專利名稱：：抗-ox40l抗體的制作方法抗-OX40L抗體本申請是國際申請?zhí)枮?PCT/EP2005/009968"，國際申請日為2005年9月16日，發(fā)明名稱為"抗-0X40L抗體"，進入國家階段日期為2007年3月16日，中國申請?zhí)枮?200580031358.X"專利申請的分案申請。本發(fā)明一般涉及抗-OX40L抗體，并且特別地涉及不結(jié)合補體因子Clq的抗-OX40L抗體，涉及其藥物組合物及應(yīng)用。優(yōu)選地，這些抗體是人的或人源化的抗體。當CD40/CD40L連接時，人OX40L(gp34,SwissProtP23510)在活化的B細胞和樹突細胞上表達，并且在炎癥組織的內(nèi)皮細胞上表達(綜述:Weinberg,A.D.，TrendsImmunol.23(2002)102-109)。它首次從HTLV-1感染的人白血病細胞中分離出來(這些T細胞通過與OX40產(chǎn)生autokrine環(huán)而無限增殖)。例如，OX40L和針對其的抗體在下列各項中提及WO95/12673;WO95/21915;WO99/15200;Baum,RR.，等"EMBOJ.13(1994)3992-4001;Im腦,A.，等.,Blood89(1997)2951-2958;Imura，A"等.，J.Exp.Med.183(1996)2185-2195;Kjaergaard,J"等"J.Immunol.167(2001)6669-6677;Lane，P"J.Exp.Med.191(2000)201-206;Mallett,S.,禾HBarclay,A.N.,Immunol.Today12(1991)220-223;Mallett,S.，等.，EMBOJ.9(1990)1063-1068;Ndhlovu，L.C.,等.，J.Immunol.167(2001)2991-2999;Ohshima,Y"等.，J.Immunol.159(1997)3838-3848;Rogers,P.R.,等.，Immunity15(2001)445-455;Stiiber,E,,禾BStrober,W.,J.Exp.Med.183(1996)979-989;Stiiber，E.,等.，Gastroenterology115(1998)1205-1215;Takahashi,Y.,等.，J.Virol.75(2001)6748-6757;Takasawa,N.，等.，Jpn.J.CancerRes.92(2001)377-382;Taylor,L,禾口Schwarz，H.,J.Immunol.Meth.255(2001)67-72;Weinberg,A.D.,等.，NatureMedicine2(1996)183-189;Weinberg,A.D.,等"Semin.Immunol.10(1998)471-480;Weinberg,A.D.,TrendsImmunol.23(2002)102-109;Wu，T.，等,，Transplant.Proc.33(2001)217-218;Higgins,L.M.,等.，J.Immunol.162(1999)486-493;和Yoshioka，T.,等.，Eur.J.Immunol.30(2000)2815-2823。人OX40L是在活化的CD4+T細胞上瞬時表達的人OX40(CD134)的配體。其配體結(jié)合OX40引起T細胞活化的共刺激性信號。描述了產(chǎn)生雙向信號的OX40/OX40L相互作用(Matsumura,Y.,等.，丄Immunol.163(1999)3007-3011;Kotani，A.,等.，Immunol.Lett.84(2002)1-7)。此外，OX40/OX40L相互作用調(diào)控活化的T細胞與炎癥組織的內(nèi)皮細胞的黏附。由于OX40L只是在活化的B細胞、DC和內(nèi)皮細胞上瞬時表達，所以，針對OX40L的抗體應(yīng)該在炎性應(yīng)答中選擇性地阻斷T細胞活化和內(nèi)皮細胞黏附，而使得未活化的、外周T細胞不受影響。Yoshioka,A.,等.(Eur.J.Immunol.30(2000)2815-2823)證明了中和抗-mOX40LmAb在類風濕性關(guān)節(jié)炎小鼠模型中的治療潛力。它的施用顯著地改善疾病的嚴重性。在其它相關(guān)疾病模型中，例如，炎性皮膚病、試驗性自體免疫疾病(EAE)、GVHD、泌尿炎性腸病(urineinflammatoryboweldisease),這種抗體表現(xiàn)出相似的活性(Yoshioka,A.,等.，Eur.J.Immunol30(1999)2815-2823;Salek-Ardakani,S.,等"J.Exp.Med.198(2003)315-324;Burgess,J.K.，等.，J.AllergyClin.Immunol.113(2004)683-689;Hoshino,A"等.，Eur.J.Immunol.33(2003)861-869;Arestides,R.S.，等.，Eur.JImmunol.32(2002)2874-2880;Nohara,C,等.，J.Immunol.166(2001)2108-2115;Weinberg,A.D.,等.，J.Immunol.162(1999)1818-1826;Higgins，L.M.,等.，J.Immunol.162(1999)486-493;Humphreys,I.R.，等.，J.Exp.Med.198(2003)1237-1242;Akiba,H.,等.，J.Exp.Med.191(2000)375-380;Ishii，N.，等.，Eur.J.Immunol,33(2003)2372-2381;Blazar，B.R.,等.，Blood101(2003)3741-3748;Tsukada,N.,等.，Blood95(2000)2434-2439;Akiba,H.,等.，Biochem.Biophys.Res.Commun.251(1998)131-136)。己經(jīng)研究針對OX40L的抗體在各種疾病模型中的消炎作用(Sugamura,K.,等"Nat.Rev.Immunol.4(2004)420-431)。Tanaka,Y.,等,Int.J.Cancer36,(1985)549-555;Tozawa,H.,等.,Int.J.Cancer41(1988)231-238;禾卩Miura,S.,等.，Mol.Cell.Biol.11(1991)1313-1325描述了命名為TARM-34和TAG-34的小鼠單克隆抗體，其與攜帶人T細胞I型白血病毒(HTLV-I)的人淋巴細胞系的表面抗原反應(yīng)。TAG-34抗體可從MBL國際公司商購。TAG-34也與OX40L結(jié)合。發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種抗體，優(yōu)選地一種單克隆抗體，其特征在于所述抗體結(jié)合OX40L，含有來自人源的Fc片段，并且不結(jié)合在NK細胞上的人補體因子Clq和/或人Fey受體。本發(fā)明還涉及一種抗體，優(yōu)選地一種單克隆抗體，其特征在于所述抗體含有來自人源的Fc片段，在100ng的抗體濃度中與OX40L和變性的OX40L(在蛋白質(zhì)印跡中)結(jié)合。這一抗體結(jié)合到與單克隆抗體LC.001結(jié)合的相同表位的OX40L多肽表位上。這樣的抗體為，例如，LC.OOl、LC.033禾BLC.060。這些抗體優(yōu)選地為人IgGl型(野生型)，或不結(jié)合在NK細胞上的人補體因子Clq和/或人Fey受體。本發(fā)明還涉及一種結(jié)合OX40L的抗體，其特征在于包括可變輕鏈和可變重鏈，特征在于所述可變重鏈包括CDR1、CDR2和CDR3，CDR3特征在于選自SEQIDNOs:33-38。特別優(yōu)選地，CDR1選自SEQIDNOs:21-25,CDR2選自SEQIDNOs:26-32以及CDR3選自SEQIDNOs:33-38。按照本發(fā)明的抗體優(yōu)選地以包括可變輕鏈和可變重鏈為特征，特征在于所述可變輕鏈包括CDRl、CDR2和CDR3，CDR3特征在于選自SEQIDNOs:51-57。特別優(yōu)選地，CDRl選自SEQIDNOs:39-44,CDR2選自SEQIDNOs:45-50以及CDR3選自SEQIDNOs:51-57。按照本發(fā)明的抗體優(yōu)選地以包括可變輕鏈和可變重鏈為特征，特征在于所述可變重鏈包括CDRl、CDR2和CDR3，CDR3特征在于重鏈的CDR3選自SEQIDNOs:33-38，和輕鏈的CDR3選自SEQIDNOs:51-57。特別優(yōu)選地，可變重鏈包括選自SEQIDNOs:21-25的CDRl，選自SEQIDNOs:26-32的CDR2以及選自SEQIDNOs:33-38的CDR3，并且可變輕鏈包括選自SEQIDNOs:39-44的CDRl，選自SEQIDNOs:45-50的CDR2以及選自SEQIDNOs:51-57的CDR3。所有的CDRs都獨立地從彼此選擇，但是自然是以所述抗體結(jié)合OX40L的這樣的方式。因此，相同的LC抗體的輕鏈和重鏈的CDRs可以組合，或者LC.OOl的輕鏈CDRs與LC.OOl、LC.059或LC.063的重鏈CDRs組合。每條鏈上的CDRs由構(gòu)架氨基酸分離。按照本發(fā)明的抗體優(yōu)選地特征在于所述抗體包括獨立地選自由下列各項組成的組的CDRsa)氨基酸序列SEQIDNO:1的輕鏈(V?？勺僀DRs和SEQIDNO:2的重鏈(VH)可變CDRs;b)氨基酸序列SEQIDNO:3的輕鏈可變CDRs和SEQIDNO:4的重鏈可變CDRs;c)氨基酸序列SEQIDNO:5的輕鏈可變CDRs和SEQIDNO:6的重鏈可變CDRs;d)氨基酸序列SEQIDNO:7的輕鏈可變CDRs和SEQIDNO:8的重鏈可變CDRs;e)氨基酸序列SEQIDNO:9的輕鏈可變CDRs和SEQIDNO:IO的重鏈可變CDRs;f)氨基酸序列SEQIDNO:l1或16的輕鏈可變CDRs和SEQIDNO:12的重鏈可變CDRs;g)由氨基酸序列SEQIDNO:l定義的輕鏈(VO可變結(jié)構(gòu)域和由SEQIDNO:17定義的重鏈(VH)可變結(jié)構(gòu)域；h)由氨基酸序列SEQIDNO:18定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和由SEQIDNO:19定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；i)由氨基酸序列SEQIDNO:l定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和由SEQIDNO:20定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；或其OX40L-結(jié)合片段。按照本發(fā)明的抗體優(yōu)選地特征在于所述抗體包括獨立地選自由下列各項組成的組的可變區(qū)a)由氨基酸序列SEQIDNO:l定義的輕鏈(VO可變結(jié)構(gòu)域和由SEQIDNO:2定義的重鏈(VH)可變結(jié)構(gòu)域；b)由氨基酸序列SEQIDNO:3定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和由SEQIDNO:4定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；c)由氨基酸序列SEQIDNO:5定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和由SEQIDNO:6定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；d)由氨基酸序列SEQIDNO:7定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和由SEQIDNO:8定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；e)由氨基酸序列SEQIDNO:9定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和由SEQIDNO:IO定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；f)由氨基酸序列SEQIDNO:ll或16定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和由SEQIDNO:12定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；g)由氨基酸序列SEQIDNO:l定義的輕鏈(VO可變結(jié)構(gòu)域和由SEQIDNO:17定義的重鏈(VH)可變結(jié)構(gòu)域；h)由氨基酸序列SEQIDNO:18定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和由SEQIDNO:19定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；i)由氨基酸序列SEQIDNO:l定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和由SEQIDNO:20定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；或其OX40L-結(jié)合片段。按照本發(fā)明的抗體優(yōu)選地特征在于人輕鏈可變區(qū)包括獨立地選自由SEQIDNO:1,3，5，7,9,11,16和18組成的組的氨基酸序列。按照本發(fā)明的抗體優(yōu)選地特征在于人重鏈可變區(qū)包括獨立地選自由SEQIDNO:2,4,6，8,10,12,17,19和20組成的組的氨基酸序列。重鏈和輕鏈的CDR區(qū)在SEQIDNO:21-38和39-57中顯示。按照本發(fā)明的抗體優(yōu)選地特征在于所述抗體包括由氨基酸序列SEQIDNO:l定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和由SEQIDNO:2，17或20定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域。按照本發(fā)明的抗體優(yōu)選地特征在于人重鏈恒定區(qū)包括獨立地選自由SEQIDNO:14和15組成的組的氨基酸序列或者SEQIDNO:58的重鏈恒定區(qū)。按照本發(fā)明的抗體優(yōu)選地特征在于所述抗體包括SEQIDNO:13的k-輕鏈恒定區(qū)或者SEQIDNO:61，65或69的輕鏈恒定區(qū)。優(yōu)選地，按照本發(fā)明的抗體特征在于結(jié)合OX40L，并且是人IgGl種類(野生型)，并且包括y重鏈SEQIDNO:58,62或66。特別優(yōu)選地是這樣的抗體，其包括a)y重鏈SEQIDNO:58和k輕鏈SEQIDNO:61，b)y重鏈SEQIDNO:62和k輕鏈SEQIDNO:65或c)y重鏈SEQIDNO:66和k輕鏈SEQIDNO:69。