專利名稱：用于對單個細(xì)胞所具有的細(xì)胞毒性進(jìn)行評價的組合物以及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種用于對發(fā)生在靶點與效應(yīng)器細(xì)胞對之間的相互作用進(jìn)行分析的方法，所述的方法利用高通量的篩選方法，用以對微陣列中的大量的單個細(xì)胞進(jìn)行描述。
背景技術(shù)：
盡管已經(jīng)對發(fā)生在人類與所述的1型人類免疫缺陷病毒(HIV-I)之間的相互作用進(jìn)行了超過二十五年的研究，人類免疫缺陷病毒(HIV)/獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)仍然是全球健康的最為盛行的威脅之一。目前的評估表明，它將成為接下來的二十年內(nèi)世界范圍內(nèi)的死亡率的第三大重要誘因，位列于癌癥以及心血管疾病之后。目前仍然沒有研發(fā)出一種能夠預(yù)防感染或者引發(fā)天然機(jī)制用以對所述的疾病進(jìn)行控制的疫苗。單純利用現(xiàn)有的分析工具并不足以能夠?qū)δ切┡c所述的免疫系統(tǒng)細(xì)胞相關(guān)的至關(guān)重要的特征進(jìn)行定義， 其中所述的免疫系統(tǒng)細(xì)胞能夠提供有效的針對所述病毒的保護(hù)性的免疫力。例如流式細(xì)胞術(shù)以及免疫吸附檢測(酶聯(lián)免疫斑點檢測ELISpot，酶聯(lián)免疫吸附檢測ELISA)這樣的技術(shù)能夠?qū)?xì)胞群體進(jìn)行評價，但是對于稀少的事件而言具有差的敏感度。其他的重要功能，例如細(xì)胞毒性以及增殖作用，目前僅僅能夠被進(jìn)行批量的測量。同樣的，如果在可能的情況下，這樣的局限性使得以足夠的清楚度對所述的人類免疫應(yīng)答進(jìn)行評價是困難的，其中所述的人類免疫應(yīng)答是針對人類免疫缺陷病毒(HIV)而產(chǎn)生的，對于應(yīng)答所進(jìn)行的評價的目的在于確定保護(hù)作用的相關(guān)性。這樣一來，迫切的需要一種新的方法，用以對針對病毒的保護(hù)性免疫力進(jìn)行分析，其中所述的病毒例如是人類免疫缺陷病毒(HIV)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了用以識別CD8+細(xì)胞的方法，所述的CD8+細(xì)胞能夠?qū)λ拗黧w內(nèi)的 CD4+人類免疫缺陷病毒(HIV)感染型細(xì)胞進(jìn)行溶解，所述的方法是通過下述方式來實現(xiàn)的提供一種效應(yīng)器CD8+細(xì)胞以及來自于宿主的靶向細(xì)胞的懸浮液，其中所述的懸浮液被沉積于一種可模壓成型的平板之上，所述的平板上含有至少一個存在于微孔陣列之中的微孔，其中在所述的微孔陣列中的至少一個微孔中含有一個效應(yīng)器細(xì)胞；在允許利用所述的 CD8+細(xì)胞對所述的靶向細(xì)胞進(jìn)行溶解的條件下對所述的懸浮液進(jìn)行培養(yǎng)；對利用所述的效應(yīng)器細(xì)胞對所述的靶向細(xì)胞所產(chǎn)生的溶解進(jìn)行檢測，并且識別出那些能夠?qū)D4+人類免疫缺陷病毒(HIV)感染型細(xì)胞進(jìn)行溶解的CD8+細(xì)胞。任選的，對能夠使所述的靶向細(xì)胞發(fā)生溶解的效應(yīng)器細(xì)胞進(jìn)行回收。優(yōu)選的，對上述回收的效應(yīng)器細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，其中所述的效應(yīng)器細(xì)胞對所述的靶向細(xì)胞進(jìn)行了溶解。在一個方面，在將細(xì)胞沉積于所述的微孔內(nèi)之前對所述的效應(yīng)器細(xì)胞以及靶向細(xì)胞進(jìn)行混合?；蛘呖晒┻x擇的，在將細(xì)胞沉積于所述的微孔內(nèi)之后對所述的效應(yīng)器細(xì)胞以及靶向細(xì)胞進(jìn)行混合。通過對一種被標(biāo)記的細(xì)胞所具有的熒光性的變化進(jìn)行監(jiān)測的方式對溶解作用進(jìn)行檢測?