專利名稱：利用質(zhì)譜法分離、表征和/或鑒定微生物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測、分離和/或鑒定樣品中的微生物的方法和系統(tǒng)。具體而言， 本發(fā)明涉及利用質(zhì)譜法快速表征和/或鑒定微生物的直接方法。
背景技術(shù)：
檢測生物學(xué)流體中的病原微生物，應(yīng)該在盡可能最短的時間內(nèi)進(jìn)行，尤其是在敗血癥的情況下，對于該病癥盡管醫(yī)生可利用的抗生素的范圍廣泛，但是其死亡率仍然保持較高。生物學(xué)活性劑(諸如微生物)在患者體液尤其是血液中的存在，一般采用血培養(yǎng)瓶進(jìn)行檢測。血流感染與高的發(fā)病率和死亡率有關(guān)，然而當(dāng)前的診斷方法即培養(yǎng)之后進(jìn)行生物化學(xué)鑒定和抗生素敏感性測試，可能要耗費(fèi)幾天時間來進(jìn)行。通常，基于臨床癥狀開始經(jīng)驗療法，而只有當(dāng)初始療法無效時測試結(jié)果才會影響臨床決策。在陽性血液培養(yǎng)結(jié)果之后的最初幾個小時內(nèi)、優(yōu)選1個小時內(nèi)表征血液感染的能力，將會顯著地加強(qiáng)所提供的診斷信息的臨床相關(guān)性。已經(jīng)提出了分子擴(kuò)增方法來填補(bǔ)這方面的需要，但是對于這種方法仍然存在嚴(yán)重的挑戰(zhàn)。陽性血液培養(yǎng)液自身代表具有用于各種快速、鑒定(ID)試驗的潛能的天然擴(kuò)增的微生物種群。為了提供穩(wěn)健的結(jié)果，傳統(tǒng)的自動表型ID測試(諸如Vitek 、Phoenix 和 Microscan 系統(tǒng))或手動表型測試(諸如API)要求微生物處于適當(dāng)?shù)纳L階段并且無干涉培養(yǎng)基和血液產(chǎn)物。這些系統(tǒng)利用在平板培養(yǎng)基上從陽性培養(yǎng)液中生長18 24小時的菌落。然而，為了獲得更快的結(jié)果，一些實驗室已經(jīng)報道了采用這些系統(tǒng)及從陽性血培養(yǎng)瓶中分離的微生物。這些直接獲自培養(yǎng)瓶的試驗并不是對于所有的微生物(例如，革蘭氏陽性球菌)都是適當(dāng)?shù)?，未?jīng)測試廠商驗證，并且一般要花費(fèi)3 8小時才能提供結(jié)果。迫切需要更快且更廣泛的特異性試驗，以便在陽性培養(yǎng)結(jié)果之后的最初幾個小時內(nèi)、優(yōu)選1個小時內(nèi)為醫(yī)師提供臨床上相關(guān)的結(jié)果。質(zhì)譜法具有實現(xiàn)非?？焖俚罔b定微生物的潛能，但是可能會遇到來自存在于液體微生物培養(yǎng)基中和臨床樣品諸如血液或其組合中的許多化合物的干擾。直接從陽性血液培養(yǎng)液中回收微生物的最常用的方法是兩步差速離心和在血清分離器管中進(jìn)行的離心。已經(jīng)描述了用于分離、表征和/或鑒定微生物的其它方法，包括美國專利第6，177，266號公開了一種采用通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-T0F-MS)分析細(xì)胞蛋白提取物或整個細(xì)胞產(chǎn)生的屬、種和菌株的特異性生物標(biāo)記物對細(xì)菌進(jìn)行化學(xué)分類學(xué)分類的方法。在美國專利第7，070, 739號中，顯示了一種通過二維超離心直接從體液或均質(zhì)化組織中提取、分離和純化微生物(包括病毒)的方法。在第一步離心步驟中，將沉降速度高于待鑒定的微生物的沉降速率的所有粒子除去。在第二步超離心步驟中，采用專用鋸齒離心管，于填充的流體中應(yīng)用等密度分帶以形成寬范圍的密度梯度。根據(jù)該專利，分離技術(shù)能夠用于通過利用核酸特異性染料的光散射或熒光檢測分帶的粒子，以及用于以非常小的體積回收分帶的粒子，從而通過質(zhì)譜分析病毒蛋白亞單位和完整的病毒粒子以及通過熒光流量細(xì)胞計數(shù)測定核酸的質(zhì)量和由限制酶產(chǎn)生的片段的質(zhì)量進(jìn)行表征。美國專利申請出版物第2007/0175278號描述了采用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)所關(guān)注的樣品，包括例如血液、尿液、糞便、脈管導(dǎo)管等，工業(yè)生產(chǎn)線，水系統(tǒng)，食物產(chǎn)品，化妝品，藥物制劑和法醫(yī)樣品。隨后，通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法，例如通過離心可以從液體培養(yǎng)基中采集微生物。然后可以將濃縮的微生物轉(zhuǎn)移到載體物質(zhì)中，可選地在干燥之后，用于獲取振動光譜。該專利申請討論了用于鑒定和分類微生物的各種方法，包括振 動光譜法，諸如拉曼光譜法。然而，這些方法在試圖從復(fù)雜樣品(諸如含血液的培養(yǎng)基)中分離和表征微生物時具有一些缺點(diǎn)。所得的微生物制劑經(jīng)常包含污染性的紅血細(xì)胞、血小板、脂質(zhì)微粒、血漿酶和細(xì)胞碎片，這些都可以導(dǎo)致結(jié)果變差。這些方法也是非常勞動密集型的并且由于其步驟能夠使?jié)撛谖ｋU的病原體在空氣中暴露于使用者從而是不安全的。仍需要從血液培養(yǎng)液和其它無這些干擾物質(zhì)并與快速鑒定技術(shù)相容的復(fù)雜樣品中分離微生物的簡單安全且可靠的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供用于分離、表征和/或鑒定樣品中微生物的方法。方法實現(xiàn)了比現(xiàn)有技術(shù)更快速地表征和/或鑒定微生物，從而產(chǎn)生更快的診斷(例如，在患有或疑似患有敗血癥的受試者中)并鑒定受污染物質(zhì)(例如，食品和藥物)。在本發(fā)明的方法中所包括的步驟， 從獲得樣品到表征和/或鑒定微生物，都可以在非常短的時間框架內(nèi)實施以產(chǎn)生臨床相關(guān)的可采取行動的信息，例如在不到約120分鐘內(nèi)。在一個方面中，本發(fā)明涉及從檢測樣品中表征和/或鑒定微生物的方法，包括(a)獲得已知包含或可能包含微生物的檢測樣品；(b)選擇性地溶解所述檢測樣品中的非微生物細(xì)胞以產(chǎn)生溶胞樣品；(c)使微生物與所述溶胞樣品的其它組分分離以形成所述微生物的離析的樣品；(d)通過質(zhì)譜法對所述微生物的所述離析的樣品進(jìn)行探詢以獲得所述微生物的質(zhì)譜圖；和(e)通過將所測定的質(zhì)譜圖與參考質(zhì)譜圖和/或與已知微生物的細(xì)胞組分的已知或預(yù)測的質(zhì)量對比來表征和/或鑒定所述離析的樣品中的所述微生物。在又一個方面中，本發(fā)明涉及從血液培養(yǎng)物中表征和/或鑒定微生物的方法，包括(a)從已知包含或可能包含微生物的血液培養(yǎng)物中獲得樣品；(b)選擇性地溶解所述樣品中的非微生物細(xì)胞以產(chǎn)生溶胞樣品；(c)將所述溶胞樣品鋪層在密封容器中的密度緩沖墊層上；(d)將容器離心以使微生物與所述樣品的其它組分分離并形成微生物顆粒；
(e)通過質(zhì)譜法對所述微生物的所述離析的樣品進(jìn)行探詢以獲得所述微生物的質(zhì)譜圖；和(f)通過將所測定的質(zhì)譜圖與參考質(zhì)譜圖和/或與已知微生物的細(xì)胞組分的已知或預(yù)測的質(zhì)量對比來表征和/或鑒定所述離析的樣品中的所述微生物。在又一個方面中，本發(fā)明涉及表征和/或鑒定微生物的方法，包括(a)獲得已知包含或可能包含微生物的檢測樣品；(b)將所述檢測樣品鋪層在容器中的密度緩沖墊層的上方；(c)將容器離心以使微生物與所述樣品的其它組分分離并形成微生物顆粒；(d)通過質(zhì)譜法對顆粒進(jìn)行探詢以獲得所述微生物的質(zhì)譜圖；和(e)通過將所測定的質(zhì)譜圖與參考質(zhì)譜圖和/或與已知微生物的細(xì)胞組分的已知或預(yù)測的質(zhì)量對比來表征和/或鑒定所述離析的樣品中的所述微生物。在一個實施方式中，分離通過將測試樣品鋪層在容器中的密度緩沖墊層的上方并將容器離心以粒化微生物，同時檢測樣品培養(yǎng)基仍保留在密度緩沖墊層的頂部。在一個實施方式中，方法包括回收微生物顆粒，再懸浮微生物，從懸浮液中除去樣品用于引入質(zhì)譜儀中并對樣品進(jìn)行質(zhì)量分析的步驟。在另一個實施方式中，該方法進(jìn)一步包括回收微生物顆粒，再懸浮微生物并進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定或表征試驗(例如，耐藥性、毒力因子、抗藥型)的步驟。在本文的附圖中和下面闡述的描述中對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的解釋。


圖1顯示了從血液培養(yǎng)物中處理和回收的各種微生物的質(zhì)譜圖。圖2顯示了從血液培養(yǎng)液中處理和回收的5種金黃色葡萄球菌(S. aureus)分離物的質(zhì)譜圖。圖3顯示了直接獲自瓊脂平板的大腸桿菌(E. coli)的質(zhì)譜圖和根據(jù)本發(fā)明從血液培養(yǎng)液中處理的大腸桿菌的質(zhì)譜圖的對比。
具體實施例方式本發(fā)明可以以不同的形式體現(xiàn)，并且不應(yīng)該解釋為僅限于本文中所闡述的實施方式。相反，提供這些實施方式以便使本公開是全面和完整的，并將向本領(lǐng)域的技術(shù)人員充分表達(dá)本發(fā)明的范圍。例如，可以將有關(guān)一個實施方式舉例說明的特征結(jié)合至其它實施方式中，以及可以將有關(guān)具體實施方式