本發(fā)明的另一個實施方案是結(jié)合OX40L的抗體，其特征在于它由細胞系hu-Mab<hOX40L>LC.001,hu-Mab<hOX40L>LC.005,hu-Mab<hOX40L>LC.010，hu-Mab<hOX40L>LC.019,hu-Mab<hOX40L〉LC.029或hu-Mab<hOX40L>LC.033產(chǎn)生。按照本發(fā)明的抗體優(yōu)選地是嵌合的、人的或人源化的抗體。按照本發(fā)明的抗體優(yōu)選地特征在于以小于10—8M(10—12-10—8M)的KD值結(jié)合OX40L，更優(yōu)選地特征在于在BIAcore檢測中10—i2-l(T9M的KD范圍。按照本發(fā)明的抗體優(yōu)選地在使用0.5pg/ml包被濃度的固定OX40L(優(yōu)選地為固定在鏈霉抗生物素蛋白表面上的生物素化的OX40L)的ELISA中抑制OX40L與OX40的相互作用，具有不大于4nM的IC50值。更優(yōu)選地，IC50值在1-4nM范圍內(nèi)。按照本發(fā)明的抗體優(yōu)選地特征在于，所述抗體與補體因子Clq的不結(jié)合是指這樣一種ELISA檢測，g卩，與抗體LC.OOl的Bmax相比較，其中濃度為10嗎/ml的抗體與Clq的最大結(jié)合(Bmax)為30%或更低，優(yōu)選地20%或更低。優(yōu)選地，所述抗體不結(jié)合人FcyRI,FcyRIIA禾卩/或FcyRIIIA。特別優(yōu)選地，所述抗體不結(jié)合在NK效應(yīng)細胞上的人FcY受體。按照本發(fā)明的抗體優(yōu)選地特征在于所述抗體與NK細胞上的Fcy受體的不結(jié)合是指這樣的檢測，即，與抗體LC.OOl的Bmax相比較，其中濃度為20pg/ml的抗體與NK細胞的最大結(jié)合(Bmax)為20%或更低，優(yōu)選地10%或更低。按照本發(fā)明的抗體優(yōu)選地特征在于，它不與FcyRI結(jié)合。這意味著，當在檢測濃度為0.078-10ng/ml范圍內(nèi)的抗體與缺少FcyRIIA和FqIIB但是表達重組FcYRI的B-細胞淋巴瘤細胞的結(jié)合的檢測中，所述抗體的特征在于，與LC.OOl的EC50值相比較，所述抗體的EC50值是5倍或更高，優(yōu)選地7倍或更高，諸如8倍或更高。按照本發(fā)明的抗體優(yōu)選地特征在于為一種IgG4抗體或IgGl抗體，其包括至少一個氨基酸突變，優(yōu)選地在人Fc片段，這使得不與補體因子Clq結(jié)合和/或不與NK細胞上的人Fcy受體結(jié)合。按照本發(fā)明的抗體優(yōu)選地特征在于它不活化補體因子C3。按照本發(fā)明的抗體優(yōu)選地特征在于為人亞類IgG4。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，所述抗體特征在于為任何IgG種類，優(yōu)選地為IgGl或lgG4，其包含在E233,L234,L235，G236,D270,N297,E318,K320,K322,A327，A330,P331和/或P329(按照EU索引進行編號)的至少一個突變。特別優(yōu)選的是IgGl突變PVA236,L234A/L235A禾口/或GLPSS331以及IgG4突變L235E。另外，優(yōu)選地，IgG4亞類抗體包含突變S228P或突變S228P和L235E(Angal，S.,等.，Mol.Immunol.30(1993)105-108)。因此，按照本發(fā)明的抗體優(yōu)選地為人亞類IgGl的抗體，其含有一個或多個PVA236,GLPSS331禾口/或L234A/L235A(按照EU索引進行編號)的突變。優(yōu)選地，按照本發(fā)明的抗體特征在于與OX40L結(jié)合，是含有突變L234A/L235A的IgGl種類，并且包括y重鏈SEQIDNO:59,63或67。特別優(yōu)選地，抗體包括a)y重鏈SEQIDNO:59和k輕鏈SEQIDNO:61,b)y重鏈SEQIDNO:63和k輕鏈SEQIDNO:65或c)y重鏈SEQIDNO:67和k輕鏈SEQIDNO:69。優(yōu)選地，按照本發(fā)明的抗體特征在于是含有突變S228P的IgG4種類的抗體，包括y重鏈SEQIDNO:60,64或68。特別優(yōu)選地，抗體包括a)y重鏈SEQIDNO:60和k輕鏈SEQIDNO:61,b)y重鏈SEQIDNO:64和k輕鏈SEQIDNO:65或c)y重鏈SEQIDNO:68和k輕鏈SEQIDNO:69。按照本發(fā)明的抗體優(yōu)選地特征在于，它不引發(fā)依賴于補體的細胞毒性(CDC)。按照本發(fā)明的抗體優(yōu)選地特征在于，它不引發(fā)依賴于抗體的細胞的細胞毒性(ADCC)。因此，本發(fā)明包括抗-OX40L抗體或以它們的CDRs為特征的單一重鏈或輕鏈，可變區(qū)，完整氨基酸序列或雜交瘤，并且其不包括Fc片段或者包括任何類型的Fc片段，優(yōu)選地人IgGlFc或人IgG4Fc，來自于人源12未修飾的或者由上述提及的突變修飾的Fc片段。因此，本發(fā)明還包括抗體，優(yōu)選地單克隆抗體，特征在于所述抗體結(jié)合OX40L，包含人源Fc片段，并且不結(jié)合人補體因子Clq和/或NK細胞上的人FcY受體，特征在于為人IgG4型或者為由上述提及的突變修飾的人IgGl或人IgG4。因此，本發(fā)明還包括抗體，優(yōu)選地單克隆抗體，特征在于所述抗體以100ng的抗體濃度與OX40L和變性的OX40L(在蛋白質(zhì)印跡中)結(jié)合。這一抗體結(jié)合到與單克隆抗體LC.001結(jié)合的表位相同的OX40L多肽表位上。所述抗體不包括Fc片段，或者包括任何類型的Fc片段，優(yōu)選地人IgGl或人IgG4，野生型的或者由上述提及的突變修飾的。按照本發(fā)明的抗體具有新穎性和創(chuàng)造性特點，其給需要用針對OX40L的抗體治療的患者，特別為遭受炎癥疾病折磨的患者，特別是受類風濕性關(guān)節(jié)炎、過敏性哮喘和移植中的GvHD折磨的患者帶來益處(還參見Sugamura，K.,等.，Nat.Rev.Immunol.4(2004)420-431)。本發(fā)明的另一個實施方案是一種核酸分子，其編碼按照本發(fā)明的抗體分子、其可變鏈或CDR結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述抗體是Fab、F(ab')2或單鏈片段。本發(fā)明的另一個實施方案是一種載體，其包括按照本發(fā)明的核酸分子。本發(fā)明的另一個實施方案是一種宿主細胞，其包括按照本發(fā)明的載體。本發(fā)明的另一個實施方案是一種制備按照本發(fā)明的抗體的方法，所述方法包括在允許所述抗體分子合成的條件下，培養(yǎng)按照本發(fā)明的宿主細胞，并且從所述培養(yǎng)物中獲得所述抗體分子。本發(fā)明的另一個實施方案是一種組合物，優(yōu)選地是按照本發(fā)明的抗體的藥物或診斷組合物。本發(fā)明的另一個實施方案是一種藥物組合物，其包括按照本發(fā)明的抗體和至少一種藥用賦形劑。本發(fā)明的另一個實施方案是一種治療需要治療的患者的方法，其特征在于給所述患者施用治療有效量的按照本發(fā)明的抗體。本發(fā)明的另一個實施方案是按照本發(fā)明的抗體用于治療的應(yīng)用，其優(yōu)選地用于治療炎癥疾病，特別用于治療和/或預防類風濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘和GvHD(移植物抗宿主病)。本發(fā)明的另一個實施方案是按照本發(fā)明的抗體用于制備藥物的應(yīng)用，所述藥物用于預防和/或治療炎癥疾病，優(yōu)選地用于治療類風濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘和GvHD。本發(fā)明的另一個實施方案是一種診斷試劑盒，其包括按照本發(fā)明的抗體、按照本發(fā)明的核酸分子、按照本發(fā)明的載體或按照本發(fā)明的宿主細胞。發(fā)明詳述術(shù)語"OX40L"是指屬于TNF-配體家族的II型膜蛋白。其它的命名為ACT-4受體，CD134L,gp34或TNF4—人。它具有34KDa的分子量，并且存儲在SwissProt中，登記號為P23510。術(shù)語"OX40"是指與OX40L結(jié)合的受體。它是屬于TNF受體家族的I型膜蛋白。其它的命名為ACT-4，OX40L受體，CD134抗原,ACT35抗原，TNR4—人。它具有50kDa的分子量，并且存儲在SwissProt中，登記號為P43489。術(shù)語"抗體"包括各種形式的抗體，優(yōu)選地為單克隆抗體，其包括但不限于完整抗體、抗體片段、人抗體、嵌合抗體、人源化抗體和遺傳加工的抗體(變體或突變抗體)，只要保留按照本發(fā)明的特征性特點。特別優(yōu)選的是人或人源化的單克隆抗體，特別是重組人抗體。當用于本文時，術(shù)語"單克隆抗體"或"單克隆抗體組合物"是指單一氨基酸組合物的抗體分子的制劑。術(shù)語"嵌合抗體"是指一種單克隆抗體，其包括來自一種來源或物種的可變區(qū)，S卩，結(jié)合區(qū)，和來源于不同來源或物種的至少一部分恒定區(qū)，這種抗體通常通過重組DNA技術(shù)制備。優(yōu)選包括小鼠可變區(qū)和人恒定區(qū)的嵌合抗體。本發(fā)明所包括的其它優(yōu)選形式的"嵌合抗體"是，其中恒定區(qū)已經(jīng)從初始抗體的恒定區(qū)修飾或改變，以產(chǎn)生按照本發(fā)明的特性，特別是關(guān)于Clq結(jié)合和/或Fc受體(FcR)結(jié)合特性的那些。這樣的嵌合抗體也叫作"種類-轉(zhuǎn)換抗體"。嵌合抗體是免疫球蛋白基因的表達產(chǎn)物，所述免疫球蛋白基因包括編碼免疫球蛋白可變區(qū)的DNA片段和編碼免疫球蛋白恒定區(qū)的DNA片段。產(chǎn)生嵌合抗體的方法包括本領(lǐng)域公知的常規(guī)重組DNA和基因轉(zhuǎn)染技術(shù)。參見，例如，Morrison,S丄.，等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81(1984)6851-6855;USPatentNos.5,202,238禾口5,204,244。術(shù)語"人源化抗體"是指這樣的抗體，與親本免疫球蛋白的CDR相比較，其中構(gòu)架或"互補決定區(qū)"(CDR)己經(jīng)被修飾成包括不同特異性的免疫球蛋白CDR。在一個優(yōu)選實施方案中，將小鼠CDR移植到人抗體的構(gòu)架區(qū)，以制備所述"人源化抗體"。參見，例如，Riechmann,L.,等.,Nature332(1988)323-327;禾BNeuberger,M.S.,等.，Nature314(1985)268-270。特別優(yōu)選的CDRs對應(yīng)代表識別上文提及的抗原序列的那些，所述抗原針對嵌合的和雙功能抗體。本發(fā)明包括的其它形式的"人源化抗體"是其中的恒定區(qū)已經(jīng)從初始抗體的恒定區(qū)另外修飾或改變，以產(chǎn)生按照本發(fā)明的特性，特別是關(guān)于Clq結(jié)合和/或Fc受體(FcR)結(jié)合的特性的那些抗體。術(shù)語"人抗體"，當用于本文時，意欲包括具有源于人種系免疫球蛋白序列的可變和恒定區(qū)的抗體。人抗體在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的(vanDijk,M.A,，和vandeWinkel,J.G.,Curr.Opin.Chem.Biol.5(2001)368-374)。人抗體還可以在轉(zhuǎn)基因動物(例如，小鼠)中產(chǎn)生，在缺乏內(nèi)源性免疫球蛋白產(chǎn)生的情況下，一旦免疫，所述動物能夠產(chǎn)生人抗體的全部所有成分或所選擇的部分。當抗原刺激時，將人種系免疫球蛋白基因陣列轉(zhuǎn)移到這樣的種系突變小鼠中將導致人抗體的產(chǎn)生(參見，例如，Jakobovits，A.,等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(1993)2551-2555;Jakobovits,A.,等.，Nature362(1993)255-258;Bmggemann,M.，等.，YearImmunol.7(1993)33-40)。人抗體還可以在噬菌體展示文庫中產(chǎn)生(Hoogenboom，H.R.，和Winter,G.,J.Mol.Biol.227(1992)381-388;Marks,J.D.,等.，J.Mol.Biol.222(1991)581-597)。Cole等.和Boemer等.的技術(shù)還可以用于制備人單克隆抗體(Cole等.,MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss,p.77(1985);禾口Boemer,P.,等，J.Immunol.147(1991)86-95)。由于已經(jīng)提及按照本發(fā)明的嵌合和人源化抗體，術(shù)語"人抗體"，當用于本文時，還包括這樣的抗體，其在恒定區(qū)被修飾以產(chǎn)生按照本發(fā)明的特性，特別是關(guān)于Clq結(jié)合和/或FcR結(jié)合的特性，例如，通過"種類轉(zhuǎn)換"，即，F(xiàn)c片段的改變或突變(例如，從IgGl到IgG4禾口/或IgGl/IgG4突變)。另外，本發(fā)明包括針對OX40L的單克隆人抗體，其結(jié)合Clq和/或FcR。這樣的人抗體特征在于相對小鼠OX40L而言對于人OX40L的高選擇性(與小鼠OX40L結(jié)合比與人OX40L結(jié)合低>30倍)，并且在達到500nM濃度時，沒有表現(xiàn)出對TNFoc或CD40L的非特異性結(jié)合。這樣的抗體有效用于產(chǎn)生不與Clq和域FcR結(jié)合的抗體。術(shù)語"重組人抗體"，當用于本文時，意欲包括通過重組方法制備、表達、產(chǎn)生或分離的所有人抗體，諸如從宿主細胞如NS0或CHO細胞或從用人免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)基因的動物(例如小鼠)分離的抗體，或者應(yīng)用轉(zhuǎn)染到宿主細胞中的重組表達載體表達的抗體。這樣的重組抗體具有重排形式的可變和恒定區(qū)。將按照本發(fā)明的重組人抗體進行體內(nèi)體細胞高變。因此，盡管來源于并且與人種系VH和VL序列相關(guān)，所述重組抗體VH和VL區(qū)的氨基酸序列是不可能在體內(nèi)人抗體種系所有成分中天然存在的序列。當用于本文時，"可變區(qū)"(輕鏈(VL)的可變區(qū)，重鏈(VH)的可變區(qū))表示直接參與抗體與抗原結(jié)合的每對輕鏈和重鏈?？勺?nèi)溯p鏈和重鏈的結(jié)構(gòu)域具有相同的常規(guī)結(jié)構(gòu)，并且每個結(jié)構(gòu)域包括4個構(gòu)架(FR)區(qū)，其序列普遍是保守的，由3個"高變區(qū)"(或互補決定區(qū)，CDRs)連接。構(gòu)架區(qū)采用P-片層構(gòu)象，并且CDRs可以形成連接P-片層結(jié)構(gòu)的環(huán)。