；蛘呖晒┻x擇的，通過對所述的靶向細(xì)胞所具有的細(xì)胞內(nèi)的鈣的水平的變化進(jìn)行監(jiān)測的方式對溶解作用進(jìn)行檢測。利用一種鈣敏感性的熒光素染料對所述的鈣進(jìn)行檢測。優(yōu)選的，所述的鈣敏感性熒光素染料是Fura 2AM (Invitrogen)。在一個方面，將所述的微孔陣列與一種底物進(jìn)行接觸，其中利用至少一種試劑對所述的底物進(jìn)行了預(yù)處理，此后利用所述的試劑進(jìn)行檢測，其中所述的試劑能夠特異性的檢測出所述的效應(yīng)器細(xì)胞的一種產(chǎn)物。所述的試劑是一種抗體，細(xì)胞因子，或者是溶解作用的可溶性的調(diào)節(jié)劑。優(yōu)選的，所述的細(xì)胞因子是腫瘤壞死因子-α (TNF-α)或者干擾素-Y (IFN-Y)。任選的，所述的溶解作用的可溶性調(diào)節(jié)劑是端粒酶B(feB)或者穿孔蛋白。 本發(fā)明所述的方法中任選的進(jìn)一步包括利用CD69對一種效應(yīng)器細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。本發(fā)明同樣提供了一種對宿主體內(nèi)的抗體應(yīng)答進(jìn)行鑒定的方法，所述的方法是通過下述方式來實現(xiàn)的提供一種來自于宿主的B細(xì)胞懸浮液，其中所述的懸浮液被沉積于一種可模壓成型的平板之上，所述的平板上含有存在于一個微孔陣列之中的至少一個微孔，其中所述的宿主感染有人類免疫缺陷病毒(HIV)，或者所述的宿主被懷疑感染了人類免疫缺陷病毒(HIV)，并且其中存在于所述的微孔陣列之中的至少一個微孔內(nèi)含有一個單個的細(xì)胞；將所述的微孔陣列與一種底物進(jìn)行接觸，其中利用至少一種B細(xì)胞檢測試劑對所述的底物進(jìn)行了預(yù)處理；并且對所述的試劑進(jìn)行檢測，從而對所述的抗體應(yīng)答進(jìn)行鑒定。優(yōu)選的，所述的B細(xì)胞檢測試劑是一種對糖蛋白(gp) 120中的一個表位具有特異性的抗體。在一個方面，本發(fā)明所述的方法中進(jìn)一步的包括將所述的微孔陣列與第二種底物進(jìn)行接觸，其中利用至少第一種B細(xì)胞檢測試劑對所述的底物進(jìn)行了預(yù)處理。任選的，所述的第一種B細(xì)胞檢測試劑是一種針對人類免疫缺陷病毒(HIV)糖蛋白(gp) 120的抗體。優(yōu)選的，所述的抗體作用的是所述的人類免疫缺陷病毒(HIV)糖蛋白(gp) 120的所述C-末端。在一個方面，對由存在于所述的微孔陣列之中的所述B細(xì)胞生成的所述抗體的同型體進(jìn)行測定。任選的對所述的B細(xì)胞進(jìn)行分離，其中所述的B細(xì)胞能夠表達(dá)一種與人類免疫缺陷病毒(HIV)發(fā)生反應(yīng)的抗體。在另外一個方面，對所述抗體所具有的輕鏈以及重鏈可變區(qū)域進(jìn)行了分離以及擴(kuò)增。所述的B細(xì)胞被任選的暴露于一種試劑之下，其中所述的試劑能夠刺激存在于所述的細(xì)胞之中的抗體的生成。優(yōu)選的，所述的試劑是CD40L或者是一種抗-B細(xì)胞抗原受體(BCR)抗體。在另外一個方面，所述的B細(xì)胞被暴露于CD40L以及抗-B 細(xì)胞抗原受體(BCR)抗體之下。本發(fā)明同樣提供了用以鑒定B細(xì)胞與多種人類免疫缺陷病毒(HIV)分離物之間的交叉反應(yīng)性的方法，所述的方法是通過下述方式來實現(xiàn)的提供一種來自于宿主的B細(xì)胞懸浮液，其中所述的懸浮液被沉積于一種可模壓成型的平板之上，所述的平板上含有存在于一個微孔陣列之中的至少一個微孔，其中所述的宿主感染有人類免疫缺陷病毒(HIV)，或者所述的宿主被懷疑感染了人類免疫缺陷病毒(HIV)，并且其中存在于所述的微孔陣列之中的至少一個微孔內(nèi)含有一個單個的細(xì)胞；將所述的微孔陣列與第一種底物進(jìn)行接觸，其中利用由存在于所述的至少一個微孔中的所述B細(xì)胞生成的抗體對所述的底物進(jìn)行了預(yù)處理；將所述的底物與第一種經(jīng)過標(biāo)記的人類免疫缺陷病毒(HIV)病毒體以及第二種經(jīng)過標(biāo)記的人類免疫缺陷病毒(HIV)病毒體進(jìn)行接觸；并且確定所述的第一種經(jīng)過標(biāo)記的病毒體以及第二種經(jīng)過標(biāo)記的病毒體是否與所述的抗體進(jìn)行了結(jié)合，其中所述的抗體是由在所述的微孔中的相同細(xì)胞生成的。