專利名稱：基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)的嗜肺軍團菌基因快速診斷試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測試劑，具體涉及一種嗜肺軍團菌基因快速診斷試劑盒及其檢測方法。
背景技術(shù)：
目前對嗜肺軍團菌有多種檢測方法，從以病原微生物分離鑒定、
形態(tài)學(xué)鑒定和自動生化鑒定為主的國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T4789.7—2003)，到特異蛋白的免疫學(xué)檢測技術(shù)、核酸探針、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)等分子生物學(xué)檢測方法[食品安全檢測與現(xiàn)代生物技術(shù)，化學(xué)工業(yè)出版社，2004年]。其中病原核酸檢測在快速性、安全性、準(zhǔn)確性和靈敏性等方面都有很大的提高，這些新技術(shù)試圖突破傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)、生化反應(yīng)等微生物學(xué)檢測舊模式，不需要對微生物進行分離提純，而直接用樣品或樣品的增菌液對其基因及基因產(chǎn)物進行快速檢測，并且與分子生物學(xué)技術(shù)及生物信息學(xué)手段相結(jié)合，向準(zhǔn)確、快速、靈敏和自動化的方向發(fā)展。
以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)為代表的病原核酸檢測技術(shù)在實際應(yīng)用中也存在一些問題，如普通聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)需要專門的儀器，而且存在容易交叉污染和操作過程煩瑣的缺點。而熒光實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real time PCR)技術(shù)雖然較好地解決了交叉污染的問題，并簡化了操作過程，但卻需要更復(fù)雜的定量測定儀器， 因此不適用于現(xiàn)場快速檢測。而且實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR技術(shù) 中熒光探針的成本較高，加大了推廣應(yīng)用的難度。免疫學(xué)檢測技術(shù)快 速簡便成本低廉，但要求高質(zhì)量高穩(wěn)定性的單克隆抗體，否則因準(zhǔn)確 性不夠，目前只能是輔助檢測手段。所以及時運用生物技術(shù)發(fā)展的最 新成果對滿足病原微生物檢測要求的不斷提高具有重要意義。其中等溫擴增(Isothermal Amplification)核酸快速檢測技術(shù)是病原核酸檢測 技術(shù)上的長足進步，現(xiàn)已建立起來的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù) (loop-mediated isothermal amplication of DNA,簡稱LAMP)具有很多的優(yōu)越性，且目前也未見有用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)檢測嗜肺軍團菌的基因快速診斷試劑盒。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種檢測成本 低、使用方便、檢測速度快、特異性高的基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)的 嗜肺軍團菌基因快速診斷試劑盒。本發(fā)明的另一個目的是提供上述嗜肺軍團菌基因快速診斷試劑 盒的檢測方法。本發(fā)明的上述目的是通過如下技術(shù)方案予以實現(xiàn)的一、本發(fā)明的嗜肺軍團菌基因快速診斷試劑盒，是由兩對引物、 萬WDNA聚合酶、反應(yīng)液、穩(wěn)定液、樣品預(yù)處理液、顯色液和陽性對 照液組成，以上七種液體分別置于容器中，其中所述的兩對引物為外引物F3: TCTATTGAAATAGCACTTAAGCT,如SEQ ID NO: 1
所示；
外引物B3: TGGATTCCGATCGGGATG,如SEQ ID NO:2所示；
內(nèi)弓I物FIP: GCTGTTCCATAACTGCTCACAATTTttttAATTTAGAGTCTTCATACGACTGA，如SEQ ID NO:3所示；