舉例說明的特征從該實施方式中刪除。另外，依據(jù)本公開，在本文中提出的對實施方式的各種變通和添加對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言將會是顯而易見的，所述的各種變通和添加沒有偏離本發(fā)明。除非另外規(guī)定，本文所用的所有技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中普通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。本文中在本發(fā)明的說明書中所用的術(shù)語僅僅是為了達(dá)到描述具體實施方式
的目的而不是用來限制本發(fā)明。定義如本文中所用的“一個(一種)，，(“a”，“an”)或“該(the) ”可以意指一個(一種)或多于一個(一種)。例如，“一個”細(xì)胞可以意指單個細(xì)胞或多個細(xì)胞。
而且，如本文中所用的“和/或”是指并包含一個或多個相關(guān)所列項的任何和所有的可能的組合，以及當(dāng)在另一種情況(“或”)下解釋時不組合。另外，如本文中所用的術(shù)語“約”，當(dāng)是指可測量的值諸如本發(fā)明的化合物或物質(zhì)的量、劑量、時間、溫度等時，意味著包含指定量的士20%、+10%、士5%、士 1%、士0. 5%，或甚至士 0. 的變化。如本文中所用的術(shù)語“微生物”預(yù)期用于包含通常是單細(xì)胞的生物，其能夠在實驗室中進(jìn)行繁殖和處理，包括但不限于革蘭氏陽性細(xì)菌或革蘭氏陰性細(xì)菌、酵母菌、霉菌、寄生蟲和柔膜細(xì)菌。本發(fā)明的革蘭氏陰性細(xì)菌的非限制性的實例包括以下屬的細(xì)菌 假單胞菌屬(Pseudomonas)、埃希式桿菌屬(Escherichia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、 志賀氏桿菌屬(Shigella)、腸桿菌屬(Enterobacter)、克雷白氏桿菌屬(Klebsiella)、 沙雷氏菌屬(Serratia)、變形桿菌屬(Proteus)、彎曲菌屬(Campylobacter)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)、摩根氏菌屬(Morganella)、弧菌屬(Vibrio)、耶爾森氏菌屬 (Yersinia)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、短波單胞菌屬(Brevundimonas)、青枯菌屬(Ralstonia)、無色桿菌屬(Achromobacter)、 梭菌屬(Fusobacterium)、普氏菌屬(Prevotella)、布蘭漢氏球菌屬(Branhamella)、 奈瑟菌屬(Neisseria)、伯克氏菌屬(Burkholderia)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、 哈夫尼菌屬(Hafnia)、愛德華氏菌屬(Edwardsiella)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、莫拉克斯氏菌屬(Moraxella)、布魯氏菌屬(Brucella)、巴斯德氏菌屬(Pasteurella)、 普羅維登斯菌屬(Providencia)、和軍團(tuán)菌屬(Legionella)。本發(fā)明的革蘭氏陽性細(xì)菌的非限制性的實例包括以下屬的細(xì)菌腸球菌屬(Enterococcus)、鏈球菌屬 (Streptococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、李斯特菌屬(Listeria)、消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus)、丙酸菌屬(Propionibacterium)、梭菌屬(Clostridium)、 擬桿菌屬(Bacteroides)、加德納菌屬(Gardnerella)、庫克菌屬(Kocuria)、乳球菌屬(Lactococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、微球菌屬(Micrococcus)、分枝桿菌屬(Mycobacteria)和棒狀桿菌屬(Corynebacteria)。本發(fā)明的酵母菌和霉菌的非限制性的實例包括以下屬的那些念珠菌屬(Candida)、隱球菌屬(Cryptococcus)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、青霉菌屬(Penicillium)、鏈格孢屬(Alternaria)、紅酵母屬 (Rhodotorula)、曲霉屬(Aspergillus)、鍵刀菌屬(Fusarium)、酵母屬(Saccharomyces) 和毛孢子菌屬(Trichosporon)。本發(fā)明的寄生蟲的非限制性的實例包括以下屬的那些 錐體蟲屬(Trypanosoma)、巴貝西蟲屬(Babesia)、利什曼原蟲屬(Leishmania)、瘧原蟲屬(Plasmodium)、Wucheria、布魯格氏絲蟲屬(Brugia)、盤尾絲蟲屬(Onchocerca)和納氏蟲屬(Naegleria)。本發(fā)明的柔膜細(xì)菌的非限制性的實例包括以下屬的那些支原體屬 (Mycoplasma)禾口服原體屬(Ureaplasma)。在如本文中更詳細(xì)地描述的一個實施方式中，可以對來自樣品或生長培養(yǎng)基的微生物進(jìn)行分離和探詢以表征和/或鑒定樣品中存在的微生物。如本文中所用的術(shù)語“使分離”預(yù)期包含已經(jīng)從其原始狀態(tài)或從生長培養(yǎng)基或培養(yǎng) 基中除去、濃縮或另外分開的任何的微生物樣品。例如，根據(jù)本發(fā)明，可以使微生物與可能另外干擾表征和/或鑒定的非微生物或非微生物組分分離開(例如，作為分離的樣品(separated sample))。該術(shù)語可以包括夾在兩個其它層之間的微生物層(例如，離心后在高密度緩沖墊層頂部收集的微生物)， 或在固體表面(例如，過濾膜)上收集的微生物層。該術(shù)語也可以包括已經(jīng)部分地通過層 (例如，密度緩沖墊層)的微生物的收集。同樣，分離的微生物樣品可以包括微生物和/或其組分的任何收集或?qū)樱@比原始樣品更濃，或另外從原始樣品中分離出來，并且其范圍可以是從微生物的緊密堆積的稠密塊到微生物的擴(kuò)散層。在分離形式或樣品中可以包含的微生物組分包括但不限于以任何組合形式存在的菌毛、鞭毛、傘毛和莢膜。與微生物分離開的非微生物組分可以包括非微生物細(xì)胞(例如，血液細(xì)胞和/或其它組織細(xì)胞)和/或其任何組分。在如本文中更詳細(xì)地描述的又一個實施方式中，，可以對來自樣品或生長培養(yǎng)基的微生物進(jìn)行分離和探詢以表征和/或鑒定樣品中存在的微生物。如本文中所用的術(shù)語 “離析的”預(yù)期包含已經(jīng)從其原始狀態(tài)或從其生長培養(yǎng)基或培養(yǎng)基中至少部 分地純化的任何微生物樣品，以及其中所含的任何非微生物或非微生物組分。例如，根據(jù)本發(fā)明，微生物可以與可能另外干擾表征和/或鑒定的非微生物或非微生物組分離析開(例如，作為離析的樣品(isolated sample))。與微生物分離開的非微生物組分可以包括非微生物細(xì)胞(例如，血液細(xì)胞和/或其它組織細(xì)胞)和/或其任何組分。在如本文中更詳細(xì)地描述的又一個實施方案中，，可以對來自樣品或生長培養(yǎng)基的微生物進(jìn)行粒化和探詢以表征和鑒定樣品中存在的微生物。如本文中所用的術(shù)語“顆粒” 預(yù)期包含已經(jīng)被壓縮或沉積成微生物團(tuán)塊的任何微生物樣品。例如，通過離心或本領(lǐng)域內(nèi)的其它已知方法可以將樣品中的微生物在試管底部壓縮或沉積成團(tuán)塊。該術(shù)語包括離心后在容器的底部和/或側(cè)面上的微生物(和/或其組分)的收集。在顆粒中可以包含的微生物組分包括但不限于以任何組合形式存在的菌毛、鞭毛、傘毛和莢膜。根據(jù)本發(fā)明，微生物可以與可能另外干擾表征和/或鑒定的非微生物或非微生物組分?；珠_(例如作為基本上純化的微生物顆粒)。與微生物分離開的非微生物組分可以包括非微生物細(xì)胞(例如，血液細(xì)胞和/或其它組織細(xì)胞)和/或其任何組分。如本文中所用的術(shù)語“密度緩沖墊層”是指整個具有均勻密度的溶液。本發(fā)明提供了用于分離、表征和/或鑒定樣品中微生物的方法。而且，該方法可以特別用于從復(fù)雜樣品諸如含血液的培養(yǎng)基中分離、表征和/或鑒定微生物。快速方法也實現(xiàn)了比現(xiàn)有技術(shù)更快地表征和/或鑒定微生物，從而獲得更快速的診斷(例如，在患有或疑似患有敗血癥的受試者中)并表征/鑒定受污染物質(zhì)(例如，食品和藥物)。本發(fā)明的方法中所包含的步驟，從獲得樣品到表征和/或鑒定微生物，都可以在非常短的時間框架內(nèi)實施以得到臨床上相關(guān)的可采取行動的信息。在某些實施方式中，本發(fā)明的方法可以在不到約 120 分鐘內(nèi)，例如在不到約 110、100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、10、5、4、3、2 或 1 分鐘內(nèi)進(jìn)行實施。本發(fā)明的方法的極度快速性代表優(yōu)于現(xiàn)有方法的改進(jìn)。可以使用本發(fā)明方法來表征和/或鑒定本文中所述的任何微生物。在一個實施方式中，微生物是細(xì)菌。在另一個實施方式中，微生物是酵母菌。在另一個實施方式中，微生物是霉菌。在另外的實施方式中，微生物是寄生蟲。在另一個實施方式中，微生物是柔膜細(xì)菌。另外，可以使本發(fā)明的方法完全自動化，從而降低了處理傳染性物質(zhì)和/或污染樣品的風(fēng)險。在一個方面中，本發(fā)明涉及從檢測樣品中表征和/或鑒定微生物的方法，包括(a)獲得已知包含或可能包含微生物的檢測樣品；