每條鏈中的CDRs在它們的三維空間結(jié)構(gòu)中由構(gòu)架區(qū)擁有，并且與其它鏈的CDRs—起形成抗原結(jié)合位點。抗體重鏈和輕鏈CDR3區(qū)在按照本發(fā)明的抗體的結(jié)合特異性/親和力中起著特別重要的作用，并且因此提供了本發(fā)明的另一個目的。當用于本文時，術(shù)語"高變區(qū)"或"抗體的抗原-結(jié)合部分"是指負責抗原-結(jié)合的抗體氨基酸殘基。所述高變區(qū)包括"互補決定區(qū)"或"CDRs"的氨基酸殘基。"構(gòu)架"或"FR"區(qū)是除本文定義的高變區(qū)殘基以外的那些可變結(jié)構(gòu)域區(qū)域。因此，抗體的輕鏈和重鏈從N-到C-端包括結(jié)構(gòu)域FRl,CDR1,FR2，CDR2，F(xiàn)R3,CDR3,和FR4。每條鏈上的CDRs由這樣的構(gòu)架氨基酸分離。特別地，重鏈的CDR3是對抗原結(jié)合貢獻最大的區(qū)域。按照Kabat等.，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版.，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991)的標準定義，確定了CDR和FR區(qū)域。當用于本文時，術(shù)語"核酸或核酸分子"意欲包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈的或雙鏈的，但是優(yōu)選是雙鏈DNA。當它與另一核酸序列處于功能關(guān)聯(lián)中時，核酸是"可操作性連接的"。例如，如果它作為參與多肽分泌的前蛋白而表達，那么，將前序列或分泌性前導序列的DNA可操作地連接到多肽的DNA上；如果它影響了所述序列的轉(zhuǎn)錄，那么將啟動子或增強子可操作地連接到編碼序列上；或者，如果它位于促進翻譯的位置，那么將核糖體結(jié)合位點可操作地連接到編碼序列上。一般地，"可操作連接"意指，要連接的DNA序列是相鄰的，并且，在分泌性前導序列的情形中，是相鄰的并且在閱讀框內(nèi)。然而，增強子不必是相鄰的。連接通過在便利的限制性位點的連接而實現(xiàn)。如果不存在這樣的位點，按照常規(guī)慣例，使用合成的寡聚核苷酸銜接子或接頭。當用于本文時，表達"細胞"、"細胞系"和"細胞培養(yǎng)物"互換地使用，并且所有這樣的名稱都包括后代。因此，詞語"轉(zhuǎn)化子"和"轉(zhuǎn)化的細胞"包括初級受試細胞和源于其的培養(yǎng)物，而不考慮轉(zhuǎn)移的次數(shù)。還應(yīng)該理解，由于有意或無意的突變，所有的后代在DNA內(nèi)容物上可以不是精確地相同的。包括具有與在原始轉(zhuǎn)化細胞中所篩選的相同的功能或生物活性的變體后代。在使用不同的名稱的情況下，從上下文中它將是清楚的。"恒定結(jié)構(gòu)域"不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但是表現(xiàn)出不同的效應(yīng)器功能。取決于它們重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，將抗體或免疫球蛋白分成下列種類lgA，IgD,IgE,IgG和IgM，并且這些中的幾個可以進一步分成亞類(同種型)，例如，IgGl，IgG2，IgG3,和IgG4，IgAl和IgA2。與不同種類的免疫球蛋白對應(yīng)的重鏈恒定區(qū)分別叫作a，s，Y和ILi。按照本發(fā)明的抗體優(yōu)選地為IgG型。按照本發(fā)明的抗體包含F(xiàn)c片段，優(yōu)選地是源于人源的Fc片段，并且優(yōu)選地是人恒定區(qū)的所有其它片段?？贵w的Fc片段直接參與補體激活、Clq結(jié)合、C3活化和Fc受體結(jié)合。盡管抗體對補體系統(tǒng)的影響取決于特定的條件，但是，與Clq的結(jié)合由Fc片段中定義的結(jié)合位點引起。這樣的結(jié)合位點是本領(lǐng)域己知的，并且例如由Lukas,T丄，等.，J.Immunol.127(1981)2555-2560;Bmnhouse,R.,禾口Cebra,J丄,Mol.Immunol.16(1979)907-917;Burton,D.R.,等.，Nature288(1980)338-344;Thommesen,J.E.,等.,Mol.Immunol.37(2000)995-1004;Idusogie,E.E.，等"J.Immunol.164(2000)4178-4184;Hezareh,M.,等.,J.Virol.75(2001)12161-12168;Morgan,A.,等.，Immunology86(1995)319-324;和EP0307434進行了描述。這樣的結(jié)合位點如L234,L235,D270,N297，E318,K320，K322,P331和P329(按照KabatEU索引進行編號，參見下文)。亞類IgGl、IgG2和IgG3的抗體通常表現(xiàn)出補體激活、Clq結(jié)合和C3活化，而IgG4不激活補體系統(tǒng)，不與Clq結(jié)合并且不激活C3。當用于本文時，術(shù)語"來源于人源并且不結(jié)合NK細胞上的人補體因子Clq和/或人Fey受體的Fc片段"表示這樣的Fc片段，艮卩，其為亞類IgG4的人抗體Fc片段，或者亞類IgGl、IgG2或lgG3的人抗體Fc片段，其以這樣的方式進行修飾，即不能檢測到下文定義的Clq結(jié)合、C3活化和/或FcR結(jié)合。"抗體的Fc片段"是技術(shù)人員公知的術(shù)語，并且是基于抗體的木瓜蛋白酶分解而定義。優(yōu)選地，所述Fc片段是人Fc片段，并且特別優(yōu)選地來自人IgG4亞類，優(yōu)選地在鉸鏈區(qū)突變(例如，S228P和/或L235E)，或者是來自人IgGl亞類的突變的Fc片段。最優(yōu)選地是包括這樣的重鏈恒定區(qū)的Fc片段，即，所述重鏈恒定區(qū)選自SEQIDNO:14和15顯示的區(qū)域，或者包含在SEQIDNO:58，59，60，具有突變L234A和L235A的SEQIDNO:14，或者具有突變S228P或突變S228P和L235E的SEQIDNO:15中。本發(fā)明涉及與OX40L結(jié)合而不與補體因子Clq和/或Fc受體結(jié)合的抗體。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，這些抗體不引發(fā)依賴于補體的細胞毒性(CDC)和/或依賴于抗體的細胞的細胞毒性(ADCC)。優(yōu)選地，這一抗體特征在于，它結(jié)合OX40L，包含來源于人源的Fc片段，并且不結(jié)合補體因子Clq。更優(yōu)選地，這一抗體是人的或人源化的單克隆抗體。由所述抗體Fc區(qū)域的Fc片段介導的效應(yīng)器功能是指抗體與抗原結(jié)合后運行的效應(yīng)器功能(這些功能包括Fc受體對補體級聯(lián)和/或細胞活化的激活作用)。補體級聯(lián)的功能可以通過CH50檢測進行評估。將用抗-紅細胞抗體18(EA)致敏的綿羊紅細胞加入到檢測血清中，以激活導致紅血球溶解的經(jīng)典途徑。裂解50%紅細胞所需的血清體積確定CH50單位。AP-CH50測定備選的和末期途徑。除了使用兔紅細胞之外，流程是相似的。當加入檢測血清時，備選途徑被激活。Clq和兩種絲氨酸蛋白酶，Clr和Cls，形成復合物C1，是依賴于補體的細胞毒性(CDC)途徑的第一個成分。為了激活補體級聯(lián)效應(yīng)，Clq結(jié)合附著到抗原性靶點上的至少兩分子的IgGl或一分子的IgM(Ward,E.S.,和Ghetie,V.,Ther.Immunol.2(1995)77-94)。Burton,D.R.,描述了(Mol.Immunol.22(1985)161-206)包括氨基酸殘基318-337的重鏈區(qū)域參與補體固定。Duncan,A.R.,和Winter,G.(Nature332(1988)738-740)，使用定點誘變，報道了Glu318、Lys320和Lys322形成與Clq的結(jié)合位點。Glu318、Lys320和Lys322殘基在與Clq結(jié)合中的作用由含有這些殘基的合成的短肽抑制補體介導的裂解的能力而證實。術(shù)語"依賴于補體的細胞毒性(CDC)"是指，在補體存在下，按照本發(fā)明的抗體對表達OX40L的人內(nèi)皮細胞的裂解。優(yōu)選地，在補體存在下，通過用按照本發(fā)明的抗體處理表達OX40L的人內(nèi)皮細胞，而測定CDC。優(yōu)選地將細胞用f丐熒光素標記。如果在30)Lig/ml的濃度，所述抗體誘導20%或更多的靶點細胞的裂解，那么可以發(fā)現(xiàn)CDC。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，對于按照本發(fā)明的抗體的特性，在ELISA檢測中減少與補體因子Clq的結(jié)合是重要的。在這樣的檢測中，理論上將ELISA平板用不同濃度范圍的抗體包被，向平板中加入純化的人Clq或人血清。通過針對Clq的抗體，接著過氧化物酶-標記的綴合物，檢測Clq的結(jié)合。結(jié)合的檢測(最大結(jié)合Bmax)作為對于過氧化物酶底物ABTS(2,2'-疊氮基-二-[3-乙基苯并噻唑啉—6-磺酸酯(6)]在405nm的光學密度(OD405)進行檢測。因此，本發(fā)明涉及一種抗體，其特征在于，所述抗體與補體因子Clq的不結(jié)合是指這樣的ELISA檢測測定，其中在IOpg/ml的抗體濃度，Clq與按照本發(fā)明的抗體的最大結(jié)合(Bmax)是用抗體LC.OOl觀察到的Bmax的20%或更低，優(yōu)選地，10%或更低。還優(yōu)選的是，按照本發(fā)明的抗體在ELISA檢測中表現(xiàn)出對補體因子C3減少的激活。所述檢測用同Clq檢測相同的方式進行。在這樣的檢測中，理論上，將ELISA平板用不同濃度范圍的抗體包被，向其中加入人血清。通過針對C3的抗體，接著過氧化物酶-標記的綴合物，檢測C3的結(jié)合。結(jié)合的檢測(最大結(jié)合Bmax)作為對于過氧化物酶底物ABTS在405nm的光學密度(OD405)進行檢測。因此，本發(fā)明涉及一種抗體，其特征在于，所述抗體與補體因子C3的不結(jié)合是指這樣的ELISA檢測測定，其中在10pg/ml的抗體濃度，C3與所述抗體的最大結(jié)合(Bmax)是抗體LC.OOl的Bmax的10%，優(yōu)選地，5%或更低。術(shù)語"依賴于抗體的細胞的細胞毒性(ADCC)"是由Fc受體結(jié)合介導的功能，并且是指在效應(yīng)細胞存在下，按照本發(fā)明的抗體對表達OX40L的靶點細胞的裂解。優(yōu)選地，通過在存在效應(yīng)細胞時，諸如新鮮分離的PBMC(外周血單核細胞)或從暗黃覆蓋層(buffycoats)純化的效應(yīng)細胞，如單核細胞或NK(天然殺傷性)細胞，用按照本發(fā)明的抗體處理表達OX40L的類紅細胞(例如，表達重組人OX40L的K562細胞)制劑，而測量ADCC。將耙點細胞用51Cr標記，并且隨后與抗體一起溫育。將標記的細胞與效應(yīng)細胞一起溫育，并且分析上層清液釋放的51Cr。對照包括用效應(yīng)細胞而不用所述抗體溫育靶點內(nèi)皮細胞。通過測定它們與表達FcY受體的細胞諸如重組表達FqRI禾Q/或FqRIIA的細胞或NK細胞(基本上表達FcyRIIIA)的結(jié)合，而研究抗體誘導調(diào)控ADCC的初始步驟的能力。優(yōu)選地測定與NK細胞上FcYR的結(jié)合。Fc受體結(jié)合效應(yīng)器功能受到抗體的Fc區(qū)與Fc受體(FcRs)的相互作用的調(diào)控，F(xiàn)c受體是造血細胞上特有的細胞表面受體。Fc受體屬于免疫球蛋白超家族，并且己經(jīng)表明其介導通過免疫復合體的吞噬細胞溶解作用而將抗體-包被的病原體移除，和通過依賴于抗體的細胞調(diào)控的細胞毒性(ADCC)而將用相應(yīng)抗體包被的紅細胞和各種其它細胞目的物(例如，腫瘤細胞)的裂解。VandeWinkel,J.G.，和Anderson,C丄.，J.Leukoc.Biol.49(1991)511-524)。FcRs由它們對免疫球蛋白同種型的特異性而定義；IgG抗體的Fc受體叫作FcyR，IgE的叫作FcsR，IgA的叫作FcaR，等等。例如，F(xiàn)c受體纟吉合在Ravetch,J.V"禾口Kinet,J.R,Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492;Capel,P.J"等.，Immunomethods4(1994)25-34;deHaas，M.,等,，J.Lab.Clin.Med.126(1995)330-341;和Gessner,J.E.,等.，Ann.Hematol.76(1998)231-248中描述。對于IgG抗體Fc結(jié)構(gòu)域的受體(FcYR)的交聯(lián)引發(fā)了廣泛種類的效應(yīng)器功能，包括吞噬細胞溶解作用、依賴于抗體的細胞的細胞毒性和炎性調(diào)控因子的釋放、以及免疫復合體清除和抗體產(chǎn)生的調(diào)控。在人中，已經(jīng)區(qū)分了3種FcyR，它們是-Fc丫RI(CD64)以高親和力結(jié)合單體IgG，并且在巨噬細胞、單核細胞、嗜中性粒細胞和嗜酸性粒細胞上表達。IgG中E233-G236、P238、D265、N297、A327和P329至少一種的修飾減少與Fc^RI的結(jié)合。在位置233-236的IgG2殘基，代入IgGl和IgG4，將與FcyRI的結(jié)合減小103-倍，并且消除了對抗體-致敏的紅細胞的人單核細胞應(yīng)答(Armour,K丄.，等..Eur.J.Immunol.29(1999)2613—2624)。-FcyRII(CD32)以中等到低親和力結(jié)合復合的IgG，并且廣泛地表達。這些受體可以分成2種主要類型，F(xiàn)cyRIIA和FcyRIIB。FcyRIIA在許多參與殺傷的細胞(例如，巨噬細胞、單核細胞、嗜中性粒細胞)上發(fā)現(xiàn)，并且似乎能夠激活殺傷過程。FcYRIIB似乎在抑制過程中起作用，并且在B細胞、巨噬細胞上以及肥大細胞和嗜酸性粒細胞上發(fā)現(xiàn)。在B細胞上，看起來它行使抑制其它免疫球蛋白產(chǎn)生和同種型轉(zhuǎn)換如向IgE種類轉(zhuǎn)換的功能。在巨噬細胞上，F(xiàn)qRIIB作用抑制通過FcyRIIA調(diào)控的吞噬細胞溶解作用。在嗜酸性粒細胞和肥大細胞上，b形式可以通過IgE與其獨立的受體結(jié)合而幫助抑制這些細胞的活化。例如，對于E233-G236，P238,D265，N297,A327,P329,D270,Q295，A327,R292和K414至少一種的IgG突變，發(fā)現(xiàn)減小了與FcyRIIA的結(jié)合。-FcyRIII(CD16)以中等到低親和力結(jié)合IgG，并且以兩種類型存在。FcyRIIIA在NK細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞和一些單核細胞和T細胞上發(fā)現(xiàn)，并且調(diào)控ADCC。