜面保存的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)至菌種 保藏培養(yǎng)基平板，35°C連續(xù)劃線、挑單菌落培養(yǎng)兩次后，挑取單菌落在菌種活化培養(yǎng)基中， 于;35°C，150-200r/min 搖床振蕩培養(yǎng) 12_24h ；3、液體種子制備向裝有高溫滅菌的種子培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，按照5% -20%的接 種量接種步驟2活化的有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌，于25-37°C，通空氣培養(yǎng)12-24h，得到液體種子。4、液態(tài)發(fā)酵向裝有高溫滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，按照5% -20%的接種量 接種步驟3制備的有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌液體種子，于25-37°C，通空氣培養(yǎng)18-60h，得到活菌 體培養(yǎng)物，菌體濃度達(dá)到60億CFU/mL以上。5、菌劑制備培養(yǎng)好的發(fā)酵液經(jīng)細(xì)菌計(jì)數(shù)后，加入甘氨酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0. 2% -2% ) 和甘油(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%-5%)，灌裝保藏。使用時(shí)用水稀釋500-1000倍。由本發(fā)明技術(shù)方案生產(chǎn)的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)能夠有效降解作物 表面殘留的有機(jī)磷農(nóng)藥，促進(jìn)作物生長(zhǎng)，而且生產(chǎn)成本低廉，還實(shí)現(xiàn)了高濃度有機(jī)廢水的資 源化。以下通過(guò)具體實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施，目的在于幫助讀者更好地理解本發(fā)明 的精神實(shí)質(zhì)，但不作為對(duì)本發(fā)明實(shí)施范圍的限定。實(shí)施例1 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)N14菌株的培養(yǎng)方法1、培養(yǎng)基配制1)菌種保藏培養(yǎng)基(固體)硫酸銨2g，磷酸氫二鉀2g，硫酸鎂0. lg，瓊脂20g，加 馬鈴薯淀粉廢水至1L，pH7. 0-7. 5 ；2)菌種活化培養(yǎng)基(液體)硫酸銨2g，磷酸氫二鉀2g，硫酸鎂0. lg，加馬鈴薯淀 粉廢水至 1L，pH7. 0-7. 5 ；3)種子培養(yǎng)基(液體)硫酸銨20g，磷酸氫二鉀20g，硫酸鎂l.Og，加馬鈴薯淀粉 廢水至 10L, ρΗ7· 0-7. 5 ；4)發(fā)酵培養(yǎng)基(液體)硫酸銨0. ^g，硫酸鎂20g，磷酸氫二鉀0. 4kg，加馬鈴薯 淀粉廢水至200L，pH7. 0-7. 5 ；以上培養(yǎng)基均在121°C滅菌15_30min。
2、菌種轉(zhuǎn)接與活化挑取斜面保存的有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌至菌種保藏培養(yǎng)基平板， 35°C連續(xù)劃線、挑單菌落培養(yǎng)兩次后，挑取單菌落在菌種活化培養(yǎng)基中，于35°C，150r/min 搖床振蕩培養(yǎng)20h ；3、液體種子制備向裝有高溫滅菌的種子培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，按照5%的接種量 接種有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌，于37°C，通空氣培養(yǎng)24h，得到液體種子。4、液態(tài)發(fā)酵向裝有高溫滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，按照10%的接種量接種 有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌液體種子，于37°C，通空氣培養(yǎng)36h，得到活菌體培養(yǎng)物，菌體濃度達(dá)到 50 億 CFU/mL05、菌劑制備培養(yǎng)好的發(fā)酵液經(jīng)細(xì)菌計(jì)數(shù)后，加入甘氨酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù))和甘油 (質(zhì)量分?jǐn)?shù)2% )，灌裝保藏。使用時(shí)用水稀釋500-1000倍。實(shí)施例2 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)N14對(duì)油菜葉面敵敵畏農(nóng)藥殘留的 降解效果1)選取兩個(gè)完全相同的油菜地塊，各30m2，均勻噴灑1000倍稀釋的80%敵敵畏乳 油農(nóng)藥；2)噴灑敵敵畏1 后，害蟲(chóng)已被殺死，均勻噴施農(nóng)藥降解菌劑(用清水稀釋600 倍)，以噴施清水作對(duì)照；3)噴灑菌劑24h后，五點(diǎn)取樣法檢測(cè)油菜葉面敵敵畏殘留，發(fā)現(xiàn)噴灑菌劑的處理 組與不噴灑菌劑的對(duì)照組相比，敵敵畏殘留量顯著降低，低于蔬菜中敵敵畏殘留國(guó)家限量 標(biāo)準(zhǔn)(0. lmg/kg)。