(b)選擇性地溶解所述檢測樣品中的非微生物細(xì)胞以產(chǎn)生溶胞樣品； (c)使微生物與所述溶胞樣品的其它組分分離以形成所述微生物的離析的樣品；(d)通過質(zhì)譜法對所述微生物的所述離析的樣品進(jìn)行探詢以獲得所述微生物的質(zhì)譜圖；和(e)通過將所測定的質(zhì)譜圖與參考質(zhì)譜圖和/或與已知微生物的細(xì)胞組分的已知或預(yù)測的質(zhì)量對比來表征和/或鑒定所述離析的樣品中的所述微生物。在另一個方面中，本發(fā)明涉及表征和/或鑒定微生物的方法，包括(a)獲得已知包含或可能包含微生物的檢測樣品；(b)將檢測樣品鋪層在容器中的密度緩沖墊層的上方；(c)將容器離心以使微生物與所述檢測樣品的其它組分分離并形成微生物顆粒；(d)通過質(zhì)譜法對顆粒進(jìn)行探詢以獲得所述微生物的質(zhì)譜圖；和(e)通過將所測定的質(zhì)譜圖與參考質(zhì)譜圖和/或與已知微生物的細(xì)胞組分的已知或預(yù)測的質(zhì)量對比來表征和/或鑒定所述離析的樣品中的所述微生物。在本發(fā)明的另一個實施方式中，方法包括在探詢微生物之前從分離容器中回收分離步驟期間形成的微生物顆?；蚱涞囊徊糠帧＠?，在形成顆粒之后，可以將流體從顆粒中吸出并將顆粒再懸浮于合適的培養(yǎng)基(例如，其中微生物是活的培養(yǎng)基)中。可以將再懸浮的微生物從分離容器中移出。然后，可以例如在懸浮液中或在已將它們再?；髮ξ⑸锾皆儚亩M(jìn)行表征和/或鑒定。在其它實施方式中，可以在分離容器中(例如在懸浮液中)或已將它們再粒化之后對再懸浮的微生物進(jìn)行探詢。在另外的實施方式中，從顆粒中回收的微生物可以直接用于進(jìn)一步的探詢(例如，質(zhì)譜法)而無需再懸浮。樣品可以通過本發(fā)明的方法進(jìn)行測試的樣品(即，檢測樣品)包括其中微生物存在和/ 或生長或可能疑似存在和/或生長的臨床和非臨床樣品，以及對微生物的存在進(jìn)行常規(guī)或不定期檢測的物質(zhì)的樣品。所利用的樣品的量由于方法的通用性和/或靈敏度可能大大不同。樣品制備可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的任何技術(shù)來實施，盡管本發(fā)明的一個優(yōu)點(diǎn)在于可以利用系統(tǒng)對復(fù)雜的樣品類型(諸如例如血液、體液、和/或其它不透明的物質(zhì))直接進(jìn)行測試，而僅需極少的或無需大量的預(yù)處理。在一個實施方式中，樣品取自培養(yǎng)物。在另一個實施方式中，樣品取自微生物培養(yǎng)物(例如，血液培養(yǎng)物)。在另一個實施方式中，在樣品中疑似或已知包含微生物?？梢詼y試的臨床樣品包括通常在臨床或研究實驗室中測試的任何類型的樣品，包括但不限于血液、血清、血漿、血液部分、關(guān)節(jié)液、尿液、精液、唾液、糞便、腦脊髓液、胃內(nèi)容物、陰道分泌物、組織勻漿、骨髓抽取液、骨勻漿、痰、抽吸物、拭子和拭子渣液(rinsates)、 其它體液等。在另一個實施方式中，可以對臨床樣品進(jìn)行培養(yǎng)并使用培養(yǎng)樣品。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了在研究以及獸用和醫(yī)藥應(yīng)用中的用途。可以獲取臨床樣品的合適受試者一般是哺乳動物受試者，但是可以是任何動物。如本文中所用的術(shù)語“哺乳動物”包括但不限于人、非人靈長類動物、牛、綿羊、山羊、豬、馬、貓、狗、兔子、嚙齒類動物(例如，大鼠或小鼠)等。人類受試者包括新生兒、嬰幼兒、青少年、成年人和老年受試者。可以獲取樣品的受試者包括但不限于哺乳動物、鳥類、爬行動物、兩棲動物和魚類?？梢赃M(jìn)行測試的非臨床樣品包括物質(zhì)，所述物質(zhì)包含但不限于食品、飲料、藥物、化妝品、水(例如，飲用水、非飲用水、和廢水)、海水壓載物、空氣、土壤、污水、植物材料(種子、葉子、莖、根、花、果實)、血液制品(例如血小板、血清、血漿、白血細(xì)胞部分等)、捐贈器官或組織樣品、生物戰(zhàn)樣品等等。方法也尤其十分適合實時測試以監(jiān)控工業(yè)環(huán)境中的污染水平、過程控制、質(zhì)量控制等。在另一個實施方式中，可以對非臨床樣品進(jìn)行培養(yǎng)，并使用培養(yǎng)樣品。 在本發(fā)明的一個實施方式中，樣品獲自患有或疑似患有微生物感染的受試者(例如，患者)。在一個實施方式中，受試者患有或疑似患有敗血癥，例如，菌血癥或真菌血癥。 樣品可以是直接獲自受試者的血液樣品。樣品可以來自由患者的血液樣品生長的血液培養(yǎng)物，例如BacT/ALERT 血液培養(yǎng)物。血液培養(yǎng)樣品可以來自陽性血液培養(yǎng)物，例如，表明微
生物存在的血液培養(yǎng)物。在某些實施方式中，樣品在其轉(zhuǎn)為陽性之后短時間內(nèi)，例如約6小時之內(nèi)，例如約5、4、3、或2小時內(nèi)，或在約60分鐘，例如約55、50、45、40、35、30、25、20、15、 10、5、4、3、2或1分鐘內(nèi)取自陽性血液培養(yǎng)物。在一個實施方式中，樣品取自其中微生物處于對數(shù)生長期的培養(yǎng)物。在另一個實施方式中，樣品取自其中微生物處于靜止期的培養(yǎng)物。本發(fā)明提供了用于檢測、表征和/或鑒定微生物的高靈敏度。這能夠使檢測、表征和/或鑒定無需首先必須經(jīng)過下列步驟通過使它們在固體或半固體培養(yǎng)基上生長來分離微生物，以及對生長的菌落采樣。因此，在本發(fā)明一個實施方式中，樣品不是來自在固體或半固體表面上生長的微生物(例如，細(xì)菌、酵母菌或霉菌)菌落。因此在本發(fā)明一個實施方式中，樣品不是來自在固體或半固體表面上生長的微生物(例如，細(xì)菌、酵母菌或霉菌)菌落。樣品的體積應(yīng)該足夠大以產(chǎn)生實施本發(fā)明方法的使分離/分離步驟后可以進(jìn)行探詢的微生物的分離樣品或微生物顆粒。適當(dāng)?shù)捏w積將取決于樣品的來源和樣品中微生物的預(yù)期水平。例如，陽性血液培養(yǎng)物將含有比待檢測污染的飲用水樣品更高的每體積微生物水平，因此可能需要相對于飲用水樣品體積更小的血液培養(yǎng)基。一般而言，樣品大小可以是低于約50ml，例如，低于約40、30、20、15、10、5、4、3、或2ml。在某些實施方式中，樣品大小可以是約1ml，例如約0. 75、0.5或0. 25ml。在某些實施方式中，其中分離以微量規(guī)模進(jìn)行， 則樣品大小可以是低于約200 μ 1，例如，低于約150、100、50、25、20、15、10或5μ 1。在一些實施方式中(例如，當(dāng)期望樣品含有少量微生物時)，樣品大小可以是約IOOml或更大，例如，約 250、500、750 或 IOOOml 或更大。可選的溶胞步驟在一些實施方式中，獲得樣品之后，本發(fā)明的方法中的下一個步驟是選擇性地溶解樣品中可能存在的不想要的細(xì)胞，例如血液細(xì)胞和/或組織細(xì)胞。細(xì)胞可以溶解以允許微生物與樣品的其它組分分離。微生物與其它組分的分離防止在探詢步驟期間產(chǎn)生干擾。 如果期望非微生物細(xì)胞在樣品中不存在或期望其不會干擾探詢步驟，則可以不需要實施溶胞步驟。在一個實施方式中，待溶解的細(xì)胞是樣品中存在的非微生物細(xì)胞且可能存在于樣品中的微生物細(xì)胞不發(fā)生溶解。然而，在一些實施方式中，特定種類的微生物的選擇性溶胞可能是所期望的并因此可以根據(jù)本文中描述的以及本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的方法進(jìn)行實施。例如，可以選擇性地溶胞不想要的微生物種類，例如溶解酵母菌，而不溶解細(xì)菌或反之亦然。 在另一個實施方式中，溶胞所需的微生物以便分離微生物的特定亞細(xì)胞組分，例如，細(xì)胞膜或細(xì)胞器。在一個實施方式中，溶解所有的非微生物細(xì)胞。在其它實施方式中，溶解一部分的非微生物細(xì)胞，例如，溶解防止干擾探詢步驟的足夠多的細(xì)胞。細(xì)胞的溶解可以通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的有效地選擇性溶解細(xì)胞而溶胞或不溶胞微生物的任何方法進(jìn)行實施，包括但不限于加入溶胞溶液、超聲處理、滲透壓沖擊、化學(xué)處理和/或其組合。溶胞溶液是一種能夠溶解細(xì)胞例如非微生物細(xì)胞(例如，通過溶解真核細(xì)胞膜) 和/或微生物細(xì)胞的溶液。在一個實施方式中，溶胞溶液可以包含一種或多種清潔劑、一種或多種酶、或一種或多種清潔劑和一種或多種酶的組合，并且可以進(jìn)一步包含其它作用齊U。在一個實施方式中，清潔劑可以是非變性溶胞清潔劑，諸如Triton x-100、Triton X-100-R、Triton X-114、NP-40、Genapol C-100、Genapol X-100、Igiipal CA 630、 ArlasolveTM200、Brij 96/97、CHAPS、辛基β _D_吡喃葡萄糖苷、皂苷和單十二烷基九乙二醇醚(C12E9，聚多卡醇(polidocenol))?？蛇x地，可以包含變性溶胞清潔劑，諸如十二烷基硫酸鈉、N-月桂酰肌氨酸、脫氧膽酸鈉、膽汁鹽類、十六烷基三甲基溴化銨、SB3-10、SB3-12、 氨基磺基甜菜堿-Hfemidosulfobetaine-H)和C7BzO。可選地，還可以包含增溶劑，諸如 Brij 98、Brij 58、Brij 35、Tween 80、Tween 20、Pluronic L64、Pluronic P84、非-清潔性磺基甜菜堿(NDSB 201) ,amphipols (PMAL-C8)和甲基-β -環(huán)糊精。通常，非-變性清潔劑和增溶劑以超過其臨界膠束濃度(CMC)的濃度使用，而變性清潔劑可以以低于其CMC 的濃度加入。例如，非_變性溶胞清潔劑可以在約0. 010%至約10%，例如約0. 015%至約 1. 0%，例如約0. 05%至約0. 5%，例如約0. 10%至約0. 