FcYRIIIB在嗜中性粒細胞上高度表達。例如，對于E233-G236,P238，D265,N297，A327，P329,D270,Q295,A327,S239,E269，E293,Y296，V303,A327,K338和D376至少一種的突變，發(fā)現(xiàn)減小了與FcYRIIIA的結(jié)合。對于Fc受體在人IgGl上結(jié)合位點、上文提及的突變位點的定位和測定與FcYRI和FcYRIIA的結(jié)合的方法在Shields,R丄.,等.JBC276(2001)6591-6604中描述。當用于本文時，術(shù)語"Fc受體"是指活化受體，其特征在于存在與所述受體相締合的胞質(zhì)(cytoplasmatic)ITAM序列(參見，例如，Ravetch,J.V.,和Bolland，S.,Annu.Rev.Immunol.19(2001)275-290)。這樣的受體是FcYRI、FcyRIIA和FcyRIIIA。按照本發(fā)明的受體優(yōu)選地表現(xiàn)出與Fq受體，優(yōu)選地與FcyIIIA減小的結(jié)合。優(yōu)選地，術(shù)語"不與FcyR結(jié)合"意指，在10pg/ml的抗體濃度，按照本發(fā)明的抗體與NK細胞的結(jié)合是對于抗體LC.001所發(fā)現(xiàn)的結(jié)合的10%或更少。盡管IgG4表現(xiàn)出減少的FcR結(jié)合，但是其它IgG亞類的抗體表現(xiàn)出強結(jié)合。然而，如果改變，Pro238,Asp265，Asp270，Asn297(失去Fc碳水化合物)，Pro329禾卩234，235,236和237,Ile253,Ser254，Lys288,Thr307，Gln311,Asn434和His435是也提供減小的FcR結(jié)合的殘基(Shields，R丄.，等.J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604;Lund，J.,等.FASEBJ.9(1995)115-119;Morgan,A.,等.，Immunology86(1995)319-324;和EP0307434)。優(yōu)選地，按照本發(fā)明的IgGl或IgG2亞類的抗體包括突變PVA236、GLPSS331和/或L234A/L235A。按照本發(fā)明的IgG4亞類的抗體優(yōu)選地包括突變L235E。其它優(yōu)選的IgG4突變是S228P或L235E和S228P(參見表1)。當用于本文時，術(shù)語"與OX40L結(jié)合"意指在BIAcore檢測(PharmaciaBiosensorAB，Uppsala，Sweden)中抗體與人OX40L的結(jié)合。為了進一步證實，與OX40L的結(jié)合還在用純化的OX40L包被微量滴定平板的ELISA中確定，或者在FACS-檢測中確定，其中直接或間接標記的抗體結(jié)合到表達OX40L的K562細胞上。在BIAcore檢測中，抗體結(jié)合到表面，并且OX40L的結(jié)合通過表面胞質(zhì)基因共振(SurfacePlasmonResonance,SPR)進行測定。結(jié)合的親和力通過術(shù)語ka(抗體與抗原締合的速率常數(shù))、kd(解離的速率常數(shù))和KD(kd/ka)進行定義。按照本發(fā)明的抗體表現(xiàn)出10—8或更小，優(yōu)選約10—12-10—9M的Ko(參見實例)。因此，本發(fā)明涉及上文所述的抗體，其中所述抗體在BIAcore檢測中以小于l(T8M的KD值與OX40L結(jié)合，優(yōu)選22地其中Kd的范園是10—12-1(T9M。在OX40L-特異性結(jié)合ELISA中，將OX40L包被到微量滴定平板上，并且用HRP-綴合的抗人IgG和常規(guī)ELISA步驟檢測抗體與OX40L的結(jié)合。在這一檢測中的EC5o值優(yōu)選地在3nM-8nM范圍內(nèi)。當用于本文時，術(shù)語"抑制OX40與OX40L結(jié)合"是指本發(fā)明所述的抗體與人OX40L的結(jié)合，由此抑制OX40/OX40L相互作用，并且由此抑制OX40L誘導的信號傳導。本發(fā)明的抗體抑制hOX40L/OX40的相互作用，優(yōu)選地i)在由ELISA檢測所示的體外水平上，通過在(固相)0.5pg/ml生物素化OX40L的包被濃度的抗體而阻滯生物素化的、固定的OX40L與可溶OX40的相互作用，具有l(wèi)nM-4nM范圍的IC50值，'ii)在由Biacore檢測所示的體外水平上，通過0.78-100nM抗體濃度的抗體而阻滯固定的OX40與可溶的OX40L(10nM，優(yōu)選地為hOX40L-His)的相互作用，具有1nM-10nM范圍的IC50值，iii)在由FACS-檢測所示的細胞水平上，其中所述抗體抑制表達OX40L的K562細胞(K562J3X40L)(濃度為2xl()5個細胞/樣品)與OX40的相互作用，具有4nM-20nM范圍的IC50值，iv)通過OX40-信號傳導檢測，其中所述抗體阻滯由K562—OX40L誘導的OX40信號傳導到每份樣品3xl(/個表達OX40的HeLa-細胞中，這導致NFKB活化的阻滯，具有l(wèi)nM-5nM范圍的IC50值，v)通過T細胞活化檢測，其中通過在濃度為1.5xl05個細胞/樣品的K562—OX40L和濃度為0.75jiig/ml的PHA，所述抗體阻滯OX40L誘導的T細胞激活，具有l(wèi)nM-10nM范圍的IC50值，禾口/或vi)通過T細胞活化檢測，其中通過在濃度為10pg/ml的抗體的活化的B細胞或樹突細胞(Tetanus檢測)，所述抗體阻滯OX40L誘導的T細胞激活，得到40%-60%的抑制。優(yōu)選這樣的抗體，即，其在ELISA檢測中表現(xiàn)出抑制，通過在0.5pg/mlOX40L的包被濃度阻滯固定的OX40L與可溶的OX40的相互作用而進行抑制，具有l(wèi)nM-4nM范圍的IC50值。因此，本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案涉及一種抗體，其特征在于所述抗體由此抑制OX40/OX40L相互作用，并且由此抑制OX40L誘導的信號傳導。更優(yōu)選地，按照本發(fā)明的抗體在濃度達到500nM的TNFa或CD40L，不表現(xiàn)出與TNFa和CD40L的非特異性結(jié)合。更優(yōu)選地，與人OX40L相比，按照本發(fā)明的抗體表現(xiàn)出至少低于30倍的與小鼠OX40L的結(jié)合。更優(yōu)選地，濃度為10pg/ml的按照本發(fā)明的抗體不誘導對OX40L在HUVEC細胞上表達的下調(diào)。在一個更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的抗體特征在于，它們包括可變結(jié)構(gòu)域的組合，所述組合獨立地選自由下列組合組成的組a)由氨基酸序列SEQIDNO:l定義的抗體LC.001的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和由SEQIDNO:2定義的抗體LC.001的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；b)由氨基酸序列SEQIDNO:3定義的抗體LC.005的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和由SEQIDNO:4定義的抗體LC.005的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；c)由氨基酸序列SEQIDNO:5定義的抗體LC.OIO的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和由SEQIDNO:6定義的抗體LC.010的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；d)由氨基酸序列SEQIDNO:7定義的抗體LC.029的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和由SEQIDNO:8定義的抗體LC.029的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；e)由氨基酸序列SEQIDNO:9定義的抗體LC.019的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和由SEQIDNO:10定義的抗體LC.019的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；f)由氨基酸序列SEQIDNO:ll或16定義的抗體LC.033的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和由SEQIDNO:12定義的抗體LC.033的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；g)由氨基酸序列SEQIDNO:l定義的輕鏈(VO可變結(jié)構(gòu)域和由SEQIDNO:17定義的重鏈(VH)可變結(jié)構(gòu)域；h)由氨基酸序列SEQIDNO:18定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和由SEQIDNO:19定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；i)由氨基酸序列SEQIDNO:l定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和由SEQIDNO:20定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域。在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的抗體特征在于，它們包括獨立地選自由下列各項組成的組的恒定區(qū)k)由序列SEQIDNO:13定義的輕鏈/ic鏈；1)具有一個或多個選自L234A和L235A、PVA236或GLPSS331的突變的IgGl同種型SEQIDNO:14的重鏈/y鏈；m)IgG4同種型SEQIDNO:15的重鏈鏈；n)具有突變S228P或突變S228P禾卩L235E的IgG4同種型SEQIDNO:15重鏈々鏈；o)包含在SEQIDNO:61,65或69中的輕鏈恒定鏈；p)包含在SEQIDNO:58,59,60,62，63,64,66,67或68中的重鏈恒定鏈。更優(yōu)選地是每種可變抗體結(jié)構(gòu)域組合a)-i)與y鏈1)、m)、n)或p)，并且優(yōu)選地與k鏈k)或o)的所有組合。特別優(yōu)選地是下列抗體這樣的抗體，其包括抗體LC扁,LC.005,LC.010,LC.019,LC.029，LC.033,LC.059,LC.060或LC.063的可變鏈(其中每種抗體具有序列SEQIDNO:13定義的k鏈)，或包含在SEQIDNO:61,65或69中的輕鏈恒定鏈和具有突變L234A和L235A的IgGl同種型SEQIDNO:14的重鏈/y鏈，或包含在SEQIDNO:59,63或67中的重鏈恒定鏈；這樣的抗體，其包括抗體LC細,LC.005,LC.010,LC.019,LC.029,LC.033,LC.059,LC.060或LC.063的可變鏈(其中每種抗體具有序列SEQIDNO:13定義的k鏈)，或包含在SEQIDNO:59，63或67中的重鏈恒定鏈和IgG4同種型SEQIDNO:15的重鏈"鏈，或包含在SEQIDNO:60，64或68中的重鏈恒定鏈，所有這3種都沒有S228P突變；這樣的抗體，其包括抗體LC.001,LC.005,LC.OIO，LC.019,LC.029,LC.033,LC.059,LC.060或LC.063的可變鏈(其中每種抗體具有序列SEQIDNO:13定義的k鏈)，或包含在SEQIDNO:61，65或69中的輕鏈恒定鏈和具有突變S228P的IgG4同種型SEQIDNO:15的重鏈鏈，或包含在SEQIDNO:60，64或68中的重鏈恒定鏈。優(yōu)選地，所述抗體包括氨基酸序列SEQIDN0:1的輕鏈可變CDR，和SEQIDN0:2，17或20的重鏈可變CDR，或氨基酸序列SEQIDNO:18的輕鏈可變CDR，禾卩SEQIDNO:19的重鏈可變CDR。優(yōu)選的抗體特征在于，所述抗體是人IgG4亞類或是其它的人亞類(優(yōu)選IgGl)，其包括至少一個引起不結(jié)合補體因子Clq和/或失去FCR結(jié)合的氨基酸突變。例如，這樣優(yōu)選的變體抗體包括具有突變L234A和L235A的氨基酸序列SEQIDNO:14，或者具有或沒有突變S228P的SEQIDNO:15。按照本發(fā)明的優(yōu)選抗體是定義為IgGlvl(PVA-236;表示為E233P的GLPSS331;L234V;L235A;AG236;A327G;A330S;P331S),IgGlv2(L234A;L235A)和IgG4vl(S228P;L235E)和IgG4x(S228P)的抗體。根據(jù)用于專利程序目的的微生物保藏國際承認的布達佩斯公約，按照本發(fā)明的雜交瘤細胞系hu-Mab<hOX40L>LC.001于2004年7月27日保藏在德國的德意志微生物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)(DSMZ)，保藏號DSMACC2672。根據(jù)用于專利程序目的的微生物保藏國際承認的布達佩斯公約，按照本發(fā)明的雜交瘤細胞系hu-Mab<hOX40L>LC.005(DSMACC2685)，hu-Mab<hOX40L>LC.010(DSMACC2686)，hu-Mab<hOX40L>LC.019，hu-Mab<hOX40L>LC.029(DSMACC2688)禾Bhu-Mab<hOX40L>LC.033(DSMACC2689)于2004年9月2日保藏在德國的德意志微生物保藏中心(DSMZ)。可從所述細胞系得到的抗體是本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，并且特別有效用作中間物質(zhì)，用于產(chǎn)生不結(jié)合補體因子Clq和/或不結(jié)合人Fey受體的按照本發(fā)明的抗體。本發(fā)明的其它優(yōu)選實施方案是分離的抗-OX40L抗體，其結(jié)合OX40L，并且與由所保藏的雜交瘤細胞系產(chǎn)生的單克隆抗體LC.005,LC.010或LC.029也與之結(jié)合的相同的OX40L-表位結(jié)合。本發(fā)明的另一個實施方案是用于產(chǎn)生針對OX40L的抗體的方法，所述針對OX40L的抗體不結(jié)合人補體因子Clq和/或人Fey受體，其特征在26于，編碼以小于10—SM的KD值結(jié)合OX40L的抗體的重鏈的核酸序列以這樣的方式進行修飾，以致所述修飾的抗體不結(jié)合NK細胞上的補體因子Clq和/或人Fey受體，將所述修飾的核酸和編碼所述抗體輕鏈的核酸插入到表達載體中，將所述載體插入到原核或真核宿主細胞中，所編碼的蛋白得以表達并且從宿主細胞或上層清液回收。