任選的，對生成抗體的所述的B細(xì)胞進(jìn)行回收，其中所述的抗體能夠與所述的第一種經(jīng)過標(biāo)記的病毒體以及第二種經(jīng)過標(biāo)記的病毒體發(fā)生特異性的結(jié)合。在一個方面，對上述回收到的B細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。優(yōu)選的，所述的病毒體中的至少一種是經(jīng)過標(biāo)記的?；蛘呖晒┻x擇的，所述的第一種病毒體以及第二種病毒體被進(jìn)行了截然不同的標(biāo)記，即，利用不同的可檢測性的標(biāo)記物對它們進(jìn)行了標(biāo)記。本發(fā)明同樣提供了用以生成效應(yīng)器細(xì)胞的功能曲線的方法，其中所述的效應(yīng)器細(xì)胞能夠?qū)λ拗黧w內(nèi)的一種人類免疫缺陷病毒(HIV)感染產(chǎn)生應(yīng)答，所述的方法是通過下述方式來實現(xiàn)的提供一種效應(yīng)器細(xì)胞群體，所述的效應(yīng)器細(xì)胞選自由下述細(xì)胞所組成的組中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)(⑶8+)，天然殺傷(NK)細(xì)胞(⑶16+)，天然殺傷(NK)T細(xì)胞(raid+，V α M+)，或者Y δΤ細(xì)胞(V γ 9+，V δ 2+)，其中所述的效應(yīng)器細(xì)胞是從宿主處獲得的，將所述的效應(yīng)器細(xì)胞沉積于一種可模壓成型的平板之上，所述的平板上含有存在于一個微孔陣列之中的至少一個微孔，其中存在于所述的微孔陣列之中的至少一個微孔內(nèi)含有一個單個的效應(yīng)器細(xì)胞，其中將所述的效應(yīng)器細(xì)胞群體與一種同源的靶向細(xì)胞群體一同進(jìn)行裝載；對所述的效應(yīng)器細(xì)胞進(jìn)行可視化處理；對所述的效應(yīng)器細(xì)胞所具有的細(xì)胞毒性進(jìn)行評價；將所述的微孔陣列與第一種底物進(jìn)行接觸，其中利用一種試劑對所述的底物進(jìn)行了預(yù)處理，所述的試劑能夠?qū)Π准?xì)胞介素-2(IL1)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)、白細(xì)胞介素-10 (IL-10)、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、以及干擾素-γ (IFN-y )中的一種或者多種進(jìn)行特異性的檢測；并且確定存在于所述的微孔之中的效應(yīng)器細(xì)胞是否與所述的一種或者多種試劑進(jìn)行了結(jié)合。在一個方面，所述的細(xì)胞毒性是通過檢測鈣黃綠素AM(Calcein AM)的釋放的方式來進(jìn)行評價的。任選的，利用一種或者多種特異性的表面標(biāo)記物蛋白質(zhì)對所述的細(xì)胞進(jìn)行了標(biāo)記。優(yōu)選的，所述的表面標(biāo)記物蛋白質(zhì)是CD62L，趨化因子受體3(CXCR3)， 趨化因子受體4 (CCR4)，或者趨化因子受體7 (CCR7)。在另外一個方面，從一個或者多個微孔中進(jìn)行效應(yīng)器細(xì)胞的回收。任選的，對上述回收的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)從而獲得所述的回收細(xì)胞的克隆性的擴(kuò)增。任選的對存在于所述的回收細(xì)胞之中的一種或者多種基因的表達(dá)進(jìn)行鑒定。