30% (用樣品稀釋后的最終濃度) 的濃度使用。在另一個實施方式中，可以優(yōu)選使用聚氧乙烯清潔劑。聚氧乙烯清潔劑可以包含C12-18/E9_1(1結(jié)構(gòu)，其中C12_18表示12 18個碳原子的碳鏈長度和E9_1(1表示9 10個氧乙烯親水性頭基團(tuán)。例如，聚氧乙烯清潔劑可以選自Brij 97、Brij 96V、Genapol C-100, Genapol X-100、單十二烷基九乙二醇醚(聚多卡醇)，或其組合組成的組。可以用在溶胞溶液中的酶包括但不限于，消化核酸和其它膜污染物質(zhì)的酶(例如，蛋白酶XXIII、脫氧核糖核酸酶、神經(jīng)氨糖酸苷酶、多糖酶、Glucanex 和Pectinex )。 可以使用的其它添加劑包括但不限于還原劑諸如2-巰基乙醇(2-Me)或二硫蘇糖醇(DTT) 和穩(wěn)定劑諸如鎂、丙酮酸鹽和保濕劑。溶胞溶液可以在適合溶解所需細(xì)胞的任何PH下進(jìn)行緩沖，而這將取決于多種因素，包括但不限于，樣品的類型、待溶解的細(xì)胞和所用的清潔劑。 在一些實施方式中，PH可以處于約2至約13，例如約6至約13，例如約8至約13，例如約 10至約13的范圍中。合適的pH緩沖劑包括能夠保持pH處于所需范圍中的任何緩沖劑，例如，約0. 05M至約1. OM的CAPS。在一個實施方式中，將樣品和溶胞溶液混合然后孵育足以發(fā)生細(xì)胞膜的溶胞和溶解的一段時間，例如約 1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50或60秒，或約2、3、4、5、6、7、8、9、 10、15或20分鐘或更長的時間，例如，約1秒至約20分鐘，約1秒至約5分鐘，或約1秒至約2分鐘。孵育時間將取決于溶胞溶液的強(qiáng)度，例如清潔劑和/或酶的濃度。一般而言，越溫和的溶胞緩沖劑越需要更長的時間和更大的樣品稀釋度來完全溶解非微生物細(xì)胞。溶胞溶液的強(qiáng)度可以基于樣品中已知存在或疑似存在的微生物進(jìn)行選擇。對于更易于溶胞的微生物，可以使用溫和的溶胞溶液。溶胞可以在約2°C至約45°C，例如約15°C至約40°C，例如約30°C至約40°C的溫度下發(fā)生。在一個實施方式中，可以將溶胞溶液裝載到注射器中，然后可以將樣品吸入到注射器中從而使混合和孵育在注射器內(nèi)發(fā)生。在一個實施方式中，可以將溶胞溶液載入到注射器中，然后將樣品吸入 到注射器中從而使混合和孵育在注射器內(nèi)發(fā)生。 在一些實施方式中，溶胞條件(例如，溶液或孵育時間)，以及分離和/或探詢步驟，能夠足以殺死樣品中一些或所有的微生物。本發(fā)明的方法是高度通用的并且不要求所有微生物對于要發(fā)生的分離和鑒定都是活著的。在某些實施方式中，一些或所有的微生物可以是死亡的，死亡可以發(fā)生在本發(fā)明方法的步驟實施之前、期間和/或之后。在本發(fā)明的實踐中所考慮的溶胞緩沖劑的更多細(xì)節(jié)和描述公開在于2009年10月 30 日提交的標(biāo)題為“Methods for Isolation and Identification of Microorganisms”， 序列號為no. _的未決美國專利申請中，將其內(nèi)容結(jié)合于本文中作為參考。分離步驟本發(fā)明的方法中的下一步驟(例如，如果進(jìn)行溶胞步驟，則是在樣品已經(jīng)被溶胞之后的步驟)是分離步驟。可以實施分離步驟以使微生物與樣品的其它組分(例如，非微生物或其組分)分離，并將微生物濃縮成為實現(xiàn)鑒定和表征目的可以進(jìn)行探詢的顆粒。分離不必是完全的，即，不要求達(dá)到100%的分離。需要的是微生物與樣品的其它組分的分離足以允許對微生物進(jìn)行探詢且基本上不會受到其它組分干擾。例如，分離能夠產(chǎn)生至少約 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%純度的或更高純度的微生物顆粒。在一個實施方式中，分離通過離心步驟實施，其中將樣品(例如，溶胞樣品)置于分離容器中的密度緩沖墊層的頂部并且將容器在允許微生物被離析的條件下離心(例如， 微生物可以在容器的底部和/或側(cè)面上形成顆粒)。根據(jù)該實施方式，樣品的其它組分(例如，在樣品培養(yǎng)基中可能存在的非微生物或其組分)保留在密度緩沖墊層的頂部或在密度緩沖墊層的頂層部分內(nèi)。一般而言，任何已知的容器都可以用于分離步驟。在一個實施方式中，分離容器是在于2009年10月30日提交的標(biāo)題為“S印aration Device for Use in the Separation, Characterization and/or Identification of Microorganisms",!ψβ] 號為—中的有關(guān)美國專利申請中公開的分離裝置。該分離步驟從樣品中的物質(zhì)，諸如培養(yǎng)基、細(xì)胞碎片、和/或其它可能干擾微生物的探詢(例如，通過內(nèi)熒光)的組分中離析出微生物。在一個實施方式中，密度緩沖墊層還用于分離活的微生物和死的微生物(其不通過密度緩沖墊層)。在另一個實施方式中，密度緩沖墊層不含有密度梯度，無論是在離心之前還是在離心之后。換句話說，對分離容器離心的時間和/或加速度的量不足以使組成密度緩沖墊層的物質(zhì)形成密度梯度。選擇緩沖墊層的密度以便使樣品中的微生物通過緩沖墊層而樣品的其它組分 (例如，血液培養(yǎng)液、細(xì)胞碎片)仍保留在墊層的頂部或沒有完全通過密度緩沖墊層。也可以選擇密度緩沖墊層用來分離活的微生物(其通過緩沖墊層)和死亡微生物(其不通過緩沖墊層)。合適的密度將取決于密度緩沖墊層中所用的物質(zhì)以及待分離的樣品。在一個實施方式中，緩沖墊層的密度在約1. 025至約1. 120g/ml，例如約1. 030至約1. 070g/ml，約 1. 040至約1. 060g/mL的范圍中或在約1. 025至約1. 120g/ml之間的任何范圍中。在另一個實施方式中，緩沖墊層的密度為約 1. 025,1. 030,1. 035,1. 040,1. 045,1. 050,1. 055,1. 060、 1. 065,1. 070,1. 075,1. 080,1. 085,1. 090,1. 095,1. 100,1. 105,1. 110,1. 115 或 1. 120g/ ml ο用于密度緩沖墊層的物質(zhì)可以是具有用于本發(fā)明方法的適當(dāng)?shù)拿芏确秶娜魏挝镔|(zhì)。在一個實施方式中，物質(zhì)是膠體二氧化硅。膠體二氧化硅可以是未涂覆的(例如， Ludox (W. R. Grace, CT))或者是例如用硅烷(例如，PureSperm (Nidacon Int' 1，瑞典) 或 Isolate (Irvine Scientific, Santa Ana, CA))或聚乙烯吡咯烷酮(例如，Percoll ， Percol 1 Plus (Sigma-Aldrich, St. Louis，MO))涂覆的。在一個實施方式中，選擇了對光譜探詢產(chǎn)生最小干擾作用的膠體二氧化硅，例如，具有最低內(nèi)熒光的物質(zhì)。膠體二氧化硅可以在任何合適的介質(zhì)中稀釋以形成合適的密度，例如，平衡鹽溶液、生理鹽水和/或 0. 25M的蔗糖。合適的密度可以采用濃度為約15%至約80% v/v，例如約20%至約65% ν/ν的膠體二氧化硅獲得。密度緩沖墊層的另一種合適的物質(zhì)是碘化造影劑，例如碘海醇 (Omnipaque NycoPi^p ，或 Nycodenz )和碘克沙醇(Visipaque 或 OptiPi^p )。對于血液培養(yǎng)樣品，合適的密度可以采用濃度為約10%至約25% w/v，例如約14%至約18% w/ ν的碘海醇或碘克沙醇獲得。對于血液培養(yǎng)樣品，蔗糖可以以約10%至約30% w/v例如約 15%至約20% w/v的濃度用作密度緩沖墊層。可以用于制備密度緩沖墊層的其它合適的物質(zhì)包括低粘度高密度的油，諸如顯微鏡浸鏡油(例如，Type DF5Cargille Labs,New York)； 礦物油(例如，Drakeol 5, Draketex 50, Peneteck ；Penreco Co. , Pennsylvania)；娃油 (聚二甲基硅氧烷)；氟硅油；娃凝膠；甲泛影酸鹽-Ficoll (LymphoPr印 )，例如，對于血液培養(yǎng)樣品在約75%至約100%濃度下；泛影酸鹽-葡聚糖(PolymorphoPr印)，例如，對于血液培養(yǎng)樣品在約25%至約50%濃度下；羧甲基纖維素；羥丙基甲基纖維素；聚環(huán)氧乙烷 (高分子量)；Pluronic F 127 ；Pluronic F68 ；Pluronic 化合物的混合物；聚丙烯酸；
