專利名稱：具有提高的5’-黃苷一磷酸生產(chǎn)力的棒狀菌菌株和用其生產(chǎn)5’-黃苷一磷酸的方法
具有提高的5’-黃苷一磷酸生產(chǎn)力的棒狀菌菌株和用其生產(chǎn)5’ -黃苷一磷酸的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及重組載體，其具有

圖1的切割圖中顯示的結構，攜帶SEQ ID NO. 7的基因；和用該重組載體轉化的棒狀菌(Corynebacteria)菌株，其具有較內(nèi)源性蘋果酸脫氫酶更高的活性。本發(fā)明還與使用該棒狀菌菌株產(chǎn)生5’ -黃苷一磷酸的方法有關。
背景技術：
5’ -鳥苷一磷酸(在下文中被稱作“GMP”)是廣泛使用的作為增味劑的食品添加齊U，如同肌苷一磷酸(在下文中被稱作“IMP”)。GMP引出鮮味(umami taste)，其用途取決于也正被使用的谷氨酸一鈉(MSG)。它通常與IMP協(xié)同使用以增加MSG鮮味的強度。迄今已知的制備GMP的方法的實例包括(1)酵母RNA的酶促降解，(2)直接微生物發(fā)酵成GMP，C3)微生物發(fā)酵成鳥苷，然后化學磷酸化，(4)微生物發(fā)酵成鳥苷，然后酶促磷酸化，( 微生物發(fā)酵成黃苷5’ - 一磷酸(在下文中被稱作“XMP”)，然后通過棒狀菌菌株轉化成GMPdP (6)微生物發(fā)酵成XMP，然后通過具有氨基酶活性的大腸桿菌(Escherichia coli)將XMP轉化成GMP。其中，方法(1)具有材料供應的困難和在經(jīng)濟上不是有益的，方法 (2)由于GMP的膜通透性而遭受低產(chǎn)率的缺點。因此，其它方法在工業(yè)應用中廣泛使用。對于生產(chǎn)XMP并將其轉化成GMP的方法，關鍵是增加XMP生產(chǎn)力。例如，韓國專利申請?zhí)?0-1991-018016公開了能以高產(chǎn)率產(chǎn)生XMP的XMP氨基酶無活性的菌株，其是腺嘌呤和鳥嘌呤半營養(yǎng)缺陷型，耐受鳥苷類似物并對溶菌酶非常敏感，溶菌酶是破壞細胞壁的酶。韓國專利申請?zhí)?0-2001-000513公開了能在培養(yǎng)基中以高濃度直接積累XMP的產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)菌株和使用該菌株產(chǎn)生XMP的方法。菌株通過用UV光照射母體微生物、用誘變劑N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍(NTG)處理和選擇耐受正纈氨酸的突變體而制備，正纈氨酸是纈氨酸的類似物，影響XMP的生物合成。韓國專利申請?zhí)?0-2008-006537描述了增加XMP產(chǎn)率的方法，其中XMP的生物合成中涉及的基因purN 和purH被修飾。另一方面，ATP生產(chǎn)力導致XMP產(chǎn)生，因為XMP的生物合成中涉及ATP。同樣，蘋果酸脫氫酶的活性對ATP的產(chǎn)生具有很大影響。然而，前述文件中任何地方都沒有提及經(jīng)設計提高蘋果酸脫氫酶活性以增加XMP產(chǎn)率的微生物和方法?？紤]到增加產(chǎn)生XMP菌株的ATP生產(chǎn)力是重要的，本發(fā)明人進行了集中研究并發(fā)現(xiàn)了引起該增加的基因。并且發(fā)現(xiàn)用串聯(lián)攜帶該基因的兩個拷貝的重組載體轉化的棒狀菌菌株能以高產(chǎn)率產(chǎn)生XMP。

發(fā)明內(nèi)容技術問題因此本發(fā)明的目的是提供具有較內(nèi)源性蘋果酸脫氫酶更高活性的棒狀菌菌株。本發(fā)明的另一個目的是提供具有如圖1的切割圖中顯示的結構的重組載體，其攜帶SEQ ID NO. 7的基因。本發(fā)明另外的目的是提供用重組載體轉化的棒狀菌菌株。本發(fā)明還有另外的目的是提供通過培養(yǎng)轉化的微生物和從培養(yǎng)物獲得XMP而生產(chǎn)XMP的方法。技術方案根據(jù)其方面，本發(fā)明涉及比內(nèi)源蘋果酸脫氫酶活性增強的棒狀菌菌株。優(yōu)選地，將本發(fā)明的棒狀菌菌株修飾以具有較內(nèi)源活性更高的蘋果酸脫氫酶活性，導致XMP生產(chǎn)力的增加。