實(shí)施例3 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)N14促進(jìn)油菜生長(zhǎng)，改善油菜品質(zhì)1)選取兩個(gè)完全相同的油菜地塊，各30m2，每塊菜地都按照30公斤/畝的施肥量 在幼苗期施用尿素，其中一塊同時(shí)再施加枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)N14菌株的發(fā) 酵液(用量按照80升/畝)。2)施肥2周后，在每塊菜地隨機(jī)采摘油菜樣本30棵，稱重，并檢測(cè)油菜中硝酸鹽和 亞硝酸鹽的含量；結(jié)果表明，施用枯草芽孢桿菌N14菌株發(fā)酵液的油菜與不施加發(fā)酵液的 對(duì)照相比，株重增加15%，硝酸鹽含量降低30%，亞硝酸鹽含量降低70%。本發(fā)明所使用的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)N14菌株保藏于中國(guó)微生物 菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期為2009年11月2日，分類命名為枯草芽孢 桿菌(Bacillus subtilis)。保藏編號(hào)為CGMCC No. 3374。
權(quán)利要求
1.利用馬鈴薯淀粉廢水培養(yǎng)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的方法，其特征在 于發(fā)酵培養(yǎng)基以馬鈴薯淀粉廢水為主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)源，培養(yǎng)步驟包括(1)培養(yǎng)基配制1)菌種保藏培養(yǎng)基(固體)硫酸銨0 3g，磷酸氫二鉀0 2g，硫酸鎂0 0.lg，瓊 脂20g，加馬鈴薯淀粉廢水至1L，pH 7. 0-7. 5 ；2)菌種活化培養(yǎng)基(液體)硫酸銨0 3g，磷酸氫二鉀0 2g，硫酸鎂0 0.Ig,加 馬鈴薯淀粉廢水至1L，pH 7. 0-7. 5 ；3)種子培養(yǎng)基(液體)硫酸銨0 30g，磷酸氫二鉀0 20g，硫酸鎂0 1.0g，加馬 鈴薯淀粉廢水至10L, pH 7. 0-7. 5 ；4)發(fā)酵培養(yǎng)基(液體)硫酸銨0 0.5kg,磷酸氫二鉀0 0. 4kg，硫酸鎂0 20g， 加馬鈴薯淀粉廢水至200L，pH 7. 0-7. 5 ；以上培養(yǎng)基均在121°C滅菌15-30min ；(2)菌種轉(zhuǎn)接與活化挑取斜面保存的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)至菌種保 藏培養(yǎng)基平板，35°C連續(xù)劃線、挑單菌落培養(yǎng)兩次后，挑取單菌落在菌種活化培養(yǎng)基中，于 35°C,150-200r/min 搖床振蕩培養(yǎng) 12_24h ；(3)液體種子制備向裝有高溫滅菌的種子培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，按照5%-20%的接種 量接種步驟2活化的有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌，于25-37°C，通空氣培養(yǎng)12-24h，得到液體種子；(4)液態(tài)發(fā)酵向裝有高溫滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，按照5%-20%的接種量接 種步驟3制備的有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌液體種子，于25-37°C，通空氣培養(yǎng)18-60h，得到活菌體 培養(yǎng)物，菌體濃度達(dá)到60億CFU/mL以上；(5)菌劑制備培養(yǎng)好的發(fā)酵液經(jīng)細(xì)菌計(jì)數(shù)后，加入甘氨酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2% -2% )和 甘油(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%-5%)，灌裝保藏。使用時(shí)用水稀釋500-1000倍。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用馬鈴薯淀粉廢水培養(yǎng)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基以馬鈴薯淀粉廢水為主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)源，培養(yǎng)步驟包括培養(yǎng)基配制、菌種活化、液體種子制備、液態(tài)發(fā)酵、菌劑制備。由本發(fā)明技術(shù)方案生產(chǎn)的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)能高效原位降解蔬菜葉片上有機(jī)磷農(nóng)藥殘留，促進(jìn)蔬菜生長(zhǎng)，降低蔬菜中硝酸鹽和亞硝酸鹽的含量，保障食品安全；本發(fā)明技術(shù)方案還能有效資源化馬鈴薯淀粉廢水，減少高濃度廢水排放，保護(hù)生態(tài)環(huán)境。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102127513SQ20101003372
公開(kāi)日2011年7月20日 申請(qǐng)日期2010年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月12日
發(fā)明者宿燕明, 李林, 李祖明, 白志輝, 韓禎 申請(qǐng)人:北京聯(lián)合大學(xué)