內(nèi)引物BIP: TTAGAAGTAAGTCGAAATGCGAGTGttttGTATTTCATTGCCAGCCTG，如SEQ ID NO:4所示；
上述每1L反應(yīng)液中含有1.6 2mmol dNTP 、 20 25mmolTris-HCl、 10 12.5mmol氯化鉀、10 12.5mmol硫酸銨、8 10mmol硫酸鎂、l 1.25ml TritonX-lOO、 0.8 lmol甜菜堿、內(nèi)引物FIP/BIP各1.6 2mol和外引物？3/63各0.2 0.2511101;優(yōu)選的比例是每1L反應(yīng)液中含有2mmo1 dNTP、 25mmo1 Tris-HCl、 12.5mmol氯化鉀、12.5mmo1硫酸銨、10mmol硫酸鎂、1.25ml TritonX-lOO、 lmol甜菜堿、內(nèi)引物FIP/BIP各2mol和外引物F3/B3各0.25mo1。
上述每1L樣品預(yù)處理液中含有10 20 mmol pH 8.0的Tris-HCl、1 2 mmol EDTA和10 12ml Triton X-IOO。優(yōu)選的比例是每1L樣品預(yù)處理液中含有20mmo1 Tris-HCl (pH 8.0)、 2匪o1 EDTA和12ml TritonX陽IOO。
上述顯色液優(yōu)選為熒光染料SYBR Green I或EvaGreen;
上述穩(wěn)定液優(yōu)選為石蠟油。
上述陽性對照為嗜肺軍團菌基因組DNA 。
二、本發(fā)明基因快速診斷試劑盒的生產(chǎn)工藝
61、 將內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成純化后，定量配制， 濃度檢測，抽樣質(zhì)檢；2、 將反應(yīng)液無菌分裝，并按照實驗用進行濃度確定，抽樣質(zhì)檢;3、 將穩(wěn)定液無菌分裝，抽樣質(zhì)檢；4、 將陽性對照標(biāo)本制備，分裝，抽樣質(zhì)檢；5、 組裝試劑盒。三、本發(fā)明基因快速診斷試劑盒的檢測方法1、 樣品處理將待測樣品經(jīng)濾膜(濾膜孔徑為0.22um 0.45um)過濾，洗 脫后，于離心管中離心，去上清，沉淀中加入樣品預(yù)處理液并混合均 勻，沸水浴滅活后冰上冷卻，高速離心后，上清即為樣品模板DNA;2、 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)反應(yīng)過程在反應(yīng)管中加入反應(yīng)液38 40體積％， Bst DNA聚合酶大片段 0.9 1.8體積％，穩(wěn)定液52 54.5體積Q^，樣品模板DNA 4.5 9體 積Q^， 63 65"恒溫反應(yīng)45 90min。所述體積百分比是指占四個組 分總體積的體積百分比。3、 反應(yīng)后處理在上述反應(yīng)管和陽性對照組中分別加入顯色液，混勻，樣品組顯 色與對照組相同則為陽性，否則為陰性。本發(fā)明的原理是利用SW DNA聚合酶和根據(jù)靶基因序列設(shè)計的 兩對特殊的內(nèi)、外引物(即內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3)，特異 性識別靶序列上的六個獨立區(qū)域，啟動循環(huán)鏈置換反應(yīng)，在靶標(biāo)DNA區(qū)啟動互補鏈合成，結(jié)果在同一鏈上互補序列周而復(fù)始形成有很多
環(huán)的花椰菜結(jié)構(gòu)的莖-環(huán)DNA混合物。LAMP反應(yīng)過程中，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg^結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物——焦磷酸鎂乳白色沉淀，即可通過肉眼觀察判定結(jié)果。LAMP反應(yīng)是在恒溫(63 65°C)條件下45 90分鐘內(nèi)完成。這種比較溫和的溫度條件以及沒有溫度循環(huán)使所需儀器簡單化，克服了傳統(tǒng)PCR固有的檢測時間長、容易污染及檢測成本高等缺點。此外，這種檢測方法對檢測人員的技術(shù)素質(zhì)要求較低，實際操作極為簡便，不需要特殊的試劑和儀器設(shè)備，有利于建立成本低廉的快速篩選體系。LAMP法是一種簡便、快速、高度特異性的基因擴增法。