術語“蘋果酸脫氫酶”，如本文所用，指通過脫氫催化蘋果酸鹽轉化成草酰乙酸鹽的酶。該酶伴隨乳酸脫氫酶在非常廣譜的活體生物中被發(fā)現(xiàn)，并且需要DPN和NAD作為其活性的輔因子，這些輔因子通常伴隨乳酸脫氫酶。在根據(jù)本發(fā)明的棒狀菌菌株中，將蘋果酸脫氫酶活性增加，從而以較高產(chǎn)率產(chǎn)生XMP。如本文所用，術語“內(nèi)源的活性”意欲指野生型微生物中的目標酶活性。術語“高于內(nèi)源的活性”指與內(nèi)源品種的活性相比增加的酶活性，不論起因于由酶自身引起的活性增加還是內(nèi)源基因或外源基因引起的活性增加。例如，酶活性增加可通過本領域公知的任何方法實現(xiàn)，包括但不限于，增加或減少基因拷貝數(shù)、替換、修飾或突變目標啟動子等。根據(jù)本發(fā)明所述的其活性將被增加的靶酶蘋果酸脫氫酶由棒狀菌的mqo基因編碼。只要它與mqo基因在生物學上相同或相應，任何衍生物或類似物可在本發(fā)明中使用。 即，如果它的活性與mqo基因的活性基本上相同或相似，落入mqo基因范圍內(nèi)的任何基因在本發(fā)明中都是有用的。有利地，在本發(fā)明中有用的基因與mqo基因的序列共享至少70%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少90%，甚至遠更優(yōu)選至少95%和最優(yōu)選至少98%同源性。 更有利地，蘋果酸脫氫酶由核苷酸序列SEQ ID NO. :7編碼?；蚩截惖脑黾幽芡ㄟ^外源基因的導入和/或內(nèi)源基因的擴增而達到?；蚩截悢?shù)目可容易地被本領域的技術人員根據(jù)需要和目的確定。內(nèi)源基因的擴增也能利用本領域已知的方法進行，例如，通過在壓力下在合適的選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在優(yōu)選的實施例中，將攜帶為蘋果酸脫氫酶編碼的基因的載體導入棒狀菌菌株以產(chǎn)生比內(nèi)源活性增強的轉化的微生物。只要其在本領域已知并屬于棒狀菌屬，任何菌株可毫無限制地在本發(fā)明中使用。優(yōu)選地，本發(fā)明中有用的棒狀菌菌株的實例包括產(chǎn)氨棒桿菌、谷氨酸棒狀桿菌 (Corynebacterium glutamicum)、黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)禾口乳酸發(fā)酵短桿菌(Brevikicterium lactofermentum)，但不限于此。具體地，這些棒狀菌菌株之中是產(chǎn)氨棒桿菌 ATCC6872、熱產(chǎn)氨棒狀桿菌(Corynebacterium thermoaminogenes) FERM BP-1539、 谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032、谷氨酸棒狀桿菌R、黃色短桿菌ATCC 14067、乳酸發(fā)酵短桿菌 ATCC 13869和其衍生物。優(yōu)選的是從產(chǎn)氨棒桿菌KCCM-10530轉化的產(chǎn)氨棒桿菌KCJ-1304。根據(jù)其另一個方面，本發(fā)明涉及具有如圖1的切割圖顯示的結構的重組載體，其攜帶SEQ ID N0. 7的基因。SEQ ID N0. 7的基因具有來自棒狀菌的mqo基因的野生型核苷酸序列。然而，顯然攜帶mqo基因的衍生物或類似物的重組載體在本發(fā)明中也是有用的，只要如上面所描述的，該衍生物或類似物與mqo基因在生物學上相同或相應。如本文所用，術語“mqo基因”、 簡稱“蘋果酸鹽醌氧化還原酶”基因，指為用作將蘋果酸鹽氧化成草酰乙酸鹽的蘋果酸鹽草酰乙酸鹽編碼的基因。在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明提供攜帶SEQ ID NO. 7的mqo基因的重組載體。 只要攜帶mqo基因，任何常見的重組載體均能沒有限制地在本發(fā)明中被使用。優(yōu)選的是 pDZ-mqo。