所述的被回收的細(xì)胞優(yōu)選是CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)，天然殺傷(NK)細(xì)胞，天然殺傷(NK) T細(xì)胞，或者γ δ T細(xì)胞。在另外一個方面，所述的宿主是一種處于急性階段的感染，一種高度活躍的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(HAART)宿主，或者是一種杰出的控制者(elite controller) 0本發(fā)明同樣提供了用以對宿主體內(nèi)的一種先天性免疫應(yīng)答進(jìn)行評價的方法，其中所述的免疫應(yīng)答針對的是一種人類免疫缺陷病毒(HIV)感染，所述的方法是通過下述方式來實現(xiàn)的提供一種來自于宿主的天然殺傷(NK)細(xì)胞懸浮液，其中所述的懸浮液被沉積于一種可模壓成型的平板之上，所述的平板上含有存在于一個微孔陣列之中的至少一個微孔，其中所述的宿主感染有人類免疫缺陷病毒(HIV)，或者所述的宿主被懷疑感染了人類免疫缺陷病毒(HIV)，并且其中存在于所述的微孔陣列之中的至少一個微孔內(nèi)沉積有一個單個的細(xì)胞；并且將所述的微孔陣列與一種底物進(jìn)行接觸，其中利用至少一種天然殺傷(NK) 細(xì)胞檢測試劑對所述的底物進(jìn)行了預(yù)處理；并且對所述的試劑進(jìn)行檢測，從而對天然殺傷 (NK)細(xì)胞進(jìn)行檢測并且對所述的先天性免疫應(yīng)答進(jìn)行評價。在一個方面，使用NKp4-Cy3、 CD107a-Alexa647、和/或CD69-Alexa488對所述的天然殺傷(NK)細(xì)胞進(jìn)行檢測。所述的天然殺傷(NK)細(xì)胞檢測試劑能夠?qū)μ烊粴?NK)細(xì)胞進(jìn)行檢測。在被沉積在所述的可模壓成型的平板上之前，任選的對所述的細(xì)胞進(jìn)行共同培養(yǎng)。優(yōu)選的，利用白細(xì)胞介素-12(IL-12)以及白細(xì)胞介素-18(IL-18)對所述的細(xì)胞進(jìn)行共同培養(yǎng)。
本發(fā)明同樣提供了用以對天然殺傷(NK)細(xì)胞群體中的克隆多樣性進(jìn)行評價的方法，所述的方法是通過下述方式來實現(xiàn)的提供一種天然殺傷(NK)細(xì)胞以及來自于宿主的靶向細(xì)胞的懸浮液，其中所述的懸浮液被沉積于一種可模壓成型的平板之上，所述的平板上含有至少一個存在于微孔陣列之中的微孔，其中在所述的微孔陣列中的至少一個微孔中含有一個單個的效應(yīng)器細(xì)胞；在允許利用所述的天然殺傷(NK)細(xì)胞對所述的靶向細(xì)胞進(jìn)行溶解的條件下對所述的懸浮液進(jìn)行培養(yǎng)；對利用所述的效應(yīng)器細(xì)胞對所述的靶向細(xì)胞所產(chǎn)生的溶解進(jìn)行檢測，并且對所述的效應(yīng)器細(xì)胞進(jìn)行識別，從而對存在于所述的天然殺傷 (NK)細(xì)胞群體中的克隆多樣性進(jìn)行評價。在一個方面，對能夠使所述的靶向細(xì)胞發(fā)生溶解的效應(yīng)器細(xì)胞進(jìn)行回收并且任選的對其進(jìn)行培養(yǎng)。在另外一個方面，對已經(jīng)使所述的靶向細(xì)胞發(fā)生溶解的天然殺傷(NK)細(xì)胞進(jìn)行回收。任選的，在將細(xì)胞沉積于所述的微孔內(nèi)之前對所述的天然殺傷(NK)細(xì)胞以及靶向細(xì)胞進(jìn)行混合?；蛘呖晒┻x擇的，在將細(xì)胞沉積于所述的微孔內(nèi)之后對所述的天然殺傷(NK)細(xì)胞以及靶向細(xì)胞進(jìn)行混合。在一個方面，通過對一種被標(biāo)記的細(xì)胞所具有的熒光性的變化進(jìn)行監(jiān)測的方式對溶解作用進(jìn)行檢測。在另外一個方面，對已經(jīng)使所述的靶向細(xì)胞發(fā)生溶解的天然殺傷(NK)細(xì)胞進(jìn)行分離并且對存在于所述的天然殺傷(NK)細(xì)胞之上的殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(KIR)基因進(jìn)行檢測。