專利名稱：：一種低產(chǎn)甘油啤酒酵母的平板篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于酵母菌領(lǐng)域，特別涉及啤酒酵母菌株的選育和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：甘油是啤酒酵母酒精發(fā)酵的主要副產(chǎn)物，甘油具有甜味，一般啤酒中的甘油含量，容易超過感官辨別閾值，可使啤酒在飲后具有不易消失的甜味，使啤酒口感不爽凈；此外，由于甘油具有強(qiáng)烈的吸水作用，其也是啤酒飲后口發(fā)干的重要影響因素之一?？傊?，啤酒中甘油含量較高會(huì)對(duì)啤酒產(chǎn)生不利的影響?？梢酝ㄟ^兩種途徑來降低啤酒中甘油的含量第一種途徑是控制發(fā)酵工藝條件。未發(fā)酵的麥汁中甘油含量低，啤酒中的甘油主要是在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的。因此，控制發(fā)酵工藝條件可以在一定程度上降低甘油的產(chǎn)量，例如接種量、通氧量、pH等工藝條件。第二種途徑是通過遺傳育種的方法選育低產(chǎn)甘油的啤酒酵母菌株，主要包括基因工程技術(shù)及誘變育種、雜交育種等方法，例如很多研究通過調(diào)節(jié)甘油合成中起作用的酶的基因來控制甘油的合成。然而，通過控制發(fā)酵工藝條件降低甘油產(chǎn)量的方法效果不明顯，且增耗人力物力。在啤酒釀造時(shí)，只有選用低產(chǎn)甘油的酵母菌株，才能從根本上解決啤酒甘油含量過高的問題。因此，篩選低產(chǎn)甘油的酵母菌株對(duì)提高啤酒品質(zhì)具有非常重要的意義。無論是通過基因工程技術(shù)還是常規(guī)的誘變方法，最終都將涉及到從改造后的菌株中分離低產(chǎn)甘油菌株的問題。常規(guī)的分離篩選方法通常是菌種用物理方法或者化學(xué)誘變劑處理后在平板中進(jìn)行培養(yǎng)，然后挑選生長旺盛的菌落來接種斜面并加以驗(yàn)證。常規(guī)方法篩選沒有定向性，工作量大，效果不明顯。啤酒酵母在發(fā)酵過程中進(jìn)行糖酵解途徑，代謝葡萄糖生成甘油和乙醛，甘油的合成的主要路徑是磷酸二羥基丙酮(DHAP)在以NAD+為輔酶的3-磷酸甘油脫氫酶作用下轉(zhuǎn)化為3-磷酸甘油，再經(jīng)過甘油3-磷酸酯酶脫磷酸生成甘油。逆反應(yīng)為甘油的分解反應(yīng)，分別經(jīng)過甘油激酶和以FAD+為輔酶的3-磷酸甘油脫氫酶的作用轉(zhuǎn)化成磷酸二羥基丙酮(DHAP)。因此，可以通過抑制甘油合成反應(yīng)、促進(jìn)甘油分解代謝反應(yīng)降低甘油的含量。然而，在葡萄糖濃度過高時(shí)，甘油合成的逆反應(yīng)很弱。
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明解決的技術(shù)問題是提供一種方便的篩選低產(chǎn)甘油啤酒酵母的平板篩選方法，本發(fā)明解決的另一問題是提供一種用于篩選低產(chǎn)甘油啤酒酵母的培養(yǎng)基。本發(fā)明技術(shù)內(nèi)容如下酵母菌株經(jīng)物理或化學(xué)誘變后，稀釋涂布于平板培養(yǎng)基，挑選菌落比出發(fā)菌株菌落大的誘變菌株；所述平板培養(yǎng)基組成為甘油1_3%，2-脫氧葡萄糖0.03-0.08%，瓊脂2%，酵母粉1%，蛋白胨1%，其余為水。本發(fā)明中的平板培養(yǎng)基組成如下甘油1_3%，2-脫氧葡萄糖0.03-0.08%，瓊脂2%，酵母粉1%，蛋白胨1%，其余為水。本處指重量百分比。培養(yǎng)基滅菌后取1215mL裝入平板中，使培養(yǎng)基分布均勻。