在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，利用含有SEQ ID NO. 7的mqo基因以構建重組的 pDZ-mqo載體(參見圖1)。根據(jù)其另外的方面，本發(fā)明涉及用攜帶mqo基因的重組載體轉化的棒狀菌菌株。利用本領域已知的轉化方法可沒有限制地使用來自棒狀菌的mqo基因。優(yōu)選地， 將mqo基因克隆到載體中，以用于轉化到細胞中。如果在本領域已知，任何方法可用于轉化。如本文所用，術語“轉化”是由外源 DNA的攝取、基因組參入和表達引起的細胞的基因改造。典型的轉化方法包括CaCl2沉淀、 Hanahan法——其中與DMSO (二甲基亞砜)結合，CaCl2沉淀的作用得到提高、電穿孔、磷酸鈣轉染、原生質(zhì)體融合、碳化硅纖維介導的轉化、土壤桿菌(agrobacterium)介導的轉化、 PEG介導的轉化、葡聚糖硫酸酯、陽離子脂質(zhì)體(lipofectamine)和干燥/抑制介導的轉化 (desiccation/inhibition-mediated transformation)發(fā)明用 pDZ_mqo 白勺轉化不限于這些轉化的實例，而能沒有限制地通過使用本領域的任何方法完成。術語“載體”，如本文所用，指用作載體以將外源遺傳物質(zhì)轉移到合適宿主細胞中的DNA分子，是含有使轉基因與宿主基因組重組的調(diào)節(jié)元件的DNA構建物。優(yōu)選地，攜帶根據(jù)本發(fā)明的mqo載體的重組載體可具有圖1的切割圖顯示的結構。圖1的切割圖表示的載體可被依次或同時導入棒狀菌。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，將重組載體轉化到產(chǎn)氨棒桿菌KCCM-10530中，然后將該菌在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)以使mqo基因的兩個拷貝通過同源重組參入到宿主的基因組，導致產(chǎn)生產(chǎn)氨棒桿菌突變體，稱為產(chǎn)氨棒桿菌KCJ-1304。其以登錄號KCCM10972P保藏(韓國微生物保藏中心(韓國，首爾)，保藏日期2008年12月3日)。產(chǎn)氨棒桿菌KCJ-1304具有參入到KCCM-10530基因組的mqo基因的兩個拷貝，是由向其中導入具有圖1的切割圖顯示的結構的pDZ-mqo和mqo基因的兩個拷貝與內(nèi)源基因的同源重組而產(chǎn)生的。根據(jù)另外的方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生XMP的方法，包括培養(yǎng)轉化的棒狀菌菌株和從培養(yǎng)物中獲得XMP。在本發(fā)明中，通過轉化的微生物的直接發(fā)酵，以較高的產(chǎn)率生產(chǎn)XMP。優(yōu)選地，轉化的微生物是蘋果酸脫氫酶活性比內(nèi)源活性提高的棒狀菌菌株。重組載體的mqo 基因優(yōu)選地參入到轉化的微生物的基因組中，該微生物因此能以高產(chǎn)率產(chǎn)生XMP。在優(yōu)選的實施方式中，該微生物是產(chǎn)氨棒桿菌KCCM10972P。本領域已知的任何培養(yǎng)基可沒有限制地用于培養(yǎng)能產(chǎn)生XMP的菌株。優(yōu)選地，培養(yǎng)基含有葡萄糖作為碳源和任選地各種其它碳源。為了在培養(yǎng)目標微生物中使用，培養(yǎng)基必須滿足微生物生長的需求。用于棒狀菌菌株的培養(yǎng)基在本領域已知(例如Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D. C.，USA，1981)。對棒狀菌菌株有用的碳源的實例包括糖和碳水化合物諸如葡萄糖、蔗糖、 乳糖、果糖、麥芽糖、淀粉、纖維素等；油和脂類諸如大豆油、葵花子油、蓖麻油、椰子油等； 脂肪酸諸如棕櫚酸、硬脂酸、亞麻酸等；醇類諸如甘油、乙醇等；和有機酸諸如乙酸。這些碳源可單獨或組合使用。有機物諸如胨、酵母提取物、牛肉膏、麥芽汁、玉米漿、大豆等；尿素； 和無機化合物諸如氯化銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨可單獨或組合用作培養(yǎng)基中的氮源。磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀、或相應的鈉鹽可用作磷源。此外，培養(yǎng)基可含有金屬鹽諸如硫酸鎂、硫酸亞鐵(iron sulfate)等。另外，可需要氨基酸和/或維生素作為必需成分。培養(yǎng)基還可含有合適的前體。可以分批方式或連續(xù)方式將這些物質(zhì)加入到培養(yǎng)基中。可通過堿性化合物諸如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨等，或酸性化合物諸如磷酸或硫酸調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH。消泡劑諸如脂肪酸聚乙二醇酯可用于防止培養(yǎng)期間泡沫的產(chǎn)生?？捎醚鯕饣蚝醒鯕獾臍怏w(例如空氣)對培養(yǎng)基充氣以保持有氧狀態(tài)，或用氮氣、氫氣或二氧化碳氣體對培養(yǎng)基充氣以保持無氧狀態(tài)。培養(yǎng)溫度通常保持在20°C 45°C，優(yōu)選地在 30°C 35°C。持續(xù)培養(yǎng)直到獲得XMP的最大量。從這一點上，需要10至160小時的時間段。由此產(chǎn)生的5XMP可被分泌到培養(yǎng)基中或保持在細胞內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明的產(chǎn)生XMP 的方法包括從細胞或培養(yǎng)基中回收XMP。對于從細胞或培養(yǎng)基中回收XMP，可利用本領域公知的任何方法。這樣的方法的實例包括過濾、陽離子交換層析、結晶和HPLC，但不限于此。如本文所用，術語“5'-黃苷一磷酸”是核酸生物合成中的中間體，并在動物和植物中具有生理學重要性。因此，它被用于包括食品工業(yè)、制藥工業(yè)和醫(yī)學工業(yè)在內(nèi)的多個領域。黃苷一磷酸是食品添加劑，其被用作基于核酸的增味劑以提供蘑菇的味道，特別是與 MSG協(xié)同。XMP是嘌呤代謝中的中間體，從IMP形成，形成GMP。當使用根據(jù)本發(fā)明的轉化的微生物時，能以高產(chǎn)率產(chǎn)生XMP，該產(chǎn)率被發(fā)現(xiàn)與常規(guī)的微生物相比提高了約6%。發(fā)明的有益效果由于提高的蘋果酸脫氫酶活性，本發(fā)明的轉化的棒狀菌菌株以較常規(guī)的微生物更高的產(chǎn)率產(chǎn)生XMP。附圖簡述圖1是顯示重組載體pDZ-mqo的結構的示意圖，其中mqo基因的兩個拷貝被插入到pDZ載體中。發(fā)明的方式通過以下實施例可獲得對本發(fā)明的更好的理解，這些實施例被提出以進行舉例說明，但不是被解釋為限制本發(fā)明。實施例1 來自XMP的生產(chǎn)菌株產(chǎn)氨棒桿菌KCCM-10530的mqo的克隆和用于基因組參入的重組載體(pDZ-mqo)的構建mqo基因(NCBI ID_3345228)的核苷酸序列從來自NIH GenBank的數(shù)據(jù)獲得。基于該序列，合成兩對引物(SEQ ID N0S. 1至4)。當棒狀菌KCCM-10530的基因組充當模板時，在存在高保真性DNA聚合酶 PfuUltra (Stratagene)的情況下使用SEQ ID N0S. 1至4的引物進行PCR，在95°C變性 30sec、在55°C退火30sec和在68°C延伸2min，進行25個循環(huán)。由此獲得的PCR產(chǎn)物是mqo 基因的兩個拷貝，每個2. Ikb長(mq0-A、mq0-B)，它們分別使用SEQ ID NOS :1和2以及SEQ ID NOS 3和4兩組得到擴增。SEQ ID NO 1 ；gctctagaATCGGTCATTCCATGAACCCSEQ ID NO 2 ；cgcggatccCATCGATATCGCCAACTCCASEQ ID NO 3 ；cgcggatccATCGGTCATTCCATGAACCCSEQ ID NO 4 ；gctctagaCATCGATATCGCCAACTCCA