所述的微孔陣列任選的與一種底物進(jìn)行了接觸，其中利用至少一種試劑對所述的底物進(jìn)行了預(yù)處理，所述的試劑能夠特異性的檢測出所述的天然殺傷(NK)細(xì)胞的一種產(chǎn)物；并且對所述的試劑進(jìn)行檢測。所述的試劑是一種抗體，細(xì)胞因子，或者是溶解作用的可溶性的調(diào)節(jié)劑。 優(yōu)選的，所述的細(xì)胞因子是腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、以及干擾素-γ (IFN-γ )。本發(fā)明同樣提供了用以對天然殺傷(NK)細(xì)胞以及B細(xì)胞群體中的多樣性進(jìn)行評價的方法，所述的方法是通過下述方式來實現(xiàn)的提供一種細(xì)胞懸浮液，所述的懸浮液中包括擴(kuò)展的人類免疫缺陷病毒(HIV)感染型CD4+細(xì)胞T細(xì)胞，活化的天然殺傷(NK)細(xì)胞，以及B細(xì)胞和靶向細(xì)胞，其中所述的懸浮液被沉積在一種可模壓成型的平板之上，在所述的平板上含有存在于微孔陣列中的至少一個微孔，其中存在于所述的微孔陣列之中的至少一個微孔中含有一個單個的T細(xì)胞；在允許所述的抗體與T細(xì)胞的表面進(jìn)行結(jié)合的條件下對細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，其中所述的抗體是由B細(xì)胞生成的；對含有B細(xì)胞、天然殺傷(NK)細(xì)胞、以及溶解的T細(xì)胞的孔進(jìn)行識別，并且對B細(xì)胞或者天然殺傷(NK)細(xì)胞進(jìn)行識別。在一個方面，利用白細(xì)胞介素-2(IL1)對所述的天然殺傷(NK)細(xì)胞進(jìn)行活化。在另外一個方面，利用CD40L或者抗-B細(xì)胞抗原受體(BCR)對所述的B細(xì)胞進(jìn)行活化。在另外一個方面，利用一種抗-B細(xì)胞抗原受體(BCR)抗體的CD40L對所述的B細(xì)胞進(jìn)行活化。任選的，從所述的孔中對所述的B細(xì)胞或者天然殺傷(NK)細(xì)胞進(jìn)行回收；并且對所述的B細(xì)胞所具有的一種或者多種性質(zhì)進(jìn)行鑒定。在另外一個方面，對存在于所述的B細(xì)胞之中的抗體基因進(jìn)行鑒定。任選的對存在于所述的B細(xì)胞之中的編碼抗體的基因所具有的VDJ區(qū)域進(jìn)行分析。 在允許抗體與所述的底物進(jìn)行連接的條件下任選的將所述的微孔陣列與一種底物進(jìn)行接觸，其中所述的抗體是有所述的B細(xì)胞生成的。在另外一個方面，將所述的底物與來自于一個人類免疫缺陷病毒(HIV)感染型細(xì)胞的溶解產(chǎn)物進(jìn)行接觸，并且對含有由B細(xì)胞生成的抗體的孔進(jìn)行識別，其中所述的抗體與所述的人類免疫缺陷病毒(HIV)溶解產(chǎn)物或者一種抗-免疫球蛋白G3抗體進(jìn)行了結(jié)合。優(yōu)選的，對含有B細(xì)胞生成的抗體的孔進(jìn)行了識別， 其中所述的抗體與所述的人類免疫缺陷病毒(HIV)溶解產(chǎn)物或者抗-免疫球蛋白G3抗體進(jìn)行了結(jié)合。通過下述對于優(yōu)選實施方式的描述，并且通過下述的權(quán)利要求，本發(fā)明所具有的其他的特征以及優(yōu)點將變得顯而易見。除非另外定義，在本發(fā)明中所使用的所有的技術(shù)術(shù)語以及科學(xué)術(shù)語將具有與發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員普遍理解的含義相同的含義。 盡管那些與本發(fā)明中所描述的相類似或者相等價的方法以及材料可以被用來進(jìn)行本發(fā)明的實踐或者測試，但在下文中對適合的方法以及材料進(jìn)行了描述。在本發(fā)明中提及的所有的公開出版物、專利申請、專利、以及其他的參考文獻(xiàn)中的全部內(nèi)容被引入作為參考。如果遇到矛盾，本說明書，包括定義，將占主導(dǎo)地位。除此之外，所述的材料、方法、以及實施例僅僅是描述性的并且并不意在構(gòu)成限制。本發(fā)明所具有的其他的特征以及優(yōu)點將通過下面詳細(xì)描述的說明書以及權(quán)利要求而變得顯而易見。