將恒溫基因擴增技術(shù)與PCR技術(shù)(包括熒光實時定量PCR技術(shù))進行比較，可以發(fā)現(xiàn)該技術(shù)在靈敏度、特異性和檢測范圍等方法學(xué)指標(biāo)上相當(dāng)于或優(yōu)于PCR技術(shù)，且不依賴任何專門的儀器設(shè)備即可實現(xiàn)現(xiàn)場高通量快速檢測，而且檢測成本遠低于熒光定量PCR技術(shù)。國內(nèi)目前尚未有這方面的試劑盒出售。目前國家標(biāo)準(zhǔn)中以微生物分離培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)鑒定為主、結(jié)合生化分析和血清學(xué)分型鑒定的通行方法，初步鑒定需2 3天，完成鑒定報告需10 15天；采用本發(fā)明的基因快速診斷試劑盒僅需2小時。并且，本發(fā)明的反應(yīng)液中加入了顯色液，鑒定結(jié)果更為直觀清晰。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果l.本發(fā)明的基因快速診斷試劑盒只需一個恒定溫度就能擴增反應(yīng)，不需要特殊試劑與設(shè)備，檢測成本低；2.本發(fā)明的基因快速診斷試劑盒應(yīng)用六個區(qū)段，四條引物，根據(jù)是否擴增就能判斷靶標(biāo)物質(zhì)的存在與否，因此具有高特異性；3.本發(fā)明的基因快速診斷試劑盒擴增
快速且高效，在不到1小時即可完成擴增，且產(chǎn)率高；4.本發(fā)明的基因快速診斷試劑盒靈敏度高，擴增模板僅需10拷貝或更少；5.本發(fā)
明的基因快速診斷試劑盒鑒定簡便，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的MgZ+結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物一焦磷酸鎂沉淀，可通過肉眼觀察鑒定，并且加入顯色液后，陰陽性結(jié)果顯色差異顯著，驗證率高，更加明顯可靠。


圖1為LAMP結(jié)果l為陽性對照；2為陰性對照；3-10為陽性樣品；11-12為干擾樣品，其中l(wèi)l為沙門氏菌樣品，12為副溶血弧菌樣品；
圖2為LAMP檢測結(jié)果電泳"M"為DNA分子標(biāo)準(zhǔn)，"1"為陽性對照，"2"為陰性對照，"3 10"分別為軍團菌分離培養(yǎng)液樣品，"11"為沙門氏菌樣品，"12"為副溶血弧菌樣品
具體實施例方式
實施例l試劑盒的制備
(1)按以下序列經(jīng)DNA合成儀合成寡聚脫氧核酸引物外引物F3: TCTATTGAAATAGCACTTAAGCT，如SEQIDNO:l所示；
外引物B3: TGGATTCCGATCGGGATG，如SEQIDNO:2所示；內(nèi)引物FIP: GCTGTTCCATAACTGCTCACAATTTttttAATTTAG AGTCTTCATACGACTGA，如SEQ ID NO:3所示；內(nèi)引物BIP: TTAGAAGTAAGTCGAAATGCGAGTGttttGTATTT CATTGCCAGCCTG，如SEQ ID NO:4所示；(2) 購置DNA聚合酶polymerase (大片段)，置于容器。(3) 配制反應(yīng)液反應(yīng)液的配方按每1L溶液含有2mmo1 dNTP、 25mmol Tris-Cl、 12.5mmol氯化鉀、12.5mmol硫酸銨、lOmmol硫 酸鎂、1.25ml TritonX-lOO、 lmol甜菜堿、內(nèi)引物FIP/BIP各2mol 和外引物F3/B3各0.25mol配制，置于容器。(4) 配制樣品預(yù)處理液樣品預(yù)處理液的配方按每1L溶液含有20 mmolTris-HCl (pH8.0) 、 2 mmol EDTA和12ml Triton X-100配審lJ， 置于容器。(5) 購置穩(wěn)定液石蠟油，置于容器；(6) 購置顯色液SYBR Green I，置于容器。(7) 提取陽性對照金黃色葡萄球菌基因組DNA，置于容器。(8) 將上述7個容器裝成試劑盒，封裝。 制備工藝簡述如下1、 將內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成純化后，定量配制， 濃度檢測，抽樣質(zhì)檢；2、 將反應(yīng)液無菌分裝，并按照實驗用進行濃度確定，抽樣質(zhì)檢；3、 將穩(wěn)定液分裝，抽樣質(zhì)檢；4、 將陽性對照標(biāo)本制備，分裝，抽樣質(zhì)檢；5、組裝試劑盒。實施例2試劑盒的制備