交聯(lián)的聚乙烯醇；交聯(lián)的聚乙烯吡咯烷；PEG甲醚甲基丙烯酸酯；果膠；瓊脂糖；黃原膠；膠凝糖；Phytagel ；山梨醇；Ficoll (例如，對于血液培養(yǎng)樣品濃度為約10%至約15%的 Ficoll 400)；甘油；葡聚糖(例如，對于血液培養(yǎng)樣品在約10%至約15%的濃度下)；糖原；氯化銫(例如，對于血液培養(yǎng)樣品在約15%至約25%的濃度下)；全氟碳流體(例如， 全氟正辛烷)；氫氟碳流體(例如，Vertrel XF)；和本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的類似物質(zhì)等等。在一個實施方式中，密度緩沖墊層選自以任意組合形式存在的一種或多種膠體二氧化硅、碘克沙醇、碘海醇、氯化銫、甲泛影酸鹽-Ficoll 、泛影酸鹽-葡聚糖、蔗糖、FicOll 400、和/ 或葡聚糖中。密度緩沖墊層也可以由物質(zhì)的組合構(gòu)成，例如膠體二氧化硅和油的組合。上述化合物的某些組合對于本發(fā)明的分離和讀數(shù)步驟是有益的。 密度緩沖墊層的體積/高度應(yīng)該足以實現(xiàn)微生物與其它樣品組分的分離。體積將取決于分離容器的大小和形狀。一般而言，可以使用約0. 1至約5ml的體積，例如約0. 2 至約1ml，例如約0. 2ml至約0. 5ml。如果以微量規(guī)模進(jìn)行分離，則密度緩沖墊層的體積可以是約1μ 1至約ΙΟΟμ 1，例如約5μ 1至約50 μ 1。在密度緩沖墊層的頂部放置或鋪層的樣品的體積應(yīng)該足以提供可產(chǎn)生適合探詢的顆粒的足夠的微生物。一般而言，可以使用適合裝入到容器中的任何體積。例如，可以使用約0. Iml至約5ml的體積，例如約0. 2ml至約1ml，例如約0. 2ml至約0. 5ml。如果以微量規(guī)模進(jìn)行分離，則樣品的體積可以是約1 μ 1 至約ΙΟΟμ 1，例如約5μ 1至約50μ 1。對于樣品在容器中的可利用空間將取決于容器的大小和形狀。在一些實施方式中，在將樣品放置或鋪層在頂部之前可以將中間層(液體或固體)放置在密度緩沖墊層的頂部以防止密度緩沖墊層和樣品之間的任何混合。在一個實施方式中，中間層可以是聚乙烯珠。在另一個實施方式中，可以在密度緩沖墊層和樣品之間放置小氣泡以防止混合。在另外的實施方式中，可以將密度緩沖墊層鋪層在高密度物質(zhì)(例如，全氟碳流體)的頂部從而使微生物在分離期間通過密度緩沖墊層并在密度緩沖墊層和高密度物質(zhì)之間的界面處收集。在本發(fā)明的一個實施方式中，分離容器在甩平式轉(zhuǎn)頭中進(jìn)行離心從而使微生物直接在容器底部上形成顆粒。在足夠的加速度下將容器離心足夠長的時間從而使微生物與其它樣品組分分離(例如形成的顆粒)。離心加速度可以是約1，000 Xg至約20，000X g，例如約2，500 Xg至約15，000X g，例如約7，500 Xg至約12，500 X g，等。離心時間可以是約 30秒至約30分鐘，例如約1分鐘至約15分鐘，例如，約1分鐘至約5分鐘。離心可以在約 2°C至約45°C，例如約15°C至約40°C，例如約20°C至約30°C的溫度下進(jìn)行實施。在一個實施方式中，分離容器包含封套，并在離心之前將封套應(yīng)用于容器以形成氣密式密封。封套的存在降低了處理具有或可能具有傳染性和/或危險性的微生物的風(fēng)險，以及污染樣品的風(fēng)險。本發(fā)明方法的一個優(yōu)點(diǎn)是能夠采用密封容器(例如，氣密式密封容器)內(nèi)的微生物實施方法的任意一個或多個步驟(例如，溶胞、分離、探詢、和/或鑒定)。本發(fā)明方法，涉及自動化系統(tǒng)的應(yīng)用，避免與處理高毒性微生物相關(guān) 的健康和安全性風(fēng)險，諸如從樣品中回收微生物用于直接測試發(fā)生的。在一個實施方式中，對容器離心的時間和/或力不足以在密度緩沖墊層內(nèi)形成密度梯度。本發(fā)明不涉及樣品的超離心，例如，在超過約100，OOOXg的力下離心。而且，本發(fā)明也不涉及等密度(平衡)沉降或分帶。分離容器可以是任何具有足以容納密度緩沖墊層和樣品的容積的容器。如本文中所指出的，在本發(fā)明的實施中可以使用在于2009年10月30日提交的標(biāo)題為“S印aration Device for Use in the Separation， Characterization and/or Identification of Microorganisms”，序列號為—的有關(guān)美國專利申請中公開的分離裝置。在一個實施方式中，容器剛好放入或能夠被剛好放入到離心機(jī)轉(zhuǎn)子中。容器的容積可以是約0. Iml至約 25ml，例如約Iml至約10ml，例如約2ml至約8ml。如果分離以微量規(guī)模進(jìn)行，容器的容積可以是約2 μ 1至約100 μ 1，例如，約5 μ 1至約50 μ 1。在一個實施方式中，容器在其上層部具有寬的內(nèi)徑以容納樣品和大部分的密度緩沖墊層，而在收集微生物顆粒的下層部分具有較窄的內(nèi)徑。窄部分具有的內(nèi)徑可以是約0. 04至約0. 12英寸，例如約0. 06至約0. 10 英寸，例如約0. 08英寸。寬部分具有的內(nèi)徑可以是約0. 32至約0. 40英寸，例如約0. 34至約0.38英寸，例如約0.36英寸。對于微量分離，內(nèi)徑可以甚至更小。例如，窄部分的內(nèi)徑可以是約0. 001至約0. 04英寸，例如，約0. 002至約0. 01英寸。錐形內(nèi)徑部分可以連接上下層部分。錐形部分具有的角度可以是約20至約70度，例如約30至約60度。在一個實施方式中，下層窄部分低于容器的總高度的一半，例如，低于容器的總高度的約40%、30%、 20%或10%。容器可以具有連接的封套裝置或可以通過螺紋接受封套裝置(例如，封蓋) 從而使容器在離心期間可以是密封式封閉的。在某些實施方式中，容器經(jīng)過設(shè)計以便使微生物樣品或顆?？梢栽诜蛛x之后很容易地回收、或另外獲得或從容器中移出，不論是以手動還是自動的方式(從而使技術(shù)人員不會暴露于容器的內(nèi)容物)。例如，容器可以包含含有顆粒并能夠與容器其余部分分開的可卸下部分或脫離部分。在另一個實施方式中，容器包含用于分離之后接近顆粒的工具，諸如一個或多個用于插入注射器或其它采樣裝置或用于吸出顆粒的孔道或可穿透的表面。在一個實施方式中，容器可以是管，例如離心管。在另一個實施方式中，容器可以是小片或卡片。在一個實施方式中，容器是獨(dú)立容器，即分離單個樣品的裝置。在其它實施方式中，容器是包含兩個或更多個分離容器從而能夠同時分離多個樣品的裝置的部分。在一個實施方式中，裝置包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、 30、36、42、48、60、72、84、96或更多個分離容器。在另一個實施方式中，通過過濾步驟實施分離，在所述的過濾步驟中，將樣品(例如溶胞樣品)放置于裝有具有阻留微生物的孔徑的選擇性過濾器或過濾裝置。所阻留的微生物可以通過使合適的緩沖液緩緩地通過過濾器來進(jìn)行洗滌。然后洗滌的微生物可以直接在過濾器上進(jìn)行探詢和/或通過直接在過濾器表面上采樣或通過用合適的水性緩沖溶液反沖洗過濾器回收進(jìn)行探詢。探詢步驟在一個實施方式中，在探詢之前將樣品或顆粒中回收和/或再懸浮和可選地從分離容器中移出。在另一個實施方式中，在原位探詢之后將樣品或顆?；厥蘸突蛟賾腋。缓髮嵤┻M(jìn)一步的光譜探詢。例如，可以對回收的和/或再懸浮的微生物實施能夠應(yīng)用于離析的微生物但不能應(yīng)用于微生物顆粒的技術(shù)，諸如膠乳凝集測試或自動表型鑒定測試。在樣品進(jìn)行再懸浮之后，從懸浮液中移出部分樣品，并將其置于用于引入到質(zhì)譜儀的板子上。高度吸收性物質(zhì)沉積在樣品(例如，基質(zhì))的頂部；這種物質(zhì)關(guān)于用于離子化樣品的激光頻率具有非常高的光吸收系數(shù)(例如，對于氮激光器，其發(fā)射波長為337nm，因此這種吸收性物質(zhì)將會在337nm的波長下具有大的吸收系數(shù))。將樣品和吸收性物質(zhì)干燥后，將板子插入到質(zhì)譜儀中。在對樣品抽空降壓(即，從樣品中移除大氣氣體從而使其處于 10-5至10-7torr的環(huán)境中)所需的時間之后，將樣品引入到質(zhì)譜儀的電離室。將樣品與系統(tǒng)對準(zhǔn)。當(dāng)達(dá)到最佳對準(zhǔn)時，氮激光器產(chǎn)生脈沖?；|(zhì)吸收的激光能量導(dǎo)致其由于沉積的高能量從板子表面上剝蝕下來。作為一個副作用，部分微生物細(xì)胞也將在此過程中被汽化和離子化。通過板子和質(zhì)譜儀飛行管的入口之間產(chǎn)生靜電場(即，系統(tǒng)的這部分是質(zhì)/荷鑒別器)使這些離子加速到已知的動能。所有單電荷離子，無論質(zhì)量如何，將在飛行管入口處具有相同的動能，但是它們將會具有與其質(zhì)量成反比的速率。由此，離子沿飛行管移向檢測器，而較輕的離子將在較重的離子之前到達(dá)(飛行管是質(zhì)/荷鑒別器)。每當(dāng)離子撞擊檢測器時檢測器產(chǎn)生電荷。將檢測器的輸出數(shù)字化并且輸出在一個軸上顯示質(zhì)/荷比以及在另一個軸上顯示撞擊次數(shù)。在其它實施方式中，采用質(zhì)譜技術(shù)諸如MALDI-T0F質(zhì)譜法、解吸電噴霧電離(DESI)質(zhì)譜法、GC質(zhì)譜法、LC質(zhì)譜法、電噴霧電離(ESI)質(zhì)譜法和選擇離子流量管(SIFT)質(zhì)譜法可以對顆粒中的微生物進(jìn)行探詢。 根據(jù)本發(fā)明，對于已知微生物進(jìn)行了對照測量，由此實現(xiàn)采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種數(shù)學(xué)方法使所測量的試驗數(shù)據(jù)與所關(guān)注的微生物的表征相關(guān)。例如， 使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的軟件系統(tǒng)可以將樣品的數(shù)據(jù)與基線或?qū)φ諟y量結(jié)果進(jìn)行對比。更具體而言，這些數(shù)據(jù)可以通過許多多元分析方法，諸如例如一般判別分析法 (General Discriminant Analysis) (GDA)、偏最小二乘判另U 分析法(Partial Least Squares Discriminant Analysis) (PLSDA)、偏最小二乘回歸(Partial Least Squares regression)、主成分分析(Principal Component Analysis) (PCA)、平行因素分析 (Parallel Factor Analysis) (PARAFAC)、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析(Neural Network Analysis) (NNA) 和/或支持向量機(jī)(Support Vector Machine) (SVM)進(jìn)行分析。