所述物理或化學(xué)誘變?yōu)楦鞣N常規(guī)誘變技術(shù)，包括紫外線誘變，甲基磺酸乙酯誘變等。本發(fā)明中的平板培養(yǎng)基組成中甘油含量?jī)?yōu)選2%;本發(fā)明中的平板培養(yǎng)基組成中2-脫氧葡萄糖含量?jī)?yōu)選0.05%。本發(fā)明主要是促進(jìn)甘油的代謝來降低甘油的含量，S卩加速甘油合成的逆反應(yīng)的速率，主要通過提高甘油激酶或者以FAD+為輔酶的3-磷酸甘油脫氫酶的活性。本發(fā)明所設(shè)計(jì)的平板培養(yǎng)基中對(duì)篩選最重要的成分是甘油和2-脫氧葡萄糖。從甘油的代謝途徑可以知道，甘油在甘油激酶的作用下生成3-磷酸甘油，再在以FAD+為輔酶的3-磷酸甘油脫氫酶作用下轉(zhuǎn)化成磷酸二羥基丙酮。當(dāng)以FAD+為輔酶的3-磷酸甘油脫氫酶的活性較弱時(shí)，甘油轉(zhuǎn)化成磷酸二羥基丙酮的反應(yīng)會(huì)減弱，從而會(huì)使甘油產(chǎn)量增加。而這種酶沒有活性的菌株在以2%的甘油為唯一碳源中是無法生長的。因此，凡能在以2%甘油為唯一碳源的環(huán)境中生長的菌株的3-磷酸甘油脫氫酶(FAD+)具有酶活，甘油合成逆反應(yīng)可以發(fā)生，即甘油可以代謝形成磷酸二羥基丙酮(DHAP)，且菌落較大的酶活性較強(qiáng)、逆反應(yīng)較快。而在以甘油為唯一碳源的培養(yǎng)集中添加2-脫氧葡萄糖主要的思路是2-脫氧葡萄糖是葡萄糖的結(jié)構(gòu)類似物，不能為菌株所利用，但可以抑制菌株利用甘油，其機(jī)理是葡萄糖對(duì)甘油激酶和以FAD+為輔酶的3-磷酸甘油脫氫酶的活性具有抑制作用，因此通過含有2-脫氧葡萄糖的甘油為唯一碳源的平板，可以獲得葡萄糖抑制作用解除或減弱，利用甘油的代謝通量增大的突變株，從而獲得甘油殘留量低的突變菌株。本發(fā)明選擇高效液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)發(fā)酵液中甘油的含量。色譜條件分析柱HypersilNH2柱，250mmX4.6mm，粒度5um流速1.Oml/min淋洗液70:30的乙腈水示差折光檢測(cè)器柱溫40。C有益效果本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于對(duì)甘油代謝途徑加以控制以減少其生成量，使篩選具有一定的定向性，改變了常規(guī)篩選方法的盲目性，使工作量大大減少，篩選效果大大提高。本發(fā)明利用特殊的平板培養(yǎng)基培養(yǎng)誘變后的菌液，能在此平板上生長的菌株發(fā)酵產(chǎn)生甘油的能力較弱，接種麥汁進(jìn)行發(fā)酵，與出發(fā)菌株相比，發(fā)酵液中甘油含量降低的概率會(huì)大大提高，篩選效果遠(yuǎn)大于常規(guī)的篩選方法。具體實(shí)施方法下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，其目的是更好的理解本發(fā)明的內(nèi)容；但不以本實(shí)施例對(duì)發(fā)明造成限制。例1取以下原料配成培養(yǎng)基甘油2%，2-脫氧葡萄糖0.05%，瓊脂2%，4酵母粉1%，蛋白胨1%，其余用蒸餾水補(bǔ)足。培養(yǎng)基滅菌后取1215mL裝入平板中，使培養(yǎng)基分布均勻。使用甲基磺酸乙酯誘變出發(fā)菌株，取誘變后的濃度為10—^l—1菌懸液0.2mL，涂布于平板上，2『C培養(yǎng)，可發(fā)現(xiàn)平板上長出白色菌落。其中菌落較大、邊緣整齊的菌株即可視為產(chǎn)甘油能力較弱，將之與出發(fā)菌株的菌落相比，菌落大于出發(fā)菌株的菌可被視為低產(chǎn)甘油的菌株。挑取菌落大于出發(fā)菌株的10株菌株轉(zhuǎn)接到斜面上，28t:恒溫培養(yǎng)。