本發(fā)明的另一個實施方案是用于產(chǎn)生按照本發(fā)明的不結(jié)合補體因子Clq和/或不結(jié)合人Fcy受體的抗體的方法，特征在于，可從所述細胞系之一得到的抗體通過"種類轉(zhuǎn)換"而進行修飾，即，改變或者突變優(yōu)選地定義為IgGlvl(PVA-236;表示為E233P的GLPSS331;L234V;L235A;厶G236;A327G;A330S;P331S),IgGlv2(L234A;L235A)和IgG4vl(S228P;L235E)和IgG4x(S228P)的Fc片段(例如，從IgGl到IgG4禾口/或lgGl/IgG4突變)。在另一個優(yōu)選實施方案中，這些抗體還包括選自由Fab、F(ab')2和單鏈片段組成的組的抗體片段。因此，"變體"抗-OX40L抗體在本文是指這樣一種分子，其通過在親本抗體序列中加入、刪除和/或取代一個或多個氨基酸殘基而在氨基酸序列中與"親本"抗-OX40L抗體氨基酸序列不同。在優(yōu)選實施方案中，所述變體包括在親本抗體一個或多個恒定區(qū)或可變區(qū)，優(yōu)選在恒定區(qū)的一個或多個氨基酸取代。例如，所述變體可以包括在親本抗體的一個或多個可變區(qū)的至少一個，例如，從約1個到約10個，并且優(yōu)選地從約2個到約5個取代。通常，所述變體具有這樣的氨基酸序列，S卩，其與親本抗體恒定和/或可變結(jié)構(gòu)域序列有至少90%的氨基酸序列相同性，更優(yōu)選的至少95%，和更優(yōu)選地至少99%的相同性。本發(fā)明包括修飾選自由SEQIDNOs:21-38組成的組的親本抗體重鏈CDR和/或選自由SEQIDNOs:39-57組成的組的抗體輕鏈CDR的初始氨基酸序列的方法，其特征在于，提供編碼所述初始氨基酸序列的核酸，修飾所述核酸，在這點上，重鏈CDR1中1個氨基酸被修飾，重鏈CDR2中l(wèi)-2個氨基酸被修飾，重鏈CDR3中l(wèi)-2個氨基酸被修飾，輕鏈CDR1中1-3個氨基酸被修飾，輕鏈CDR2中1-3個氨基酸被修飾，和/或輕鏈CDR3中1-3個氨基酸被修飾，在抗體結(jié)構(gòu)中表達所述修飾的CDR氨基27酸序列，測定所述抗體是否以小于10—Sm的Kd結(jié)合OX40L，并且如果所述抗體以小于10—8m的Kd結(jié)合OX40L，選擇所述修飾的cdr。優(yōu)選地，這樣的修飾是保守序列修飾。關(guān)于序列的相同性或同源性在本文定義為在候選序列中與親本抗體殘基相同的氨基酸殘基的百分比，如果必要，在對所述序列進行比對并且引入缺口后，獲得最大的序列相同性百分數(shù)?？贵w序列內(nèi)的N-端、C-端、或內(nèi)部的延長、刪除或插入都不應(yīng)該解釋為影響序列相同性或同源性。變體保持結(jié)合人OX40L的能力，并且優(yōu)選地具有優(yōu)于親本抗體的那些特性的特性。例如，由于OX40L不僅在B細胞、樹突細胞和巨噬細胞上瞬時表達，還在內(nèi)皮細胞(Kotani,A.,等.，Immunol.Lett.84(2002)1-7)、呼吸道平滑肌細胞(=ASM)(Burgess,J.K.,J.AUergyCin.Immmio〗13(2004)683-689)和小膠質(zhì)細胞(Weinberg,A.D.，等.，J.Immunol.162(1999)1818-1826)上瞬時表達，所以，所述變體可以在治療類風濕性關(guān)節(jié)炎和哮喘過程中具有減小的副作用。針對,OX40L的抗體與內(nèi)皮細胞、ASM和小膠質(zhì)細胞的結(jié)合可以導致細胞損傷，并且與內(nèi)皮細胞的結(jié)合導致血管滲漏，與ASM細胞結(jié)合導致肺部毀壞，與小膠質(zhì)細胞的結(jié)合導致小膠質(zhì)的損傷。在本文中，"親本"抗體是由用于制備變體的氨基酸序列編碼的一種抗體。優(yōu)選地，所述親本抗體具有人構(gòu)架區(qū)域，并且如果存在，具有人抗體恒定區(qū)。例如，所述親本抗體可以是人源化的或人抗f本，優(yōu)選為IgGl型。另外，按照本發(fā)明的抗體包括具有"保守序列修飾"、核苷酸和氨基酸序列修飾的這樣的抗體，所述修飾不影響或者改變按照本發(fā)明的抗體的上述提及的特征。修飾可以通過本領(lǐng)域已知的標準技術(shù)引入，諸如定點誘變和PCR-介導的誘變技術(shù)。保守氨基酸取代包括其中氨基酸殘基用具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基取代的那些取代。本領(lǐng)域已經(jīng)定義了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)的、酸性側(cè)鏈(例如，天冬氨酸、谷氨酸)的、不帶電的極性側(cè)鏈(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷胺酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)的、非極性側(cè)鏈(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)的、(3-支化側(cè)鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)的和芳香側(cè)鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。因此，人抗-OX40L抗體的預計的非必需氨基酸殘基可以優(yōu)選地用來自相同側(cè)鏈家族的另一種氨基酸殘基取代。氨基酸取代可以通過基于Riechmann,L.,等.，Nature332(1988)323-327和Queen,C.,等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86(1989)10029-10033描述的制作分子模型的誘變進行。本發(fā)明還包括用于產(chǎn)生抗體的方法，其特征在于，對編碼以小于l(T8M的KD值結(jié)合OX40L的抗體的重鏈的第一核酸序列以這樣的方式進行修飾，以致所修飾的抗體不與NK細胞上的補體因子Clq和/或人Fey受體結(jié)合，將所述修飾的第一核酸和編碼所述抗體輕鏈的第二核酸插入到表達載體中，將所述載體插入到原核或真核宿主細胞中，在允許所述抗體合成的條件下培養(yǎng)所述宿主細胞并且從所述培養(yǎng)物中回收所述抗體。本發(fā)明還包括用于產(chǎn)生按照本發(fā)明并且包括來源于人源的Fc片段的抗體的方法，所述方法包括下列步驟a)用編碼按照本發(fā)明的親本人抗體輕鏈的第一核酸序列和編碼所述親本人抗體重鏈的第二DNA序列轉(zhuǎn)化宿主細胞，其中Fc片段被修飾，使得所述Fc片段不結(jié)合補體因子Clq和/或Fc受體；b)表達所述第一和第二DNA序列，以致產(chǎn)生所述抗體重鏈和輕鏈；和c)從宿主細胞或宿主細胞培養(yǎng)物中回收所述抗體。本發(fā)明還包括編碼上文提及的抗體的核酸分子、包括這些核酸的相應(yīng)的載體和用于這些載體的相應(yīng)的宿主細胞。本發(fā)明包括用于制備所述抗體的方法，其包括在允許合成所述抗體的條件下培養(yǎng)相應(yīng)的宿主細胞，并且從所述培養(yǎng)物回收所述抗體，例如，通過在原核或真核宿主細胞中表達編碼重鏈的核酸和編碼輕鏈的核酸，并且從所述細胞回收所述多肽來實現(xiàn)。考慮了所述抗體的診斷和治療應(yīng)用。在一種診斷應(yīng)用中，本發(fā)明提供確定OX40L蛋白存在的方法，其包括將懷疑含有OX40L的樣品暴露于抗-OX40L抗體，并且確定抗體與樣品的結(jié)合。OX40L蛋白可以通過其跨膜結(jié)構(gòu)域插入到表達OX40L的細胞的細胞膜內(nèi)，或者可以作為通過如脫落(shedding)或蛋白水解釋放的機制釋放到體液中的可溶性胞外結(jié)構(gòu)域而存在。對于這種應(yīng)用，本發(fā)明提供一種試劑盒，其包括所述抗體和應(yīng)用所述抗體檢測OX40L蛋白的用法說明。本發(fā)明的抗體有效用于預防和/或治療哺乳動物中的、優(yōu)選地懷疑患有或者遭受這樣的疾病折磨的患者中的炎癥疾病。這樣的疾病包括過敏性反應(yīng)，諸如哮喘。其它應(yīng)用是自體免疫疾病包括類風濕性關(guān)節(jié)炎的治療。本發(fā)明還提供用于治療遭受上文提及的炎癥疾病，特別是哮喘和類風濕性關(guān)節(jié)炎的折磨的哺乳動物的方法。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體可以用于治療患者中的嚴重頑固性哮喘，所述患者的癥狀沒有充分受到吸入的糖皮質(zhì)激素的控制。患者群體包括患有不充分控制的嚴重頑固性哮喘的成人和青少年(12歲或年齡更大的)?？贵w將優(yōu)選地通過皮下遞送每月一次或兩次。主要的終點(endpoint)將優(yōu)選地在急性惡化中下降。其它終點包括峰值流量、日間哮喘癥狀、夜間醒來、生活質(zhì)量、急診室隨訪、沒有哮喘的天數(shù)、(3-2激動劑應(yīng)用、類固醇減少或逐漸減弱以及對高-響應(yīng)性的作用。還優(yōu)選將按照本發(fā)明的抗體用于單一治療或者與甲氨喋呤或其它DMARDs(疾病修飾的抗-類風濕性藥物，DiseaseModifyingAnti-RheumaticDrugs)組合來治療患有中等到嚴重急性(active)類風濕性關(guān)節(jié)炎的成年人。它將作為每2或4周的皮下注射進行施用。它將在對一種或多種DMARDs無效的患者中進行慢性治療。終點包括患有急性類風濕性關(guān)節(jié)炎的成年患者中的跡象和癥狀的減少以及結(jié)構(gòu)損傷進展的抑制。無能力的預防、跡象和癥狀的改善通過ACR標準(ACR20>60%，ACR50>35%，ACR70>15%;指數(shù)來源于AmericanCollegeofRheumatology;www.rheumatology.com)進行領(lǐng)ij定。本發(fā)明的另一個實施方案是按照本發(fā)明的抗體用于制備治療這些疾病的藥物的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及上文定義的抗體用于制備藥物組合物的應(yīng)用，并且包括藥物組合物，其包含按照本發(fā)明的抗體，與藥物有效量、任選地與用于配制藥物目的的抗體的緩沖劑和/或佐劑。本發(fā)明還提供藥物組合物，其包含在藥用載體中的這樣的抗體。在一個實施方案中，所述藥物組合物可以包含在一套產(chǎn)品或試劑盒中。30按照本發(fā)明的抗體優(yōu)選地通過重組方法產(chǎn)生。這樣的方法是本領(lǐng)域內(nèi)公知的，并且包括在原核和真核細胞中的蛋白表達，隨后分離抗體多肽，并且通常純化到藥學可用的純度。對于蛋白表達，將編碼輕鏈和重鏈或其片段的核酸通過標準方法插入到表達載體中。表達在適宜的原核或真核宿主細胞如CHO細胞、NSO細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、COS細胞、酵母、或大腸桿菌(E.coli)細胞中進行，并且將所述抗體從所述細胞回收(裂解后的上層清液或細胞)?？贵w的重組生產(chǎn)是本領(lǐng)域公知的，并且例如，在Makrides,S.C.，ProteinExpr.Purif.17(1999)183-202;Geisse,S.,等.，ProteinExpr.Purif.8(1996)271-282;Kaufman,R丄，Mol.Biotechnol.16(2000)151-161;Werner,R.G"等.，Arzneimittelforschung48(1998)870-880的綜述論文中描述。所述抗體可以存在于完整的細胞中、細胞裂解物中、或者以部分純化或基本上純化的形式存在。為了除去其它細胞成分或其它污染物，例如，其它細胞核酸或蛋白，通過標準技術(shù)，包括堿/SDS處理、柱層析和其它本領(lǐng)域公知的技術(shù)進行純化。參見，Ausubel,F.,等.，ed.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingandWileyInterscience,NewYork(1987)。例如，在NS0細胞中的表達由Barnes,L,M.,等.，Cytotechnology32(2000)109-123;和Bames,L.M.,等.，Biotech.Bioeng.73(2001)261-270描述。例如，瞬時表達由D畫her,Y.，等.，Nucl.Acids.Res,30(2002)E9描述?？勺兘Y(jié)構(gòu)域的克隆由Orlandi,R.,等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86(1989)3833-3837;Carter,P.,等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89(1992)4285-4289;和Norderhaug,L.,等.，J.Immunol,Methods204(1997)77-87描述。優(yōu)選的瞬時表達系統(tǒng)(HEK293)由Schlaeger,E.-J.,和Christensen,K.，在Cytotechnology30(1999)71-83中和由Schlaeger，E.-J.，在J.Immunol.Methods194(1996)191-199中描述。例如，適用于原核生物的控制序列包括啟動子、任選地操縱子序列和核糖體結(jié)合位點。己知真核細胞應(yīng)用啟動子、增強子和多聚腺苷酸化信號。當它處于與其它核酸序列的功能性關(guān)系中時，核酸是"可操作地連接的"。例如，如果它作為參與多肽分泌的前蛋白而表達，那么，將前序列或分泌性前導序列的DNA可操作地連接到多肽DNA上；如果它影響所述序列的轉(zhuǎn)錄，那么將啟動子或增強子可操作地連接到編碼序列上；或者如果它位于促進翻譯的位置時，將核糖體結(jié)合位點可操作地連接到編碼序列上。一般地，"可操作地連接"意指要連接的DNA序列是相鄰的，并且，在分泌性前導序列的情形中，是相鄰的并且在閱讀框內(nèi)。然而，增強子不必是相鄰的。連接通過在便利的限制性位點的連接而實現(xiàn)。如果不存在這樣的位點，那么，按照常規(guī)應(yīng)用，使用合成的寡聚核苷酸銜接子或接頭。通過常規(guī)免疫球蛋白純化方法，諸如，例如，蛋白質(zhì)A-瓊脂糖、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析，將單克隆抗體適當?shù)貜呐囵B(yǎng)基中分離。應(yīng)用常規(guī)方法，易于對編碼單克隆抗體的DNA和RNA進行分離和測序。雜交瘤細胞可以作為這樣的DNA和RNA的來源。一旦分離，可以將DNA插入到表達載體中，然后將其轉(zhuǎn)染不另外產(chǎn)生免疫球蛋白的宿主細胞，諸如HEK293細胞、CHO細胞或骨髓瘤細胞，以在宿主細胞中獲得重組單克隆抗體的合成。人OX40L抗體的氨基酸序列變體(或突變體)通過將適宜的核苷酸改變引入抗體DNA中或通過核苷酸合成而制備。