這些方法可以用于將所關(guān)注的未知微生物基于已存在的命名分類到相關(guān)組，和/或基于在如以前所述的設(shè)計用于監(jiān)控、檢測和/或表征生物體的系統(tǒng)中的生物體的代謝、病原性和/或毒力分類到天然存在組。 在又一個實施方式中，可以使用根據(jù)檢測系統(tǒng)的非-光譜測量結(jié)果諸如檢測時間和生長速率來輔助表征和/或鑒定分離樣品或顆粒中的微生物。另外，取自分離裝置下部區(qū)域的照片圖像的測量結(jié)果可以提供關(guān)于鑒別分離物的有價值的信息，諸如顆粒大小、形狀、顏色和密度。在本發(fā)明的一些實施方式中，分離樣品或顆粒中的微生物的表征和/或鑒定不需要涉及精確物種的鑒定。表征涵蓋了生物微粒的廣泛分類或分級以及單一物種的實際鑒定。離析的樣品或顆粒中的微生物的分類可以包含對微生物的表型和/或形態(tài)學(xué)特征的測定。例如，生物微粒的表征可以基于可觀察的差異，諸如組成、形狀、大小、聚簇和/或代謝實現(xiàn)。在一些實施方式中，所關(guān)注的生物微粒的分類可能不需要給定的生物微粒的特征的先驗知識而只需要與經(jīng)驗測量結(jié)果一致的相關(guān)性，從而使這種方法比基于特異性結(jié)合事件或代謝反應(yīng)的方法更加通用和更易適應(yīng)。如本文中所用的“鑒定”意指確定以前未知的微生物所屬的科、屬、種和/或菌株。例如，將以前未知的微生物鑒定到科、屬、種和/或菌株水平。在一些情況下，表征包含提供足夠用于采取行動的有用信息的分類模型。如本文中所用的優(yōu)選的分類模型包含分組到以下一組或多組(1)革蘭氏組；(2)臨床革蘭氏組； (3)治療組；和(4)功能組。(1)革蘭氏組在革蘭氏組分類中，基于其革蘭氏染餼反應(yīng)和總尺寸，可以將微生物歸類成三大分類類別之一，所述組選自以下一組或多組(a)采用革蘭氏染色法染成深藍(lán)色的革蘭氏陽性微生物；(b)采用革蘭氏染色法染成紅色的革蘭氏陰性微生物；和(c)采用革蘭氏染色法染成藍(lán)黑色但是通過形態(tài)學(xué)特征和尺寸與細(xì)菌進(jìn)行區(qū)分的非常大的圓形細(xì)胞的酵母細(xì)胞。(2)臨床革蘭氏組可以將革蘭氏組進(jìn)一步分成幾組代表有區(qū)別的形態(tài)學(xué)特征的子類。這些子類包括由有經(jīng)驗的實驗室技師報道的所有相關(guān)臨床信息，并由此提供比陽性或陰性革蘭氏反應(yīng)更高水平的鑒定。這種具體的分類是非常有用的，因為其通過采用自動化系統(tǒng)提供相當(dāng)?shù)呐R床相關(guān)信息消除了關(guān)于依賴革蘭氏染色質(zhì)量和/或技師讀取涂片的技能水平的問題。更具體而言，基于這種分類模型的微生物子類可以選自以下一種或多種 (a)球菌，其是小而圓的細(xì)胞；(b)雙球菌，其是結(jié)合在一起的兩個小而圓的細(xì)胞；(c)棒狀菌，其是矩形形狀；和(d)桿菌，其具有桿狀形狀。這些能夠通過其它形態(tài)學(xué)信息確證的子類的實例包括(i)革蘭氏陽性球菌；(ii)鏈狀革蘭氏陽性球菌；(iii)簇狀革蘭氏陽性球菌(即，“葡萄樣”簇)；(iv)革蘭氏陽性雙球菌；(ν)革蘭氏陽性桿菌；(vi)具有內(nèi)芽孢的革蘭氏陽性桿菌；(vii)革蘭氏陰性桿菌；(viii)革蘭氏陰性球桿菌；(ix)革蘭氏陰性雙球菌；(x)酵母菌；和(xi)絲狀真菌。(3)治療組治療組包括多種微生物物種，所述的微生物物種當(dāng)從具體試樣類胡中分離出來時，用同類抗生素或抗生素的混合物進(jìn)行處理(例如，如在“Sanford Guide to Antimicrobial Therapy 2008”中所述的)。在許多情況下，對于能夠從初始的經(jīng)驗療法改變至更靶向的療法的臨床醫(yī)師，不需要鑒定到種水平，因為一個以上的物種可以采用相同的抗生素選擇處理。這種分類水平正確地將這些“相同處理”的微生物歸類到單個治療類別。這種表征水平的實例包括區(qū)分高度耐藥的腸桿菌(Enterobacteriacae) (EB)種與敏感EB種(腸桿菌屬某些種(Enterobacter spp.)與大腸桿菌、或耐氟康唑的念珠菌種(光滑念珠菌(C. glabrata)和克柔念珠菌(C.kruzei))與敏感念珠菌種(白色念珠菌 (C. albicans)和近平滑念珠菌(C. parapsilosis))等等的能力。(4)功能組根據(jù)本發(fā)明，基于代謝、毒力和/或表型特性的混合，也可以將微生物歸類到幾個組中。非發(fā)酵性生物體可以明確地與發(fā)酵性生物體區(qū)分開。而且，產(chǎn)生溶血素的微生物物種可以與非溶血性物種分別進(jìn)行分組。在一些情況下 ，這些組表示比屬水平(例如，大腸桿菌類，革蘭氏陰性非發(fā)酵性桿菌)更寬泛的類別，一些在屬水平(例如，腸球菌屬 (Enterococcus)，念珠菌屬(Candida))，和一些具有更近于種水平的區(qū)分(例如，凝固酶陰性葡萄球菌，α-溶血性鏈球菌，β-溶血性鏈球菌，凝固酶陽性葡萄球菌，即金黃色葡萄球菌)。除了測量微生物的本征性質(zhì)用于鑒定目的外，本發(fā)明的方法可以進(jìn)一步包含使用其它鑒定劑來輔助分離和/或鑒定方法。與特異性微生物結(jié)合的作用劑，如親和配體，可以用于分離微生物，鑒定微生物的分類或物種(例如，通過與獨(dú)特的表面蛋白或受體結(jié)合)和 /或鑒別微生物的特征(例如，抗生素耐藥性)。所用的鑒定劑包括但不限于單克隆和多克隆抗體及其片段(例如，用于金黃色葡萄球菌鑒定的抗-Eap)、核酸探針、抗生素(例如，青霉素、萬古霉素、多粘菌素B)、適配體、肽模擬、噬菌體衍生結(jié)合蛋白、凝集素、宿主先天免疫生物標(biāo)記物(急性期蛋白、LPS結(jié)合蛋白、CD14、甘露糖結(jié)合凝集素、Toll樣受體)，宿主防御肽(例如，防御素、cathelicidins、proteogrins、爪蟾抗菌肽)、細(xì)菌素(bacterocins)(例如，羊毛硫抗生素(諸如乳酸鏈球菌肽、mersacidin、表皮素、雞葡萄球菌素(gallidermin) 和plantaricin C)，和II類肽)、細(xì)菌噬菌體和選擇性用于核酸、脂質(zhì)、碳水化合物、多糖、 莢膜/黏液或蛋白質(zhì)的染料、或其任意組合。如果作用劑自身沒有給出可檢測信號，則該作用劑可以諸如通過將該作用劑與基質(zhì)相容性化合物軛合來進(jìn)行標(biāo)記以提供可檢測信號?？梢栽诒景l(fā)明方法的任何步驟中，例如當(dāng)獲得樣品時、溶胞期間、和/或分離期間將作用劑加入微生物中。在一些實施方式中，在顆粒的探詢期間可以測定該物質(zhì)在顆粒中的存在。其它可用的鑒定劑包括微生物酶的底物、螯合劑和有毒化合物。在本發(fā)明的一個方面中，方法可以進(jìn)一步包含回收微生物顆粒和實施另外測試的步驟。在一個實施方式中，可以通過從樣品培養(yǎng)基和密度緩沖墊層中吸出來回收顆粒。在另一個實施方式中，可以通過將注射器插入容器并將顆粒吸出來回收顆粒，同時樣品培養(yǎng)基和密度緩沖墊層仍保持完整。然后可以將回收的顆粒再懸浮于合適介質(zhì)例如鹽水中。一旦再懸浮，可以對微生物進(jìn)行任何進(jìn)一步所需的測試，如本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員公知的以及如以上所述的。具體而言，用再懸浮的微生物可以實施需要清潔微生物樣品的任何測試。在一些實施方式中，可以進(jìn)行另外的鑒定測試。鑒定測試的實例包括Vitek 2、擴(kuò)增和非擴(kuò)增核酸測試(NAT)、顯色和乳膠凝集分析、免疫分析(例如，采用標(biāo)記的抗體和/或其它配體)、 質(zhì)譜法(例如，MALDI-T0F質(zhì)譜法)和/或其它光學(xué)技術(shù)諸如紅外光譜法(FTIR)或拉曼光譜法。也可以進(jìn)行其它表征測試，諸如抗生素和/或其它藥物的耐藥性。其它表征可以是在本方法的初始分離和鑒定步驟期間開始的測試的一部分。例如，耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌的檢測可以通過在分離微生物之前將標(biāo)記的青霉素加入樣品中開始。一旦已將顆粒回收并且再懸浮，可以測定結(jié)合標(biāo)記物的水平。在本發(fā)明的一個方面中，可以使一些或所有的方法步驟自動化。使本方法的步驟自動化不僅允許更快地測試更多的樣品，而且這也降低了處理可能包含有害和/或傳染性的微生物的樣品中的人為誤差的風(fēng)險。在本發(fā)明的某些實施方式中，方法還可以用于檢測檢測樣品中微生物的存在。在這些實施方式中，所述方法包括以下步驟(a)獲得檢測樣品；(b)可選地溶解所述檢測樣品中的細(xì)胞以產(chǎn)生溶胞樣品；和(c)使微生物與所述溶胞樣品的其它組分分離以形成微生物顆粒；其中顆粒的存在表明在檢測樣品中存在微生物。在一個實施方式中，使用裸眼檢測顆粒。在其它實施方式中，如本文所公開的，可以將顆粒再懸浮，移出，并通過質(zhì)譜法進(jìn)行探詢。在一些實施方式中，檢測方法能夠用于監(jiān)控被微生物污染的樣品，例如食品、藥物、飲用水等。在一個實施方式中，所述方法可以以重復(fù)模式實施用于定期監(jiān)控污染，例如， 每月一次，每周一次，每天一次，每小時一次或任何其它時間模式。在另一個實施方式中，可以根據(jù)需要對樣品進(jìn)行檢測，例如，當(dāng)懷疑受到污染時。在另外的實施方式中，檢測方法可以用于在臨床樣品例如血液培養(yǎng)物中尋找微生物的存在。例如，在某些時間點(diǎn)可以將樣品從血液培養(yǎng)基中移出并對樣品實施檢測方法以測定血液培養(yǎng)物是否是陽性的。在一個實施方式中，可以在培養(yǎng)物接種后的設(shè)定時間點(diǎn)取樣，例如，接種后24h取樣，以測定血液培養(yǎng)基是否是陽性的。在另一個實施方式中，可以定期例如，每12、6、4或2小時或每60、50、40、 30、20、15、10或5分鐘從血液培養(yǎng)物中取樣，以在可檢測為陽性的短時間內(nèi)鑒定陽性血液培養(yǎng)物。在檢測方法的某些實施方式中，檢測步驟可以可選地在如本文中描述的鑒定方法之后進(jìn)行。