附圖1是一種檢測方案的圖示。將所述的細(xì)胞，經(jīng)過熒光素標(biāo)記的靶向(利用鈣黃綠素進(jìn)行了染色，綠色)以及效應(yīng)器(利用a-CD8抗原呈遞細(xì)胞(APC)進(jìn)行了染色，粉色)裝載在大約30微摩的微孔陣列之中并且利用熒光顯微鏡對其進(jìn)行了成像。在此之后利用玻璃蓋玻片對所述的微孔陣列進(jìn)行了覆蓋并且在37°C、5%的二氧化碳條件下進(jìn)行了 2-6小時的培養(yǎng)，其中利用捕獲抗體對所述的玻璃蓋玻片進(jìn)行了預(yù)先的官能團(tuán)化。經(jīng)過培養(yǎng)之后，使用特異性的熒光素抗體對存在于所述的玻璃蓋玻片之上的分泌出的細(xì)胞因子進(jìn)行檢測，并且利用缺乏熒光性的特性對由特異性的效應(yīng)器所溶解的靶向進(jìn)行成像(孔1)。在僅僅含有靶向細(xì)胞的微孔中(孔幻以及在含有不能夠溶解所述的靶向的效應(yīng)器的微孔中 (孔幻，所述的靶向所具有的熒光性應(yīng)當(dāng)僅僅發(fā)生了非常微小的變化。附圖2是經(jīng)過標(biāo)記的靶向以及效應(yīng)器的一系列代表性的熒光成像，所述的成像發(fā)生在培養(yǎng)之前以及培養(yǎng)之后(0小時以及4小時)。(A)鈣黃綠素染色(綠色)，肽負(fù)載 (KKlO)的靶向(可以看到3個獨立的細(xì)胞)；(B)利用a-CDS-抗原呈遞細(xì)胞(APC)進(jìn)行標(biāo)記(粉色)的效應(yīng)器；(C)效應(yīng)器(粉色)以及未負(fù)載(沒有進(jìn)行KKlO肽的添加)的靶向(綠色)的共同培養(yǎng)物；(D)效應(yīng)器(粉色)以及負(fù)載有KKlO肽的靶向(綠色)的共同培養(yǎng)物。僅僅當(dāng)效應(yīng)器能夠?qū)ω?fù)載有肽的靶向進(jìn)行識別時，才會發(fā)生靶向的溶解(如D中所示)。附圖3是一組⑶4T細(xì)胞的熒光成像，其中利用一種表達(dá)NL4-3病毒的綠色熒光蛋白(GFP)對所述的T細(xì)胞進(jìn)行了感染。所述的綠色細(xì)胞標(biāo)記著感染。附圖4是一系列的熒光成像，表示的是人類免疫缺陷病毒(HIV)特異性CD8+T細(xì)胞克隆與B細(xì)胞的共同培養(yǎng)物，其中所述的B細(xì)胞負(fù)載有鈣黃綠素AM標(biāo)記的人類免疫缺陷病毒(HIV)肽。通過熒光素信號的損失標(biāo)記著由細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)介導(dǎo)的溶解作用。附圖5是一組熒光成像，表示的是抗原呈遞細(xì)胞(APC)標(biāo)記的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)(紅色)與鈣黃綠素AM標(biāo)記的B-細(xì)胞(綠色)的共同培養(yǎng)物。鈣黃綠素AM熒光性淬火代表的是由細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)介導(dǎo)的殺傷。附圖6是一幅示意圖，描述的是已經(jīng)使用一種微孔陣列研發(fā)出來的單細(xì)胞測量方
12法的程序。以串聯(lián)的方式或者以平行的方式對測量值進(jìn)行了連結(jié)。在每一個圖像中表示出來的方塊為50微米。附圖7是捕獲檢測的一種示意性的圖示，用來對細(xì)胞進(jìn)行識別，其中所述的細(xì)胞能夠識別出糖蛋白(gp) 120的CD4結(jié)合區(qū)域。在利用可溶性的CD4進(jìn)行阻滯之后，一個陣列的B細(xì)胞將被用來印染在(a)固定化的糖蛋白(gp) 120的表面之上，并且在此之后(b) 被印染在固定化的糖蛋白(gp)120的另外一個表面之上。附圖8是實驗設(shè)計的一種示意性的圖示，用來對來自于B細(xì)胞的人類抗體進(jìn)行識別，其中所述的抗體能夠結(jié)合多種人類免疫缺陷病毒(HIV)菌株。