然而，這樣的修飾可以只在非常有限的范圍內(nèi)如上文所述的那樣進行。例如，所述修飾不改變上述提及的抗體特性，諸如IgG同種型和表位結(jié)合特性，但是可以提高重組生產(chǎn)的產(chǎn)量、蛋白穩(wěn)定性或者促進純化。還可以將任何不參與保持抗-OX40L抗體的正確構(gòu)象的半胱氨酸殘基取代，通常用絲氨酸取代，以提高所述分子的氧化穩(wěn)定性，并且防止異常交聯(lián)。相反，可以向所述抗體中加入半胱氨酸鍵，以提高其穩(wěn)定性(特別地當所述抗體是抗體片段諸如Fv片段時)?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的各種方法制備編碼抗-OX40L抗體的氨基酸變體的核酸分子。這些方法包括，但不限于，從天然來源分離(在天然存在的氨基酸序列變體的情形中)或通過人源化-OX40L抗體更早制備的變體或非變體譯本的寡聚核苷酸-介導的(或定點的)誘變、PCR誘變、和盒式誘變而制備。本發(fā)明還關(guān)于免疫綴合物，其包括綴合到細胞毒性劑，諸如化療劑、毒素(例如，細菌、真菌、植物或動物來源的酶促活性毒素、或其片段)、放射活性同位素(即，放射性綴合物)上的按照本發(fā)明的抗體?？贵w和細胞毒性劑的綴合物應(yīng)用各種雙功能蛋白偶聯(lián)劑諸如>^-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(SPDP)、iminothiolane(IT)、亞氨酸酯的雙官能衍生物；(諸如dimethyladipimidateHCL)、活性酯(諸如二琥珀酰亞胺基辛二酸酯)、醛(諸如戊二醛)、雙-疊氮基化合物(諸如雙(對-疊氮基苯甲基)己二胺)、雙-二氮鎗衍生物(諸如雙-(對-二氮鐵苯甲基)-ethylenediatnine)、二異氰酸酯(諸如tolyene2,6-二異氰酸酯)和雙-活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)而制備。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可以按照在Vitetta,E.S.,等.，Science238(1987)1098-1104)中所述的那樣進行制備。碳-14-標記的l-異氰硫基苯甲基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是一種用于將放射性核苷酸偶聯(lián)到抗體上的示例性螯合劑。參見WO94/11026。所述抗體的另一種類型的共價修飾包括以在美國專利號4,640,835;4,496,689;4,301,144;4,670,417;4,791,192或4,179,337中提出的方式將抗體連接到各種非蛋白質(zhì)聚合物中的一種上，例如，聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯。在另一方面，本發(fā)明提供從轉(zhuǎn)基因非-人動物例如轉(zhuǎn)基因小鼠分離的B細胞，所述轉(zhuǎn)基因非-人動物表達人抗-OX40L抗體(例如，由選自產(chǎn)生按照本發(fā)明的抗體的雜交瘤細胞組成的組的細胞系產(chǎn)生的親本抗體)。優(yōu)選地，分離的B細胞從轉(zhuǎn)基因非-人動物例如轉(zhuǎn)基因小鼠而獲得，所述轉(zhuǎn)基因非-人動物己經(jīng)用純化的或重組形式的OX40L抗原和/或表達OX40L的細胞免疫。優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)基因非-人動物，例如轉(zhuǎn)基因小鼠，具有包括人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組，其編碼完整的或部分的本發(fā)明的抗體。然后，使分離的B細胞無限增殖以提供人抗-OX40L抗體的來源(例如，雜交瘤)。因此，本發(fā)明還提供能夠產(chǎn)生按照本發(fā)明的人單克隆抗體的雜交瘤。在一個實施方案中，所述雜交瘤包括從轉(zhuǎn)基因非-人動物例如轉(zhuǎn)基因小鼠獲得的B細胞，所述轉(zhuǎn)基因動物具有包括人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組，其編碼本發(fā)明的抗體的全部或部分，被融合到無限增殖的細胞上。在一個具體的實施方案中，所述轉(zhuǎn)基因非-人動物是轉(zhuǎn)基因小鼠，其具有包括人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組，所述基因組編碼本發(fā)明的抗體的全部或部分。所述轉(zhuǎn)基因非-人動物可以用OX40L抗原的純化的或富集制劑和/或表達OX40L的細胞進行免疫。優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)基因非-人動物例如轉(zhuǎn)基因小鼠能夠產(chǎn)生針對OX40L的人單克隆抗體的同種型。按照本發(fā)明的人單克隆抗體可以通過用OX40L抗原的純化的或富集制劑和/或表達OX40L的細胞來免疫轉(zhuǎn)基因非-人動物例如轉(zhuǎn)基因小鼠而產(chǎn)生，所述轉(zhuǎn)基因非-人動物具有包括人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組，所述基因組編碼本發(fā)明的抗體的全部或部分。然后得到所述動物的B細胞(例如脾B細胞)，并且與骨髓瘤細胞融合，以形成分泌針對OX40L的人單克隆抗體的無限增殖的雜交瘤細胞。在一個優(yōu)選實施方案中，針對OX40L的人單克隆抗體可以使用攜帶部分人免疫系統(tǒng)而不是小鼠免疫系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因小鼠而產(chǎn)生。這些轉(zhuǎn)基因小鼠，本文叫作"HuMAb"小鼠，含有編碼未重排的人免疫球蛋白基因的人免疫球蛋白基因小基因座(minilod)(所述未重排的人免疫球蛋白基因包括重(p和Y)和K輕鏈(恒定區(qū)基因))，以及使內(nèi)源IH和K鏈基因座失活的目標突變(Lonberg,N.,等.，Nature368(1994)856-859)。因此，所述小鼠表現(xiàn)出減少的小鼠IgM或K的表達，并且響應(yīng)免疫，所引入的人重和輕鏈轉(zhuǎn)基因經(jīng)歷了種類轉(zhuǎn)換和體細胞突變，以產(chǎn)生高親和力的人IgG單克隆抗體(Lonberg,N.,等,，Nature368(1994)856-859;在Lonberg,N.,HandbookofExperimentalPharmacology113(1994)49-101中綜述；Lonberg,N.，禾口Huszar,D.,Intern.Rev.Immunol.25(1995)65-93;和Harding,F.,禾口Lonberg,N.,Ann.N.Acad.Sci.764(1995)536-546)。HuMAb小鼠的制備在Taylor,L.，等.，NucleicAcidsRes.20(1992)6287-6295;Chen,J.,等.，Int.Immunol.5(1993)647-656;Tuaillon,N.,等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(1993)3720-3724;Choi,T.K.,等.，Nat.Genet.4(1993)117-123;Chen,J.,等.，EMBOJ.12(1993)821-830;Tuaillon,N.，等.，J.Immunol.152(1994)2912-2920;Lonberg，N.,等.，Nature368(1994)856-859;Lonberg,N.，34HandbookofExperimentalPharmacology113(1994)49-101;Taylor,L.,等.,Int.Immunol.6(1994)579-591;Lonberg,N.，禾OHuszar,D.,Intern.Rev.Immunol.25(1995)65-93;Harding,F.，禾口Lonberg，N.,Ann.N.Acad.Sci.764(1995)536-546;Fishwild,D.M.,等.，Nat.Biotechnol.14(1996)845-851中描述，所有這些的內(nèi)容通過參考完全結(jié)合于此。還可以參見，美國專利號5,545,806;5,569,825;5,625,126;5,633,425;5,789,650;5,877,397;5,661,016;5,814,318;5,874,299;5,545,807;5,770,429;WO98/24884;WO94/25585;WO93/1227;WO92/22645;和WO92/03918。為了充分地產(chǎn)生針對OX40L的人單克隆抗體，可以按照常規(guī)方法，如由Lonberg，N.，等,，Nature368(1994)856-859;Fishwild,D.M.,等.，Nat.Biotechnol.14(1996)845-851禾卩WO98/24884所描述的那樣，將HuMAb小鼠用OX40抗原純化的或富集的制劑和/或表達OX40L的細胞進行免疫。優(yōu)選地，在第一次免疫時，小鼠應(yīng)該是6-16周齡。例如，可以使用偶聯(lián)到KLH上的或在PBS中的可溶OX40L抗原(例如，從表達OX40L的細胞純化的)的純化的或富集的制劑來腹膜內(nèi)免疫HuMAb小鼠。這可以通過用分離的OX40L蛋白與表達OX40L的細胞如腫瘤細胞系交替免疫而組合，以促進免疫應(yīng)答。使用各種抗原累積的經(jīng)驗表明，當初始用在完全弗氏佐劑中的抗原進行腹膜內(nèi)(i.P.)免疫時，其后每隔一周用在不完全弗氏佐劑中的抗原i.p.免疫(例如，達到總共6次)，HuMAb轉(zhuǎn)基因小鼠應(yīng)答最好。免疫應(yīng)答可以用從后眼眶采血獲得的血漿樣品而在免疫流程的過程中進行監(jiān)測。血漿可以通過ELISA進行篩選，并且具有足夠的抗-OX40L人免疫球蛋白滴度的小鼠可以用于使得相應(yīng)的B細胞無限增殖。在處死和移除脾和淋巴結(jié)前3-4天，可以用抗原將小鼠靜脈內(nèi)增強。一些小鼠將對于每種抗原進行免疫。例如，總共HCo7和HCo12種系的12只HuMAb小鼠可以被免疫。HCo7小鼠具有在其內(nèi)源輕鏈(K)基因中的JKD中斷(如在Chen，J.,等.，EMBOJ.12(1993)821-830中所述)、在其內(nèi)源重鏈基因中的CMD中斷(如在WO01/14424實施例1中所述)、KCo5人K輕鏈轉(zhuǎn)基因(如在Fishwild,D,M.,等.，Nat.Biotechnol.14(1996)845-851中所述)、和HCo7人重鏈轉(zhuǎn)基因(如在美國專利號5,770，429中所述)。HCo12小鼠具有在其內(nèi)源輕鏈(k)基因中的JKD中斷(如在Chen,J.,等.，EMBOJ.12(1993)821-830中所述)、在其內(nèi)源重鏈基因中的CMD中斷(如在WO01/14424實施例1中所述)、KCo5人k輕鏈轉(zhuǎn)基因(如在Fishwild，D.M.，等.，Nat.Biotechnol.14(1996)845-851中所述)、和Hco12人重鏈轉(zhuǎn)基因(如在WO01/14424實施例2中所述)。可以將小鼠的淋巴細胞分離，并且基于標準流程使用PEG與小鼠骨髓瘤細胞融合，以產(chǎn)生雜交瘤細胞。然后，篩選得到的雜交瘤關(guān)于抗原-特異性抗體的產(chǎn)生。例如，用50%PEG，將來自于免疫小鼠的脾和淋巴結(jié)來源的淋巴細胞的單一細胞混懸液與1/6數(shù)目的SP2/0非分泌性小鼠骨髓瘤細胞(ATCC,CRL1581)融合。將細胞以大約2X1()s接種在平底微量滴定培養(yǎng)平板上，其中在選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)約2周。然后，對于人抗-OX40L單克隆IgM和IgG抗體，通過ELISA篩選單個孔。一旦廣泛的雜交瘤生長發(fā)生，通常在10-14天后，分析培養(yǎng)基。將分泌抗體的雜交瘤細胞重新接種，再次篩選，并且如果仍然對于人IgG、抗-OX40L單克隆抗體是陽性的，那么可以通過限制性稀釋亞克隆至少2次。然后，將穩(wěn)定的亞克隆在體外培養(yǎng)，以在組織培養(yǎng)基中產(chǎn)生抗體用于表征。檢測樹主要由關(guān)于IgG的非特異性檢測("IgG-ELISA")、接著通過特異性ELISA檢測和外觀(apparent)FACS檢測組成，用來確定與純化的OX40L蛋白或OX40L-表達細胞結(jié)合的抗原。下一步驟包括功能性檢測，其中確定了抗OX40L抗體與其天然相互作用伴侶，例如對于純化的OX40L或者在細胞上表達的OX40L的可溶的、純化的0X40，的競爭，例如，競爭性ELISA或FACS。下一步驟包括功能性檢測，其中確定了抗-OX40L抗體阻滯OX40-信號傳導的能力，例如，NFkB-活化(="NFkB-檢測")。下一步驟包括功能性檢測，其中確定了抗-OX40L抗體關(guān)于T細胞活化的阻滯能力("T-細胞活化檢測"和"TT-檢測")。由于CDR序列負責抗體-抗原的相互作用，所以，可能通過在來自于不同的人抗體的構(gòu)架序列上構(gòu)建表達載體而表達按照本發(fā)明的重組抗體，所述表達載體包括按照本發(fā)明的CDR序列(參見，例如，Riechmann,L.,等.，Nature332(1998)323-327;Jones,P.,等.，Nature321(1986)522-525;和Queen,C.,等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86(1989)10029-10033)。這樣的構(gòu)架序列可以從包括種系人抗體基因序列的公共DNA數(shù)據(jù)庫獲得。由于這些種系序列不包括在B細胞成熟過程中通過V(D)J連接而形成的完全組裝的可變基因，所以，這些種系序列不同于成熟的抗體基因序列。種系基因序列還在個體均一地貫穿可變區(qū)不同于高親和力次級所有成分抗體的序列。本發(fā)明還包括按照本發(fā)明的抗體用于在體外診斷OX40L的應(yīng)用，優(yōu)選地通過確定樣品的OX40L(可溶的或膜-結(jié)合的)與按照本發(fā)明的抗體的結(jié)合的免疫學檢測。在另一方面，本發(fā)明提供一種組合物，例如，藥物組合物，其包含一種或者本發(fā)明的人單克隆抗體或其抗原-結(jié)合部分的組合，與藥用載體一起配制。更具體地，所述組合物是藥物或診斷組合物，并且甚至更具體地，所述藥物組合物包括上文定義的抗體和至少一種藥用賦形劑。所述組合物必須是無菌的，并且在某種程度上是流體，以便于通過注射器遞送所述組合物。當用于本文時，"藥用載體"包括任何和所有生理上相容的溶劑、分散基質(zhì)、涂層、抗細菌和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑等。優(yōu)選地，所述載體適用于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腸胃外、脊髓或表皮施用(例如，通過注射或灌注)。