在本發(fā)明的一個方面，可以使一些或所有的方法步驟自動化。使方法步驟自動化允許檢測更有效地檢測大量的樣品并降低了在處理可能包含有害和/或傳染性的微生物的樣品中的人為誤差的風(fēng)險。然而，更重要的是，自動化能夠在白天或夜晚的任何時間傳遞關(guān)鍵性的結(jié)果而無延誤。一些研究已表明，更快速地鑒定導(dǎo)致敗血癥的生物體與改善患者護(hù)理，縮短住院時間并降低整個成本相關(guān)。根據(jù)本發(fā)明，用于表征和/或鑒定微生物的方法的更多細(xì)節(jié)和描述公開在都于 2009 年 10 月 30 日提交的標(biāo)題分別為“Method for Separation, Characterization and/or Identification of Microorganisms using Spectroscopy" 禾口“Method for Separation, Characterization and/or Identification of Microorganisms using Raman Spectroscopy”，序列號分別為—和—的未決美國專利申請中，將其內(nèi)容結(jié)合于本文中作為參考。在以下實施例中進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明，所述實施例通過舉例說明的方式提供而不是預(yù)期以任何方式限制本發(fā)明。利用本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)或下面具體描述的技術(shù)。實施例實施例1.用于通過MALDI-T0F質(zhì)譜法鑒定血液培養(yǎng)物中的微生物的溶胞-離心方法在低接種物水平下將微生物“接種”于含IOmL人血液的BacT/ALERT SA瓶子。在通過BacT/ALERT 3D微生物檢測系統(tǒng)標(biāo)記陽性的幾分鐘內(nèi)將血液培養(yǎng)液樣品從瓶子中移出。如下所示對培養(yǎng)液樣品進(jìn)行處理以從可能干擾后續(xù)分析的血液和培養(yǎng)基組分中將微生物分離出來將來自新鮮的陽性血液培養(yǎng)物的4. OmL培養(yǎng)液與2. OmL溶胞緩沖液(0.45% Brij 97在0. 3M CAPS, pH 11. 7中)合并，渦旋混合5秒并隨后在37°C的水浴中孵育90 秒。孵育后，在4個1. 5mL尖底離心管的每一個中將0. 95mL溶胞產(chǎn)物鋪層于0. 5mL密度緩沖墊層(14% w/v 碘海醇，0. 005% Pluronic F-108 在 IOmM Hepes,pH 7. 4 中)的頂部。然后將所有四個管以IOOOOg在25°C下離心2分鐘以通過密度緩沖墊層沉降(粒化)微生物。 溶胞血液和培養(yǎng)基仍保留在緩沖墊層的上方。當(dāng)完成離心周期時，除去上清液并將每一個管中的沉降(?；?的微生物用IOyL 純水再懸浮。將所有四個管的再懸浮微生物匯集到干凈的管中并輕輕地混合。然后調(diào)節(jié)每一個處理的試樣的體積以使最終懸浮液在660nm的光密度(A66tl)等于20/cm。將處理的試樣在2 8°C下儲存用于當(dāng)天測試，或者將其等分并冷凍于_70°C下用于在以后日期中測試。實施例2.通過MALDI-TOF MS分析采用溶胞-離心法從陽性血液培養(yǎng)物中處理的微生物試樣將根據(jù)實施例1的程序處理的試樣在37°C下迅速解凍(如果先前實施了冷凍)， 輕輕地混合，然后在純水中稀釋至使用強(qiáng)度(1 4、1 8和1 16)。以二重復(fù)制將每種稀釋試樣各l.OyL施用于MALDI-T0F靶板上。向每種二重復(fù)制中的一份中加入l.OyL 50%甲酸。允許所有施用的試樣在環(huán)境溫度下干燥，然后施用LOyL的基質(zhì)溶液?；|(zhì)由 Alpha-Cyano ( α -氰基-4-羥基肉桂酸溶液，AnagnosTec GmbH,德國)和 DHB (2，5_ 二羥基苯甲酸，AnagnosTec GmbH，德國)的50 50混合物組成。為了進(jìn)行比較，使對應(yīng)的微生物分離物生長在適合于該物種的瓊脂培養(yǎng)基上，并以二重復(fù)制直接涂抹于MALDI-T0F靶板上。將在二重復(fù)制的涂覆點(diǎn)之一上的微生物用 l.OyL純水，接著用LOyL 50%甲酸在原位再懸浮。允許來自給定的分離物的兩個涂覆點(diǎn)干燥，然后向每一個涂覆點(diǎn)加入l.OyL的基質(zhì)混合物。在所有微生物試樣都完全干燥之后，在Axima Assurance MALDI-TOF質(zhì)譜儀 (Shimadzu Biotech North America, Maryland)2, 000-34, 000 白勺M / ^ 范圍內(nèi)獲得MALDI-TOF質(zhì)譜圖。從陽性血液培養(yǎng)物中回收的所選微生物的代表性質(zhì)譜圖在圖1 3中示出。為了清楚起見將圖中的質(zhì)/荷比范圍減少，但是對于所有質(zhì)量范圍都保持這些圖中舉例說明的相同發(fā)現(xiàn)。圖1顯示了對于四個物種的每一種，從為清楚例證而平均化的5種臨床分離物的接種血液培養(yǎng)物中處理的微生物的譜圖。在給定質(zhì)/荷比處有峰或無峰的顯著差異是顯而易見的并且對這些生物體是特征性的。對于所有譜圖沒有共同的質(zhì)/荷峰，這表明在根據(jù)本發(fā)明處理之后由于血液或培養(yǎng)基的遺留，使?jié)撛谘诒蔚馁|(zhì)量如果存在，也只會存在極少。圖2顯示了圖1中平均化所示的金黃色葡萄球菌分離物的5個單獨(dú)的質(zhì)譜圖。這 5個譜圖顯示了，在不同臨床分離物之間，甚至在生長于具有不同血液供體的不同血液培養(yǎng)基中時，這種微生物的質(zhì)譜圖的一致性。圖3顯示了與從在瓊脂培養(yǎng)基(具有5%綿羊血液的胰酶大豆瓊脂，bioMerieuxInc.)上生長的菌落直接采樣的相同5種分離物的譜圖相比，圖1中所示的5種大腸桿菌分離物的平均譜圖。質(zhì)譜圖的相似性表明，血液培養(yǎng)物的處理有效地除去了不是微生物來源的物質(zhì)，同時保留了微生物特異性的那些質(zhì)量。實施例3.通過MALDI-TOF MS和商購可獲得的微生物鑒定數(shù)據(jù)庫鑒定采用溶胞-離心法從陽性血液培養(yǎng)物中處理的微生物試樣按照實施例1和實施例2的描述對123種微生物分離物進(jìn)行生長、處理和質(zhì)量分析。這些微生物包含在臨床血液培養(yǎng)基中通常檢測到的14種細(xì)菌和酵母菌。在每個質(zhì)譜圖獲得之后，將質(zhì)量峰的表格輸入到“Saramis”微生物鑒定軟件 (AnagnosTec GmbH，德國)中進(jìn)行分析。該軟件是基于瓊脂生長的微生物收集的MALDI-T0F 質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的。表1表明，平行來自相同種菌培養(yǎng)的生長在血液培養(yǎng)基和瓊脂培養(yǎng)基上的所有分離物的結(jié)果。表1中的結(jié)果是對所有培養(yǎng)物列表的，雖然對于一些分離物在最終懸浮液中的細(xì)胞濃度低于實施例1中指定的目標(biāo)濃度。在其中細(xì)胞濃度低于目標(biāo)值20%的情況下， 將那些分離物從列表中移出并將其余分離物的結(jié)果匯編于表2中。實際上，低細(xì)胞數(shù)培養(yǎng)物可以通過降低顆粒再懸浮液體積或通過處理更大體積的培養(yǎng)液進(jìn)行補(bǔ)償。表1和表2中的“精確到種”欄是指分離物的數(shù)量，其中將來自給定分離物的一組目標(biāo)涂覆點(diǎn)的至少一個通常是多個譜圖正確地鑒定為單一物種或兩個至三個緊密相關(guān)的物種，置信水平是至少90%。同樣，如果譜圖匹配數(shù)據(jù)庫，到正確的屬或科達(dá)到至少90%的置信度，但是沒有物種指示，則分離物被認(rèn)為正確地鑒定到屬或科水平?！盁o/錯誤ID”欄是產(chǎn)生一般對于適當(dāng)ID質(zhì)量太低的質(zhì)譜，導(dǎo)致不可靠的鑒定或罕見地導(dǎo)致錯誤鑒定的分離物。對于本研究這些標(biāo)準(zhǔn)被認(rèn)為是合理的，但是該軟件容許技術(shù)用戶為了個體需要而自由設(shè)定合適的鑒定置信度標(biāo)準(zhǔn)。采用本發(fā)明對微生物鑒定的成功率，精確到種水平將近95%，明顯優(yōu)于采用以前已知的處理方法實施的既往研究，在既往研究中已報道正確鑒定< 76% (參見，例如，MAIER, T.等，“Rapid Identification of Bacteria from Blood Cultures Using MALDI-TOF MS”，Poster ICAAC 48th Annual Meeting, 2008 ；還參見，例如，Drake 等， "MALDI-TOF Mass Spectrometry Based Identification of Clinically Important Microorganisms",ASMS Poster,Philadelphia 2009)。許多數(shù)學(xué)模型或譜圖數(shù)據(jù)庫都可以用于鑒定血液培養(yǎng)物中的微生物，但是這些采用商業(yè)數(shù)據(jù)庫的結(jié)果最好表明通過本發(fā)明處理的血液培養(yǎng)基的微生物無污染物質(zhì)量峰從而足以匹配來自“純”菌落的瓊脂生長的譜圖數(shù)據(jù)庫。表1:所有分離物
權(quán)利要求