每一叢被捕獲的抗體(帶有顏色的)代表著所述的微陣列之中的一種元素，其中所述的元素與一個相對應(yīng)的微孔陣列中所容納的細(xì)胞相匹配。附圖9描述的是來自于單細(xì)胞數(shù)據(jù)的功能性曲線的構(gòu)建。對細(xì)胞群體進(jìn)行分揀并且對它們所具有的細(xì)胞毒性能力，它們的細(xì)胞因子曲線，以及表面標(biāo)記物進(jìn)行測量。這樣的地圖標(biāo)志著在所述的感染過程中所述的子集變化的頻率。CD4+T細(xì)胞的類似的曲線提供了用于所述的系統(tǒng)的狀態(tài)的參考點。附圖10表示的是凝膠，所述的凝膠描述的是單獨的B淋巴細(xì)胞進(jìn)行的簡并的逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)所得到的結(jié)果，其中所述的B細(xì)胞是從微孔中選出的。將B 細(xì)胞從一種血液樣本中被純化出來(通過磁性分選進(jìn)行的外周血單核細(xì)胞(PBMC)的被動選擇)并且被裝載于微孔之中。對來自于十二個微孔中的細(xì)胞進(jìn)行隨機(jī)的選擇，將其沉積于溶解緩沖液中，并且通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)對其進(jìn)行擴(kuò)增，其中使用到了一種用于所述的重鏈以及輕鏈的簡并的引物組。尋找到了七個蛋白質(zhì)序列并且將其在所述的凝膠之下被表示出來。
具體實施例方式為了設(shè)計出有效的疫苗以及治療方法，對人類免疫缺陷病毒(HIV)用以躲避免疫系統(tǒng)所使用到的機(jī)制進(jìn)行徹底的了解是至關(guān)重要的。對于未經(jīng)過治療的個體而言，所述的疾病的惡化是通過所述的病毒復(fù)制的持續(xù)以及所述的CD4+T細(xì)胞的損失來標(biāo)志的(參見 Kahn JO, Walker BD (于1998年)在N. Engl. J. Med.《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》339，33中發(fā)表的文章 Acute human immunodeficiency virus type I infection〈〈急性 I 型人類免疫缺陷病毒感染》；Hecht FM等人(于2002年)在AIDS《獲得性免疫缺陷綜合癥》16，1119中 ^ ! 勺文章 Use of laboratory tests and clinical symptoms for identification of primary HIV infection《實驗室測試以及臨床癥狀在識別原發(fā)性人類免疫缺陷病毒感染中的用途》)。病毒特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)在控制持續(xù)性的復(fù)制作用中起到了顯著的作用并且所述的人類免疫缺陷病毒-I(HIV-I)特異性CD8+T細(xì)胞的最初的出現(xiàn)已經(jīng)表明能夠減少病毒的負(fù)載(參見Altfeld M等人(于2006年)在PloS. Med.《藥物科學(xué)公共圖書館》3(10)，1851 中發(fā)表的文章 HLA Alleles Associated with delayed progression to AID S contribute strongly to the initial CD8+T cell response against HIV-I 《與獲得性免疫缺陷綜合癥的延遲惡化相關(guān)聯(lián)的人類白細(xì)胞抗原(HLA)等位基因強(qiáng)烈的促進(jìn)了初始的CD8+T細(xì)胞針對人類免疫缺陷病毒-1的應(yīng)答》)。然而，這種病毒復(fù)制作用的減少在絕大多數(shù)的個體中(惡化者)是暫時性的。