優(yōu)選地，這樣的載體是水性pH緩沖溶液(例如，乙酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽或組氨酸)，.優(yōu)選地等滲，優(yōu)選地另外含有無機鹽、糖、多羥基化合物和/或表面活性劑。藥用載體還是諸如在Remington'sPharmaceuticalSciences,第16版，Osol,A.Ed.(1980)中描述的那些?？贵w濃度優(yōu)選地從0.1mg/ml到50mg/ml。優(yōu)選地，1mM-200mM緩沖濃度的緩沖溶液的pH值在4.0-8.0范圍。優(yōu)選的鹽是lmM-200mM范圍的氯化鈉和/或磷酸鈉。優(yōu)選的糖是在1%-15%(/力范圍的蔗糖和/或海藻糖。優(yōu)選的多羥基化合物是1%-15%(w/v)范圍的丙三醇、丙二醇、液體聚乙二醇、和/或類似的。表面活性劑優(yōu)選地是0.001%-0.5%(w/v)范圍的聚山梨酸酯(例如聚山梨酸酯20或80)禾口/或poloxamere。優(yōu)選的藥物組合物含有0.1mg/ml-50mg/ml的抗體和lmM-200mMpH4.0-8.0磷酸緩沖的鹽。本發(fā)明的組合物可以通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的各種方法施用給需要其的患者。熟練的技術(shù)人員應(yīng)該理解，施用的途徑和/或方式將取決于需要的結(jié)果而不同。藥用賦形劑或載體包括無菌水性溶液或無菌粉劑，用于臨時制備無菌注射溶液或分散液。藥物活性物質(zhì)的這樣的介質(zhì)和試劑的應(yīng)用是本領(lǐng)域內(nèi)已知的。當用于本文時，短語"腸胃外施用"和"腸胃外地施用"意指除了腸和局部施用外的施用模式，通常通過注射的方式，并且包括但不限于，靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眼眶內(nèi)、心臟內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管的、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、囊下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)、硬腦膜外和胸骨內(nèi)的注射和灌注。在本發(fā)明的藥物組合物中的活性成分的實際給藥水平可以不同，以便獲得一定量的活性成分，所述一定量的活性成分有效實現(xiàn)對于具體的患者、組合物和施用模式的理想的治療反應(yīng)，而對患者沒有毒性。選擇的給藥水平將取決于許多藥物動力學因素，包括所用的本發(fā)明的具體的組合物或其酯、鹽或胺的活性，施用的途徑，施用的時間，要用的具體化合物排泄速率，治療的持續(xù)時間，與所用的具體組合物組合應(yīng)用的其它藥物、化合物和/或物質(zhì)，要治療的患者的年齡、性別、體重、狀況、綜合健康狀體和現(xiàn)有病歷等醫(yī)學領(lǐng)域內(nèi)公知的因素。典型的每周給藥劑量可以在約0.1mg/kg-約20mg/kg的范圍或更多，這取決于上文提及的因素。提供下述實例、參考文獻、序列表和附圖，以輔助對本發(fā)明的理解，它們的真正范圍在附上的權(quán)利要求中列出。應(yīng)該理解，可以以不背離本發(fā)明的精神對提出的方法進行改進。附圖簡述圖la:顯示TAG-34,LC.001,LC.005,LC.010，LC.019,LC.029,LC.033的"結(jié)合ELISA"。圖lb:顯示TAG-34,LC.001,LC.005,LC.010,LC.019，LC.029,LC.033的"阻滯ELISA"+1050數(shù)據(jù)。圖2:顯示TAG-34,LC.001,LC.005的"封閉FACS"。38圖3:顯示TAG-34,LC.OOl,LC.019和LC.024(不結(jié)合的抗體)的"NFkB-士a、、刷"圖4和5:顯示TAG-34,LC.OOl和LC.005的"T細胞活化檢測"和IC50-值(圖4:IL-2釋放，圖5:抑制)。圖6:顯示TAG-34，LC.OOl和LC.033的"TT-檢測"數(shù)據(jù)。圖7:顯示本發(fā)明的抗體與小鼠OX40L的交叉反應(yīng)性。A)對于在轉(zhuǎn)染的禾口WT細胞上表達的hOX40L的控制，B)抗體與表達hOX40L的K562細胞的結(jié)合，C)對于在轉(zhuǎn)染的和WT細胞上表達mOX40L的控制，D)抗體與表達hOX40L的K562細胞的結(jié)合，和E)抗體與WTK562細胞的結(jié)合0=3)。圖8:顯示本發(fā)明的抗體結(jié)合Clq的能力(r^3)。圖9:顯示本發(fā)明的抗體激活C3c的能力(r^3)。圖10:顯示本發(fā)明的抗體結(jié)合FcyRI(n=4)、FcyRIIa(11=4)和FcyRIIb(n=4)的能力。圖ll:顯示本發(fā)明的抗體結(jié)合NK細胞上FcYRIIIa(CD16)的能力(6個供體的平均值士SEM)。圖12:蛋白質(zhì)印跡；泳道1，4,7:標記；泳道2,5,8:100ngOX40L;泳道3,6，9:40ngOX40L。序列表描述SEQIDNO:lk輕鏈，LC.OOl的可變區(qū)SEQIDNO:2LC.OOl的Y重鏈可變區(qū)SEQIDNO:3k輕鏈，LC.005的可變區(qū)SEQIDNO:41X.005的Y重鏈可變區(qū)SEQIDNO:5k輕鏈，LC.010的可變區(qū)SEQIDNO:6LC.010的Y重鏈可變區(qū)SEQIDNO:7k輕鏈，LC.029的可變區(qū)SEQIDNO:8LC.029的Y重鏈可變區(qū)SEQIDNO:9k輕鏈，LC.019的可變區(qū)SEGIDNO:IOLC.019的Y重鏈可變區(qū)SEQIDNO:11k輕鏈，LC.033的可變區(qū)SEQIDNO:12LC.033的y重鏈可變區(qū)SEQIDNO:13k輕鏈恒定區(qū)SEQIDNO:14重鏈恒定區(qū)SEQIDNO:15丫4重鏈恒定區(qū)SEQIDNO:16k輕鏈，LC.033的突變可變區(qū)SEQIDNO:lk輕鏈，LC.059的可變區(qū)SEQIDNO:17LC.059的Y重鏈可變區(qū)SEQIDNO:18k輕鏈，LC.060的可變區(qū)SEQIDNO:19LC.060的Y重鏈可變區(qū)SEQIDNO:lk輕鏈，LC.063的可變區(qū)SEQIDNO:20LC.063的Y重鏈可變區(qū)SEQIDNO:21-57CDR序列SEQIDNO:58LC.OOl的Y重鏈(人IgGl型)SEQIDNO:59LC.OOl的Y重鏈(L234A,L235A人IgGl突變體)SEQIDNO:60LC.OOl的Y重鏈(S228P人IgG4突變體)SEQIDNO:61LC.OOl的k輕鏈SEQIDNO:62LC.005的Y重鏈(人IgGl型)SEQIDNO:63LC.005的丫重鏈(L234A,L235A人IgGl突變體)SEQIDNO:64LC.005的y重鏈(S228P人IgG4突變體)SEQIDNO:65LC.005的k輕鏈SEQIDNO:66LC.060的Y重鏈(人IgGl型)SEQIDNO:67LC.060的Y重鏈(L234A,L235A人IgGl突變體)SEQIDNO:68LC.060的Y重鏈(S228P人IgG4突變體)SEQIDNO:69LC.060的k輕鏈縮略詞氨基酸縮寫為3個(Leu)或1個字母編碼(L)。S228P意指在IgG4重鏈位置228的絲氨酸與脯氨酸的置換。L234意指按照EU編號方式(Kabat)在位置234的氨基酸亮氨酸。L234A意指在位置234的氨基酸亮氨酸變成丙氨酸。L235A意指在位置235的氨基酸亮氨酸變成丙氨酸。PVA236意指在236區(qū)域，IgGl的ELLG或者IgG4的EFLG被修改成PVA。GLPSS331意指在331區(qū)域，IgGl的ALPAP或IgG2的GLPAP變成GLPSS。aG236意指位置236的氨基酸被刪除。IgG4x意指IgG4中突變S228P。LC2010-001是LC.OOl的異名。Fcg是Fcgamma(Fc力的異名?？贵w的其它序列修改類似地定義。融合到組氨酸標記上的重組可溶的人OX40LhOX40L-His融合到組氨酸標記上的重組可溶的小鼠ox4o;lmOX40L-His融合到Flag標記上的重組可溶的人OX40LhOX40L-FIag融合到Flag標記上的重組可溶的小鼠OX40LmOX歡-Flag融合到人Fey上的重組可溶的人OX40hOX40-hFc兔抗-小鼠Fcy單克隆抗體抗-mFc山羊抗-人Fcy單克隆抗體抗-hFc小鼠抗-組氨酸單克隆抗體抗-His融合到小鼠Fcy上的重組可溶的人OX40hOX40-mFc小鼠抗-TNFa單克隆抗體抗-TNFa小鼠抗-CD40L單克隆抗體抗-CD40L腫瘤壞死因子aTNFaCD40配體CD40L兔抗-人OX40L單克隆抗體TAG34人抗-人OX40L單克隆抗體LC.001,LC德，41<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>產(chǎn)生生產(chǎn)抗-OX40L抗體的雜交瘤細胞系雜交瘤的培養(yǎng)在IMDM(Cambrex)，胎克隆1牛血清(PerbioScience),原始雜交瘤克隆因子(Igen)，丙酮酸鈉，青霉素/鏈霉素，2-巰基乙醇，HAT(Sigma-Aldrich)和卡那霉素(Invitrogen)中，在37°C和5%C02，培養(yǎng)HuMab雜交瘤細胞。轉(zhuǎn)基因小鼠的免疫流程LC2010-001:將6只HCo7(2只雄性和4只雌性)，種系GG2201(Medarex，SanJos6，CA,USA),和4只HCo12(4只雄性)，種系GG2198(Medarex,SanJos^CA,USA)交互地用瞬時轉(zhuǎn)染了人OX40L(hOX40L)表達載體的1X106個HEK293細胞和20pghOX40L可溶的胞外結(jié)構(gòu)域進行免疫?？偣策M行8次免疫，4次用表達hOX40L的細胞進行腹膜內(nèi)(i.p.)免疫，和4次在尾巴底部用重組蛋白進行皮下(s.c.)免疫。對于第一次免疫，將100pl1X1()6個HEK293-hOX40L細胞與100(il完全弗氏佐劑(CFA;DifcoLaboratories,Detroit,USA)混合。對于所有其它的免疫，使用100pl在PBS中的細胞，或者將重組蛋白與100pl不完全弗氏佐劑(ICFA;Difco)混合。當發(fā)現(xiàn)抗-hOX40L的血清滴度足夠時，在融合前4和3天，將小鼠用在200pilPBS中的15嗎hOX40L胞外結(jié)構(gòu)域另外靜脈內(nèi)(i.v.)增強2次。LC2010-001,LC.059,LC.060和LC.063來源于HCo12小鼠。LC2010-005,-010，-019,-029和-033:將5只HCo7(4只雄性和1只雌性)，種系GG2201(Medarex,SanJos6,CA,USA)用20嗎hOX40L可溶的胞外結(jié)構(gòu)域免疫?？偣苍谖舶偷撞窟M行7次免疫，4次腹膜內(nèi)(i.p.)和3次皮下(s.c.)免疫。對于第一次免疫，將100pil重組蛋白與lOOm1完全弗氏佐劑(CFA;DifcoLaboratories,Detroit,USA)混合。對于所有其它的免疫，將100pl重組蛋白與100^不完全弗氏佐劑(ICFA;Difco)混合.當發(fā)現(xiàn)抗-hOX40L的血清滴度足夠時，在融合前4和3天，將小鼠用在200plPBS中的15嗎hOX40L胞外結(jié)構(gòu)域另外靜脈內(nèi)(i.v.)增強2次。雜交瘤的產(chǎn)生將小鼠處死，并且收集脾和在腹部大動脈和腔靜脈側(cè)面的淋巴結(jié)。按照標準操作方法，用融合伴侶SP2.0細胞進行脾細胞和淋巴結(jié)細胞的融抗原特異性ELISA通過抗原特異性ELISA確定免疫小鼠血清中的抗-OX40L滴度。將平板(96平底ELISA平板，Greiner)用溶解在PBS中的O.l昭/ml純化的OX40L包被，并且在室溫下包被過夜。此后，在室溫下將孔用PBSTC(含有0.05%吐溫20(Sigma-AldrichChemieBV)禾Q2。/o雞血清(Gibco)的PBS)封閉1小時。將檢測的血清樣品(taps)在PBSTC中1:50稀釋，并且添加到孔中。將從免疫前小鼠獲得的血清1:100溶解在PBSTC中，并且用作陰性對照。將針對人OX40L的小鼠抗體1:50溶解在PBSTC中，并且用作陽性對照。將平板在室溫溫育1小時。隨后，將平板用PBST(含有0.05%Tween20的PBS)洗滌2次。將Gt-a-huIgG-HRP(Jackson)1:5000稀釋在PBSTC中，并且添加到含有測試樣品和陰性對照的孔中。將Rb-a-mIgG(Jackson)1:3000稀釋在PBSTC中，并且添加到含有陽性對照的孔中。將平板在室溫下溫育1小時。最后，將平板用PBST洗滌3次，并且用新鮮制備的ABTS⑧溶液(1mg/ml)(ABTS:2，2，-疊氮基雙(3-乙苯基噻唑啉-6-磺酸))在室溫下黑暗處反應(yīng)30分鐘。在405nm處測定吸收。k-ELISA為了確定由融合產(chǎn)生的雜交瘤細胞是否產(chǎn)生人抗體，進行了k-ELISA。將ELISA平板用在PBS中1/10000稀釋的大鼠抗-人IgGk-徑鏈抗體(DAKO)包被，在4。C培養(yǎng)過夜。棄去細胞后，將平板通過在室溫下與PBSTC(PBSC,補充了0.05%吐溫-20(PBSTC))溫育1小時進行封閉。此后，將孔用1/2稀釋在PBSTC中的雜交瘤培養(yǎng)物上層清液溫育。1/2稀釋在PBSTC中的培養(yǎng)基用作陰性對照，1/100稀釋在PBSTC中的K-輕鏈陽性小鼠血清用作陽性對照。隨后，將孔洗滌3次，并且在37°C，用1/2000稀釋在PBSTC中的HRP-綴合的大鼠抗-人IgGF(ab，)2(DAKO)溫育1h。將孔洗滌3次，并且在室溫下(RT)黑暗處用新鮮制備的ABTS⑧溶液(1mg/ml)進行檢測30分鐘。在ELISA平板讀數(shù)儀上測定405nm的吸收。實施例2抗-OX40LHuMab可變結(jié)構(gòu)域的克隆和測序(k-輕鏈和Yl-重鏈)通過標準cDNA合成/PCR方法，分離編碼OX40LHuMabs的輕鏈可變區(qū)VL和重鏈可變區(qū)Vh的核昔酸序列。使用GeneRacerTM試劑盒(Invitrogen)，從1X106-1X107個雜交瘤細胞中制備總RNA。來源于雜交瘤的RNA用作第1鏈cDNA合成和GeneRacerOligo-dT引物連接的模板。第2鏈cDNA合成和編碼VL與Vh的cDNA片段的進一步PCR擴增分別用反向輕鏈和重鏈引物和5'-特異的GeneRacerTM引物進行，所述反向輕鏈和重鏈引物與K-輕鏈和Yl-重鏈恒定區(qū)的核苷酸序列互補。使用來自InvitrogenTMLifeTechnologies的TOPOTA克隆試劑盒，和pCR4-TOPOTM作為克隆載體，而將PCR產(chǎn)物克隆。通過使用EcoRI消化將適當?shù)馁|(zhì)粒限制性繪圖，以及分別約740和790bp的Vl和VH的期望/計算的DNA片段大小，而確定克隆的PCR克隆的PCR片段的DNA序列通過雙鏈測序進行確定。