1.一種從檢測樣品中表征和/或鑒定微生物的方法，包括(a)獲得已知包含或可能包含微生物的檢測樣品；(b)選擇性地溶解所述檢測樣品中的非微生物細(xì)胞以產(chǎn)生溶胞樣品；(c)將微生物與所述溶胞樣品的其它組分分離以形成所述微生物的離析的樣品；(d)通過質(zhì)譜法對所述微生物的所述離析的樣品進(jìn)行探詢以獲得所述微生物的質(zhì)譜圖；和(e)通過將所測定的質(zhì)譜圖與參考質(zhì)譜圖和/或與已知微生物的細(xì)胞組分的已知或預(yù)測的質(zhì)量對比來表征和/或鑒定所述離析的樣品中的所述微生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中將來自步驟(c)的所述離析的微生物樣品的至少一部分回收并且在所述探詢步驟(d)之前置于載體底物上。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(c)中的分離方式是離心。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(c)中的分離方式是過濾。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在所述探詢步驟(d)之前的分離期間，將來自步驟 (c)的所述離析的微生物樣品的至少一部分直接沉積于載體底物上。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述質(zhì)譜法選自由MALDI-TOF質(zhì)譜法、解吸電噴霧電離(DESI)質(zhì)譜法、GC質(zhì)譜法、LC質(zhì)譜法、電噴霧電離(ESI)質(zhì)譜法和選擇離子流量管 (SIFT)質(zhì)譜法組成的組。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，基于一種或多種表型和/或形態(tài)學(xué)特征對所述微生物進(jìn)行表征。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，將所述微生物表征到一種或多種分類模型上，所述分類模型選自由革蘭氏組、臨床革蘭氏組、治療組和功能組組成的組。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中將所述微生物鑒定到屬水平、種水平或菌株水平。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述選擇性溶胞步驟(b)采用含有一種或多種清潔劑的溶胞溶液進(jìn)行。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述一種或多種清潔劑選自由Triton X-100、Triton X-IOO-R、Triton X-114、NP-40、Genapol C-100、Genapol X-100、 Igepal CA 630、Arlasolve 200、Brij 96/97, CHAPS、辛基 β _D_ 吡喃葡萄糖苷、皂苷、 單十二烷基九乙二醇醚(C12E9，聚多卡醇(polidocenol))、十二烷基硫酸鈉、N-月桂酰肌氨酸、脫氧膽酸鈉、膽汁鹽類、十六烷基三甲基溴化銨、SB3-10、SB3-12、氨基磺基甜菜堿-14 (amidosulfobetaine-14)、C7Bz0、Brij 98、Brij 58、Brij 35、Tween 80、 Tween “ 20、Pluronic L64、Pluronic P84、非清潔性磺基甜菜堿(NDSB 201)、兩親高分子(amphipols) (PMAL-C8)和甲基-β -環(huán)糊精組成的組。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述清潔劑是包含C12_18/E9_1(i結(jié)構(gòu)的聚氧乙烯清潔劑。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述聚氧乙烯清潔劑選自由Brij 97、Brij 96V、Genapol C-100、Genapol X-100 和聚多卡醇(polidocenol)組成的組。
14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述溶胞溶液進(jìn)一步包含一種或多種酶，所述一種或多種酶包括一種或多種蛋白酶和一種或多種核酸酶的混合物。
15.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述溶胞溶液包含一種或多種緩沖劑。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中將所述溶胞樣品鋪層在容器中的密度緩沖墊層上，并且其中將所述容器離心以形成微生物顆粒。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述密度緩沖墊層包含以下物質(zhì)中的一種或多種膠體二氧化硅、碘化造影劑、蔗糖、顯微鏡浸鏡油、礦物油、硅油、氟硅油、硅凝膠、甲泛影酸鹽-Ficoll 、泛影酸鹽-葡聚糖、羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚環(huán)氧乙烷(高分子量)、Pluronic F 127、Pluronic F68、聚丙烯酸、交聯(lián)的聚乙烯醇、交聯(lián)的聚乙烯吡咯烷、PEG甲醚甲基丙烯酸酯、果膠、瓊脂糖、黃原膠、膠凝糖、Phytagel 、山梨醇、Ficoll 、甘油、葡聚糖、糖原、氯化銫、全氟碳流體、和/或氫氟碳流體，及其組合。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述檢測樣品是已知包含微生物的培養(yǎng)樣品。
19.一種從血液培養(yǎng)物中表征和/或鑒定微生物的方法，包括(a)從已知包含或可能包含微生物的血液培養(yǎng)物中獲得樣品；(b)選擇性地溶解所述樣品中的非微生物細(xì)胞以產(chǎn)生溶胞樣品；(c)將所述的溶胞樣品鋪層在密閉容器中的密度緩沖墊層上；(d)將容器離心以使微生物與所述樣品中的其它組分分離并形成微生物顆粒；(e)通過質(zhì)譜法對所述微生物的所述離析的樣品進(jìn)行探詢以獲得所述微生物的質(zhì)譜圖；和(f)通過將所測定的質(zhì)譜圖與參考質(zhì)譜圖和/或與已知微生物的細(xì)胞組分的已知或預(yù)測的質(zhì)量對比來表征和/或鑒定所述離析的樣品中的所述微生物。
20.一種表征和/或鑒定微生物的方法，包括(a)獲得已知包含或可能包含微生物的檢測樣品；(b)將所述檢測樣品鋪層在容器中的密度緩沖墊層上方；(c)將所述容器離心以使微生物與所述檢測樣品的其它組分分離并形成微生物顆粒；(d)通過質(zhì)譜法對所述顆粒進(jìn)行探詢以獲得所述微生物的質(zhì)譜圖；和(e)通過將所測定的質(zhì)譜圖與參考質(zhì)譜圖和/或與已知微生物的細(xì)胞組分的已知或預(yù)測的質(zhì)量對比來表征和/或鑒定所述離析的樣品中的所述微生物。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中將來自步驟(e)的所述微生物顆粒的至少一部分回收并在所述探詢步驟(d)之前置于載體底物上。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述質(zhì)譜法選自由MALDI-T0F質(zhì)譜法、解吸電噴霧電離(DESI)質(zhì)譜法、GC質(zhì)譜法、LC質(zhì)譜法、電噴霧電離(ESI)質(zhì)譜法和選擇離子流量管 (SIFT)質(zhì)譜法組成的組。
23.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述密度緩沖墊層選自由膠體二氧化硅、碘化造影劑、蔗糖、顯微鏡浸鏡油、礦物油、硅油、氟硅油、硅凝膠、甲泛影酸鹽-Ficoll 、泛影酸鹽_葡聚糖、羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚環(huán)氧乙烷(高分子量)、Pluronic F 127、PluroniC F68、聚丙烯酸、交聯(lián)的聚乙烯醇、交聯(lián)的聚乙烯吡咯烷、PEG甲醚甲基丙烯酸酯、果膠、瓊脂糖、黃原膠、膠凝糖、Phytagel 、山梨醇、Ficoll 、甘油、葡聚糖、糖原、氯化銫、全氟碳流體、和/或氫氟碳流體、及其組合組成的組。
24.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中基于一種或多種表型特征和/或形態(tài)學(xué)特征對所述微生物進(jìn)行表征。
25.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中將所述微生物表征到一種或多種分類模型中， 所述分類模型選自由革蘭氏組、臨床革蘭氏組、治療組、和功能組組成的組。
26.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中將所述微生物鑒定到屬水平、種水平、或菌株水平。
27.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述檢測樣品是已知包含微生物的培養(yǎng)樣品。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于分離、表征和/或鑒定檢測樣品中的微生物的方法。本發(fā)明的方法包括用于溶解可能存在于檢測樣品中的非微生物細(xì)胞的可選的溶胞步驟，接著是后續(xù)的分離步驟。該方法可以用于從復(fù)雜樣品諸如含血液的培養(yǎng)基中分離、表征和/或鑒定微生物。本發(fā)明還提供通過質(zhì)譜法對分離的微生物樣品進(jìn)行探詢以產(chǎn)生微生物的質(zhì)譜圖并利用所獲得的質(zhì)譜圖表征和/或鑒定樣品中的微生物。
文檔編號C12M1/34GK102317789SQ200980153288
公開日2012年1月11日 申請日期2009年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月31日
發(fā)明者布拉德福德·克萊, 瓊斯·海曼, 瑟曼·索普, 約翰·沃爾什 申請人:生物梅里埃公司