反應(yīng)液的配方為每1L反應(yīng)液中含有1.6mmol dNTP、 20mmolTris-HCl、 10mmol氯化鉀、10mmol硫酸銨、8mmol硫酸鎂、lml TritonX-100、 0.8mol甜菜堿、內(nèi)引物FIP/BIP各1.6mol和外引物F3/B3各0.2mol;
樣品預(yù)處理液的配方為每lL樣品預(yù)處理液中含有10mmo1 pH8.0的Tris-HCl、 l纖ol EDTA和10ml Triton X-IOO。顯色液為EvaGreen。其他同實施例l。
實施例3嗜肺軍團菌基因快速診斷試劑盒的應(yīng)用
(1) 實驗?zāi)康?br> 評價廣州華峰生物科技有限公司研制的嗜肺軍團菌LAMP基因快速檢測試劑盒(實施例l)的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度。
(2) 參比試劑的選擇
選擇廣州市疾病預(yù)防控制中心日常檢測中使用的常規(guī)試劑，中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)軍團病診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則WS 195-2001為對照。
考核的試劑為廣州華峰生物科技有限公司研制的嗜肺軍團菌LAMP基因快速檢測試劑盒(實施例1)。控制中心提供的已經(jīng)過對照方法確認(rèn)為陽性的8份軍團菌分離培養(yǎng)液，及2份干擾菌株；軍團菌的培養(yǎng)由疾控 中心完成。(4) LAMP反應(yīng)操作LAMP反應(yīng)操作按廣州華峰生物科技有限公司研制的嗜肺軍團 菌LAMP基因快速檢測試劑盒說明書進行，在金屬浴中完成65"C保 溫lh，時間誤差1 2min;由廣州華峰生物科技有限公司技術(shù)員操作。(5) 對照實驗同時由疾控中心技術(shù)員對相同的樣品依據(jù)衛(wèi)生部發(fā)布的《軍團病 診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則WS 195-2001》要求對樣品進行軍團菌的分離 培養(yǎng)及鑒定等確認(rèn)程序確認(rèn)進行對照實驗。(6) 結(jié)果對照組檢測結(jié)果為8例分離培養(yǎng)液為軍團菌陽性而2例干擾菌株 樣品均為陰性。使用LAMP方法檢測結(jié)果見表1、圖1和圖2，同樣8例陽性2 例陰性。圖1中，若反應(yīng)管與對照管一樣顯現(xiàn)綠色則為陽性，若反應(yīng) 管顯現(xiàn)橙色則為陰性。圖2為圖1的LAMP方法檢測結(jié)果電泳圖。 此次實驗結(jié)果表明設(shè)計的引物及組裝的試劑盒(實施例1)可以檢測 到樣品中的軍團菌?；诃h(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)的嗜肺軍團菌基因快速診斷試劑盒及其檢測方法序列表.txt SEQUENCE LISTING
〈110〉 廣州華峰生物科技有限公司
<120>基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)的嗜肺軍團菌基因快速診斷試劑盒及其檢測方法
<130>
〈160〉 4
<170> Patentln version 3.2
<210> 1
<211〉 23
<212> 腿
〈213〉 人工合成
<400〉 1
tctattgaaa tagcacttaa get 23
<210〉 2
<211> 18
〈212〉 DNA <213〉人工合成
<400> 2
tggattccga tegggatg 18
<210〉 3
〈211> 53
<212〉 腿 <213〉人工合成
<400〉 3
gctgttccat aactgctcac aattttttta atttagagtc ttcatacgac tga 53
<210〉 4
<211> 48
<212> DNA 〈213〉人工合成
〈400〉 4
ttagaagtaa gtcgaaatgc gagtgttttg tatttcattg ccagcctg 48
權(quán)利要求