一群非常小的子集的個體被稱呼為低水平病毒載量長期不惡化(LTNP)的杰出的控制者(elite controller)，他們在很長的時間段內(nèi)保持著低的病毒臨界值并且在這些個體中識別出的所述的病毒特異性CD8+T細(xì)胞已經(jīng)表現(xiàn)出具有更高的增殖能力，這種更高的增殖能力是相較于從惡化者處分離出的相同細(xì)胞而言的(參見Migueles SA等人(于2002年)在Nat. Immun.《自然免疫學(xué)》3 (11)， 1061 中發(fā)表的文章 HIV-specific CD8+T cell proliferation is coupled to perforin expression and is maintained in nonprogessors 〈〈人類免疫缺 1 !病毒特異個生 CD8+T 細(xì)胞的增殖作用與穿孔蛋白的表達(dá)所發(fā)生的連結(jié)及其在非惡化者中的保持》)。在這里所描述的本發(fā)明之前，在對存在于一種病原體與所述的人類免疫系統(tǒng)之間的相互作用進(jìn)行研究時，存在兩個內(nèi)在固有的挑戰(zhàn)1)在大多數(shù)的臨床樣本中可以利用的所述細(xì)胞的數(shù)量通常是非常有限的；以及2)獨特的克隆物，例如病原體特異性B細(xì)胞或者 T細(xì)胞，是稀少的。現(xiàn)有的分析工具同樣不足以能夠?qū)⒍喾N特征(血統(tǒng)，功能，基因型)同時分配到同一個個體細(xì)胞中去。例如，流式細(xì)胞術(shù)是一種常見的技術(shù)，被用來對單個細(xì)胞的群體進(jìn)行評價，評價表面表達(dá)的表型標(biāo)記物，但是對細(xì)胞因子曲線所進(jìn)行的分析，則需要對所述的細(xì)胞進(jìn)行固定化以及滲透，其中所述的細(xì)胞因子曲線標(biāo)志著某些功能性的表型。這種存活能力的喪失意味著不能夠直接的對另外的功能性特征例如細(xì)胞毒性進(jìn)行評價，并且遺傳學(xué)分析同樣通常受到阻礙。因此，在這里所描述的本發(fā)明之前，不可能明了的分清楚來自于所述的先天性免疫系統(tǒng)以及適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中的所述的細(xì)胞子集中存在的精確的異質(zhì)性，其中所述的免疫系統(tǒng)能夠?qū)σ环N特定的傳染性試劑產(chǎn)生應(yīng)答。針對所述的免疫系統(tǒng)的狀態(tài)建立一種綜合性的單幀采集同樣是困難的。這樣的曲線能夠提高對所述的機(jī)制所進(jìn)行的識別，其中所述的機(jī)制能夠提供針對某些病原體的保護(hù)作用以及用于健康應(yīng)答的診斷性指示劑。因此，本發(fā)明提供了新的技術(shù)，用以對許多個體細(xì)胞的血統(tǒng)、功能、以及表型進(jìn)行測量并且建立它們之間的關(guān)聯(lián)性，從而加強(qiáng)對存在于所述的人類免疫系統(tǒng)與目標(biāo)病原體之間的相互作用所進(jìn)行的研究，特別是針對人類免疫缺陷病毒(HIV)(參見Fauci，A. S.， Johnston, Μ. I.，Dieffenbach，C. W.，Burton，D. R.，Hammer, S. Μ.，Hoxie, J. Α.，Martin，M.， OverbaughiJ. ,WatkinsiD. I. ,MahmoudiA. & GreeneiW. C.(于 2008 年)在 kience《科學(xué)》 321，530-532 中發(fā)表的文章 Perspective-HIV vaccine research :The way forward〈〈前進(jìn)之路的展望一人類免疫缺陷病毒疫苗的研究》)。本發(fā)明提供了這樣的方法以及組合物，用以對針對一種感染所產(chǎn)生的宿主免疫應(yīng)答進(jìn)行鑒定，包括由人類免疫缺陷病毒引起的感染?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的方法對微陣列以及平板進(jìn)行構(gòu)建，包括那些在PCT/US2006/036282 (
發(fā)明者B·居爾格, B·沃克, J·C·洛夫, N·范阮達(dá)若詹 申請人:綜合醫(yī)院公司附屬馬薩諸塞州綜合醫(yī)院, 麻省理工學(xué)院