取10mL麥汁于試管中，滅菌后接入斜面菌種(包括出發(fā)菌株)，2『C恒溫培養(yǎng)24h，進(jìn)行菌種活化；在500mL三角瓶中裝入200mL麥汁，滅菌后接入活化的菌種，12。C恒溫培養(yǎng)8天。為了保證菌株的穩(wěn)定性，連續(xù)做三批，取發(fā)酵液，測(cè)定其甘油含量。甘油產(chǎn)量(mg/L)出發(fā)菌株12345678910甘油含量數(shù)據(jù)反映了從本發(fā)明所設(shè)計(jì)平板上挑取的菌落大于出發(fā)菌株的菌株發(fā)酵產(chǎn)生的甘油量都低于出發(fā)菌株，即正突變率達(dá)到100%，且較穩(wěn)定，其中菌株1、2、4、5、6、7、9、10的甘油含量遠(yuǎn)低于出發(fā)菌株，降低率在10%以上。甘油降低達(dá)到100%，有效率達(dá)80%。這說明運(yùn)用本發(fā)明可使篩選低產(chǎn)甘油啤酒酵母具有一定的定向性，減少篩選盲目性，減少工作量，提高篩選效果。本例出發(fā)菌株為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)Z5，CGMCCNo3218。<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>權(quán)利要求一種低產(chǎn)甘油啤酒酵母的平板篩選方法，包括如下步驟酵母菌株經(jīng)物理或化學(xué)誘變后，稀釋涂布于平板培養(yǎng)基，挑選菌落比出發(fā)菌株菌落大的誘變菌株；所述平板培養(yǎng)基組成為甘油1-3％，2-脫氧葡萄糖0.03-0.08％，瓊脂2％，酵母粉1％，蛋白胨1％，其余為水。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種低產(chǎn)甘油啤酒酵母的篩選方法，其特征在于所述物理或化學(xué)誘變包括甲基磺酸乙酯誘變。3.—種平板培養(yǎng)基，其特征在于所述培養(yǎng)基組成如下甘油1-3%，2-脫氧葡萄糖0.03-0.08%，瓊脂2%，酵母粉1%，蛋白胨1%，其余為水。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的平板培養(yǎng)基，其特征在于所述培養(yǎng)基中甘油含量為2%。5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的平板培養(yǎng)基，其特征在于所述培養(yǎng)基中2-脫氧葡萄糖含量為0.05%。全文摘要本發(fā)明公開了利用平板培養(yǎng)基篩選低產(chǎn)甘油啤酒酵母的方法。該方法采用啤酒酵母為出發(fā)菌株，經(jīng)化學(xué)誘變劑甲基磺酸乙酯誘變后，涂布到所設(shè)計(jì)的平板上，培養(yǎng)2～3天后，接種在麥汁中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是平板以甘油為唯一碳源，并加入2-脫氧葡萄糖，能在平板上生長的菌株產(chǎn)生的甘油量較低，且比出發(fā)菌株甘油含量低的概率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于常規(guī)的篩選方法，使得篩選具有一定的定向性，減少了篩選菌株的工作量。文檔編號(hào)C12N15/01GK101736002SQ20101003369公開日2010年6月16日申請(qǐng)日期2010年1月11日優(yōu)先權(quán)日2010年1月11日發(fā)明者劉楊,張五九,李紅申請(qǐng)人:中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院