用合適的限制酶(mqo-A :XbaI+BamHI，mqo_B :BamHI+XbaI)處理之后，通過三重連接(three-piece junction)將PCR產(chǎn)物mqo-Α和mqo-Β插入到先前已被XbaI和蝦堿性磷酸酶處理的PDZ載體中(參見韓國專利申請?zhí)?0-2007-9443 。最后，獲得重組pDZ-mqo 載體，其中mqo基因的兩個拷貝被串聯(lián)克隆。圖1是顯示用于參入到棒狀菌基因組中的重組pDZ-mqo載體的結構示意圖。實施例2 插入mqo的菌株的產(chǎn)生將pDZ-mqo載體構建物轉化到KCCM-10530菌株中，并與該基因組進行同源重組以在基因組上與mqo基因相鄰的位置插入一個mqo基因拷貝。因此，獲得新的XMP產(chǎn)生菌株， 稱為產(chǎn)氨棒桿菌KCJ-1304，該菌株在其基因組上具有mqo基因的兩個拷貝。mqo基因的兩個拷貝的串聯(lián)插入是通過利用使用引物組(SEQ ID N0S. 5和6)的PCR鑒定的，該引物組靶向mqo基因的兩個拷貝的上游和下游核苷酸序列。SEQ ID N0. 5 CTTTTCGATGACGCCCAASEQ ID N0. 6 CCACTTTATCGGGTGAGACCA實施例3 :mqo插入的菌株的蘋果酸脫氫酶活性如下測定實施例2中制備的產(chǎn)生XMP的產(chǎn)氨棒桿菌KCJ-1304的蘋果酸脫氫酶活性。將菌株接種到含有10g/l細菌用蛋白胨、5g/l細菌用牛肉膏、5g/l細菌用酵母抽提物、 2. 5g/l NaCl、50mg/l腺嘌呤和50mg/l鳥嘌呤的培養(yǎng)基中，并在30°C培養(yǎng)12小時直到獲得 OD 10?；厥誌OmL細胞培養(yǎng)物，將其在含有50mM HEPES、IOmM乙酸鉀、IOmM CaCl2和IOmM MgCl2中洗滌兩次，并懸浮在ImL同樣的緩沖液中。使用聲波儀打斷之后，將細胞裂解物離心。將上清液再次離心以產(chǎn)生沉淀物，然后將該沉淀物懸浮在IOOyL緩沖液中。將IOyL 該懸浮液用作酶溶液。反應緩沖液通過混合50mM HEPESUOmM乙酸鉀和50 μ M 2，6-二氯靛酚(dichloro indolphenol) (ClJnd)制備。反應之前將Cl2Ind解凍和混合。向980 μ L 反應混合物中加入IOyL IOOmM蘋果酸鹽作為底物和10 μ L酶溶液，之后在30°C搖動溫育15min。酶活性通過測量減少的Cl2Ind的濃度而測定。Cl2Ind在600nm具有吸收系數(shù) 22cm_1mM_10表1
權利要求
1.一種棒狀菌(Corynebacteria)菌株，其具有用于產(chǎn)生5'-黃苷一磷酸的較野生型更高的蘋果酸脫氫酶活性。
2.根據(jù)權利要求1的棒狀菌菌株，其中所述蘋果酸脫氫酶活性因mqo表達增加而提高。
3.—種重組載體，其具有圖1的切割圖顯示的結構。
4.一種棒狀菌菌株，其用權利要求3所述的重組載體轉化。
5.根據(jù)權利要求4的棒狀菌菌株，其顯示增強的蘋果酸脫氫酶活性。
6.根據(jù)權利要求4的棒狀菌菌株，所述菌株是5'-黃苷一磷酸生產(chǎn)力增強的產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)菌株。
7.根據(jù)權利要求6的棒狀菌菌株，所述菌株是產(chǎn)氨棒桿菌KCCM10972P。
8.產(chǎn)生5'-黃苷一磷酸的方法，其包括培養(yǎng)權利要求4所述的棒狀菌菌株；和從所述培養(yǎng)物獲得5'-黃苷一磷酸。
全文摘要
公開新的微生物，其具有較野生型更高的蘋果酸脫氫酶活性。還公開具有圖1的切割圖顯示的結構的重組載體、以此轉化的棒狀菌(Corynebacteria)菌株和通過培養(yǎng)該轉化的菌株生產(chǎn)5′-黃苷一磷酸的方法。
文檔編號C12P19/02GK102317433SQ200980154009
公開日2012年1月11日 申請日期2009年12月17日 優(yōu)先權日2008年12月17日
發(fā)明者吳潤錫, 樸長熙, 李智惠, 李珍南, 趙鎮(zhèn)滿, 金蕙園 申請人:Cj第一制糖株式會社