1、一種嗜肺軍團菌基因快速診斷試劑盒，其特征在于由兩對引物、Bst DNA聚合酶、反應(yīng)液、穩(wěn)定液、樣品預(yù)處理液、顯色液和陽性對照液組成，以上七種液體分別置于容器中，上述兩對引物為外引物F3TCTATTGAAATAGCACTTAAGCT；外引物B3TGGATTCCGATCGGGATG；內(nèi)引物FIPGCTGTTCCATAACTGCTCACAATTTttttAATTTAGAGTCTTCATACGACTGA；內(nèi)引物BIPTTAGAAGTAAGTCGAAATGCGAGTGttttGTATTTCATTGCCAGCCTG；每1L反應(yīng)液中含有1.6～2mmol dNTP、20～25mmol Tris-HCl、10～12.5mmol氯化鉀、10～12.5mmol硫酸銨、8～10mmol硫酸鎂、1～1.25ml TritonX-100、0.8～1mol甜菜堿、內(nèi)引物FIP/BIP各1.6～2mol和外引物F3/B3各0.2～0.25mol；每1L樣品預(yù)處理液中含有10～20mmol pH 8.0的Tris-HCl、1～2mmol EDTA和10～12ml Triton X-100；上述陽性對照為嗜肺軍團菌基因組DNA。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于所述的顯色液為SYBR Green域EvaGreen。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述試劑盒，其特征在于所述每1L樣品預(yù)處理 液中含有20 mmol pH 8.0的Tris- HC1、 2mmo1 EDTA和12ml TritonX-IOO。
4、根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于所述每1L反應(yīng)液中 含有2mmo1 dNTP、 25mmol Tris-HC1、 12.5mmol氯化鉀、12.5mmo1 硫酸銨、lO醒ol硫酸鎂、1.25ml TritonX-100、 lmol甜菜堿、內(nèi)引 物FIP/BIP各2mo1和外引物F3/B3各0.25mol。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于所述穩(wěn)定液為石蠟油。
6、 一種檢測嗜肺軍團菌的方法，其特征是使用權(quán)利要求l所述試劑盒，按下列歩驟進行(1) 將待測樣品經(jīng)濾膜過濾，洗脫后，于離心管中離心，去上 清，沉淀中加入樣品預(yù)處理液并混合均勻，沸水浴滅活后冰上冷卻，高速離心后，上清即為樣品模板DNA;(2) 在反應(yīng)管中加入反應(yīng)液38 40體積％， BstDNA聚合酶大 片段0.9 1.8體積％，穩(wěn)定液52 54.5體積％，樣品模板DNA4.5 9體積％，恒溫反應(yīng)；(3) 在上述反應(yīng)管和陽性對照組中分別加入顯色液，混勻，樣 品組顯色與對照組相同則為陽性，否則為陰性。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述檢測方法，其特征在于步驟(1)中，濾 月莫孔徑為0.22 ti m 0.45 u m。
8、 根據(jù)權(quán)利要求6所述檢測方法，其特征在于步驟(2)中，恒 溫反應(yīng)的反應(yīng)條件為溫度63 65°C ，反應(yīng)時間45 90min。
全文摘要
本發(fā)明公開了基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)的嗜肺軍團菌基因快速診斷試劑盒及其檢測方法，該試劑盒由兩對引物、DNA聚合酶、穩(wěn)定液、反應(yīng)液、樣品預(yù)處理液、顯色液和陽性對照液組成，以上七種液體分別置于容器中。本發(fā)明的基因快速診斷試劑盒應(yīng)用六個區(qū)段，四條引物，根據(jù)是否擴增就能判斷靶標(biāo)物質(zhì)的存在與否，因此具有高特異性。本發(fā)明的基因快速診斷試劑盒快速、高效、靈敏度高，只需一個恒定溫度就能擴增反應(yīng)，不需要特殊試劑與設(shè)備，檢測成本低。本發(fā)明的基因快速診斷試劑盒鑒定簡便，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg²⁺結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物——焦磷酸鎂沉淀，可通過肉眼觀察鑒定，并且加入顯色液后，陰陽性結(jié)果顯色差異顯著，更加明顯可靠。
文檔編號C12Q1/68GK101654706SQ20091014276
公開日2010年2月24日 申請日期2009年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月30日
發(fā)明者曹以誠, 李心暉, 李志勇, 杜正平, 柯昌文, 譚慧媚, 鄧小玲, 洵 陳 申請人:廣州華峰生物科技有限公司