GCG(GeneticsComputerGroup,Madison,Wisconsin)軟件包版本10.2和載體-NTI8(InforMax,Inc)用于常規(guī)數(shù)據(jù)處理。使用GCG模CLUSTALW比對DNA和蛋白序列。使用程序GENEDOC(版本2.1)進行序列比對。實施例3構(gòu)建抗-OX40LIgGlHuMab的表達質(zhì)粒將抗-OX40LHuMab輕鏈和重鏈的編碼基因分別組裝在哺乳動物細胞表達載體中。因此，將編碼抗-OX40LHuMab輕鏈可變區(qū)(VO和人K-輕鏈恒定區(qū)(CbSEQIDNO:13,或來自SEQIDNO:61，65或69)的基因片段連接起來，同樣地將抗-OX40LHuMab重鏈可變區(qū)(VH)和人Yl-重鏈恒定區(qū)(CH,-鉸鏈-CH2-CH3,SEQIDNO:14，或來自SEQIDNO:58,62或66)的基因片段連接起來。關(guān)于從中可以推斷出密碼子應(yīng)用的人輕鏈和重鏈核苷酸序列的一般信息在Kabat，E.A.,等.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版.，NIHPublicationNo.91-3242(1991)中給出?？?OX40LHuMabK-輕鏈的轉(zhuǎn)錄單位由下列元件組成-人巨細胞病毒(HCMV)的直接早期增強子和啟動子，-包括Kozak序列的合成的5'-UT，-包括信號序列內(nèi)含子的小鼠免疫球蛋白重鏈信號序列，-克隆的抗-OX40LHuMab可變輕鏈cDNA，其用5'端唯一的Bsml限制性位點，和剪接供體位點，以及3'端唯一的Notl限制性位點而排列，-基因組人K-基因恒定區(qū)，其包括內(nèi)含子2小鼠Ig-K增強子[Picard，D.，禾口Schaffner，W.,Nature307(1984)80-82]禾口-人免疫球蛋白K-多聚腺苷酸化("polyA")信號序列?？?OX40LHuMabYl-重鏈的轉(zhuǎn)錄單位由下列元件組成-人巨細胞病毒(HCMV)的直接早期增強子和啟動子，-包括Kozak序列的合成的5'-UT，-修飾的小鼠免疫球蛋白重鏈信號序列，其包括信號序列內(nèi)含子，-克隆的抗-OX40LHuMab可變重鏈cDNA，其用5，端唯一的Bsml限制性位點，和剪接供體位點，以及3'端唯一的Notl限制性位點而排列，45-基因組人yl-重鏈基因恒定區(qū)，其包括小鼠Ig^增強子(Neuberger,M.S.:EMBOJ.2(1983)1373-1378)，-人Y!-免疫球蛋白多聚腺苷酸化("polyA")信號序列?？?OX40LHuMabK-輕鏈和yl-重鏈表達質(zhì)粒的功能性元件除了抗-OX40LHuMabK-輕鏈或yl-重鏈表達盒之外，這些質(zhì)粒還包含-潮霉素抗性基因-埃巴病毒(EBV)的復制起點，oriP-載體pUC18的復制起點，其允許這一質(zhì)粒在大腸桿菌中復制，和-在大腸桿菌中賦予氨芐青霉素抗性的B-內(nèi)酰胺酶基因。實施例4構(gòu)建抗-OX40LlgG4HuMab的表達質(zhì)?？?OX40LY4-重鏈原型表達質(zhì)粒衍生于抗-OX40LYl-重鏈表達質(zhì)粒，其通過用人基因組y4-恒定區(qū)(SEQIDNO:15或來自SEQIDNO:60,64或68的未突變的，恒定區(qū))和!4-免疫球蛋白多聚腺苷化-信號序列取代人基因組Yl-恒定區(qū)和Yl-免疫球蛋白多聚腺苷化("polyA")信號序列。對于抗-OX40LHuMabK-輕鏈的表達，使用同用于IgGl所述相同的表達質(zhì)粒(參見上文)。實施例5基于LC.001構(gòu)建突變體(變體)抗-OX40LIgGl和IgG4的表達質(zhì)粒使用QuickChangeTM定點誘變試劑盒(Stratagene)，通過定點誘變野生型表達質(zhì)粒而生成編碼突變體抗-OX40Ly"和丫4-重鏈的表達質(zhì)粒。按照EU編號方式(Edelman,G.M.，等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA63(1969)78-85;Kabat,E.A.,等，,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版.，PublicHealthService,NIHPublicationNo.91-3242,Bethesda,MD(1991))，對氨基酸進行編號。<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>Biotechnol.Bioeng.75(2001)197-203.中給出。實施例7抗體TAG34,LC.OOl，LC.005,LC.OIO，LC.019,LC.029,LC.033的親和力分析儀器Biacore3000，運行和反應(yīng)緩沖液HBS-P(10mMHEPES,150mMNaCl,0.005%吐溫20,ph7.4)，25°C。分析物的注射在0.78nM和100nM之間的7個濃度進行3分鐘，并且用HBS-P洗滌5分鐘。表面(羧甲基化的葡聚糖表面，CM)的再生通過每次10mM甘氨酸pH2.0持續(xù)1min的2次注射而進行。芯片、檢測形式和注射的順序以及動力學數(shù)據(jù)與下表中的描述相對應(yīng)。動力學數(shù)據(jù)通過將動力學數(shù)據(jù)與1:1Langmuir結(jié)合模型相適配而計算。表2芯片捕獲配體分析物ka(應(yīng)s)kd(1/s)KD(M)CM5抗-mFcgTAG34hOX40L-His8.84X1043.32X10-53.75X1(T10CM5抗-hFcgLC.001hOX40L-His9.01X1047.16X10-9<1.1X10-11CM5抗-hFcgLC.005hOX40L-His6.84X1042,02X10-7<1.5X10-UCM5抗-hFcgLC細hOX40L-His6.25X1042.5X1(T53.99X10—10CM5抗-hFcgLC.019hOX亂-His7.89X1047.53X1(T8<1.2Xl(TnCM5抗-hFcgLC.029hOX40L-His1,41X1052,4X1(T8<7，1X10-12CM5抗-hFcgLC.033hOX40L-His7.01X1042.09Xl(T7<1.4X10—11在TAG34和mOX40L之間沒有相互作用可以被測定。對于所有Biacore檢測的數(shù)據(jù)評估和數(shù)據(jù)保存從樣品曲線中減去陰性對照數(shù)據(jù)(例如，緩沖液曲線)，以校正系統(tǒng)固有的基線漂移和減少噪聲信號。BiaEvaluation版本4.01用于Sensorgrams分析和親和力數(shù)據(jù)計算。實施例8抑制hOX40L與固定的hOX40相互作用的抗-hOX40L抗體的抑制競爭檢測儀器Biacore3000，運行和反應(yīng)緩沖液HBS-P(10mMHEPES,150mMNaCl,0.005%吐溫20，ph7.4)，25°C。注射前，將分析物(10nM)禾口競爭劑(在0.78nM和100nM之間的8個濃度)在22°C預先溫育至少20min。分析物+/-競爭劑的注射進行3分鐘，并且用HBS-P洗滌3分鐘。表面的再生通過每次10mM甘氨酸pH2.0持續(xù)1min的2次注射而進行。芯片、檢測形式和注射的順序以及動力學數(shù)據(jù)與下表3中的描述相對應(yīng)。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>所有的抗體抑制溶液中OX40L與OX40的結(jié)合(溶液親和力)。LC.001和LC.005表現(xiàn)出比TAG34更低的IC50-值。實施例9抗-OX40L抗體TAG34，LC.001，LC.005，LC.010，LC.019,LC.029,LC.033,LC.060的表位特性描述儀器Biacore3000，運行和反應(yīng)緩沖液HBS-P(10mMHEPES,150mMNaCl,0.005%吐溫20,ph7.4),25°C。通過列出的抗體之間的交叉競爭而確定表位組。注射前，將分析物(50nM)和競爭劑(100nM)在22°C預先溫育至少20min。分析物+A競爭劑的注射進行2分鐘，并且用HBS-P洗滌3分鐘。表面的再生通過每次10mM甘氨酸pH2.0持續(xù)1min的2次注射而進行。芯片、檢測形式和注射的順序以及動力學數(shù)據(jù)與下表4中的描述相對應(yīng)。<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>TAG34識別的OX40L表位定義為表位A。然而，TAG34不結(jié)合抗體濃度為100ng的變性的OX40L(在蛋白質(zhì)印跡檢測中)。在一個表位組(A或B)內(nèi)的抗體表現(xiàn)出交叉抑制活性，而不同組的抗體表現(xiàn)出附加的結(jié)合信號。LC.019中和來自組A以及組B的其它抗體。實施例10TAG34，LC.001和LC.005與CD40L和TNFa的結(jié)合特異性儀器Biacore3000，運行和反應(yīng)緩沖液HBS-P(10mMHEPES,150mMNaCl，0.005%吐溫20,ph7.4),25。C。分析物的注射在100nM和500nM進行3分鐘，并且用HBS-P洗滌2分鐘。表面的再生通過每次100mMHCl持續(xù)lmin的2次注射而進行。芯片、檢測形式和注射的順序以及動力學數(shù)據(jù)與下表5中的描述相對應(yīng)。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>在這種檢測中，CD40L表現(xiàn)出對所有抗體或?qū)π酒砻娴哪撤N非特異性結(jié)合，但是在減去背景信號后，這一檢測表明，不存在TNFa和CD40L(達到500nM)與固定的抗體TAG34,LC.001和LC.005的非特異性結(jié)合。實施例11抗體LC.001-IgGl和LC.001-IgG"的親和力分析儀器Biacore3000，運行和反應(yīng)緩沖液HBS-P(10mMHEPES，150mMNaCl,0.005%吐溫20,ph7.4),25°C。分析物的注射在0.78nM-100nM的8個濃度進行3分鐘，并且用HBS-P洗滌5分鐘。表面的再生通過每次100mMHC1持續(xù)1min的2次注射而進行。芯片、檢測形式和注射的順序以及動力學數(shù)據(jù)與下表中的描述相對應(yīng)。動力學數(shù)據(jù)通過將動力學數(shù)據(jù)與1:1Langmuir結(jié)合模型相適配而計算。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>LC.001和LC.001-IgG4x表現(xiàn)出對hOX40L-His相同的親和力。實施例12檢測與OX40L結(jié)合的抗體的ELISA檢測將SA-包被的平板(96平底ELISA平板，Microcoat)用溶解在溫育緩沖液(IB=含有0.1^吐溫20(Serva)和1X封閉蛋白的PBS)中的0.5jig/ml生物素化的OX40L在室溫下包被1小時。然后，將平板用洗滌緩沖液(WB二含有0.1%吐溫20的鹽水)洗滌2次。將樣品(細胞培養(yǎng)物上層清液或純化的抗體)在IB中連續(xù)稀釋，并且添加到孔中。將平板在室溫下溫育1小時。隨后，將平板用WB洗滌2次。隨后，將針對人IgG的山羊抗體與POD(Dianova)的綴合物在IB中稀釋到50ng/ml，并且添加到孔中。平板在室溫下溫育l小時。最后，將平板用WB洗滌2次，并且在室溫(RT)下黑暗處用現(xiàn)成可用的ABTS⑧溶液反應(yīng)。在最高濃度的吸收達到足夠的OD時，在405nm測量吸收(圖la)。獲得3nM-8nM范圍內(nèi)的EC50值。實施例13將SA-包被的平板(96平底ELISA平板，Microcoat，德國)用溶解在IB中的0.5昭/ml生物素化的OX40L在室溫下包被1小時。然后，將平板用WB(PBS緩沖液，0.1%(w/v)吐溫tm20)洗滌2次。將樣品在IB中稀釋到1lig/ml濃度，并且以連續(xù)稀釋添加到孔中。為了獲得OX40與OX40L的最大結(jié)合，在某些孔中只加入IB。然后，向每個孔中，加入濃度為0.2|ag/ml的與洋地黃毒苷(RocheDiagnosticsGmbH，DE)綴合的人OX40溶液。將平板在室溫下溫育1小時。隨后，將平板用WB洗滌2次。將綿羊〈洋地黃毒苷〉-POD(Roche)在IB中稀釋到50mU/ml，并且添加到孔中。平板在室溫下溫育1小時。最后，將平板用WB洗滌2次，并且在室溫(RT)下黑暗處用現(xiàn)成可用的八8丁3@溶液反應(yīng)。10-20分鐘后，在405nm測量吸收(圖lb)。獲得1nM-4nM范圍內(nèi)的IC50值。實施例14檢測抑制人OX40與在K562細胞(K562—OX40L細胞)上表達的人OX40L相互作用的HuMabs的FACS-檢測目的用于確定HuMabhOX40L阻滯Dig-標記的hOX40:hFc融合蛋白與表達hOX40L的細胞系K562—hOX40L相互作用的特性的檢測。方法所述檢測用Dig標記的hOX40:hFc作為"檢測劑"和HuMabhOX40L作為"競爭劑"而進行。檢測劑儲液0.5pg/Vl-1:10稀釋在PBS中，100^抗-洋地黃毒苷-FLUOS。1:25稀釋在PBS/0.5%BSA/1%封閉試劑(RocheDiagnosticsGmbH,DE)中。將2xl05K562—OX40L細胞(在ISF-0中生長)在2mlPBS中洗滌，并且重懸在100plPBS中。這之后加入在PBS中的競爭劑(競爭劑/試劑關(guān)系0:1/1:1/1.5:1/2:1/2.5:2/5:1)。這之后是30Min溫育時間，RT和白天光照。然后，加入試劑(在PBS中)；溫育時間30Min，RT和白天光照。將細胞在2mlPBS中洗滌，并且通過離心沉淀。加入用于染色的二級抗體(抗-洋地黃毒苷-熒光素，F(xiàn)ab-片段(Roche,1207741))，并且溫育30Min,4。C在黑暗處。將細胞在2mlPBS中洗滌，并且通過離心沉淀。之后將細胞重懸在0.5mlPBS中。樣品的測定在FACS-Scan中進行(圖2)。實施例15確定抗體對hOX40/hOX40L信號傳導的抑制能力的功能性檢測(，，NFKB-檢測")將Hela野生型(wt)和表達人OX40的HeLa細胞(HeLa—OX40)生長在極限必需培養(yǎng)基(MEM)，1X丙酮酸鈉，lX非必需氨基酸(Gibco),10%FCS中，并且在重組細胞的情形中，+600pg/mlG418。K562和表達OX40L的K562生長在ISF-0培養(yǎng)基中，并且在重組細胞的情形中，加入200pg/mlG418。將HeLa—wt或HeLa_OX40細胞以3xl04個細胞/100pl的細胞密度接種在96-孔平板中，w/oG418，并且在C02-培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。以1:1的細胞-比-細胞關(guān)系加入K562wt或K562OX40L細胞。將福爾馬林-固定的或沒有福爾馬林-固定的表達OX40L的K562細胞(在-70。C凍存)解凍，并且在MEM/10%FCS中1:IO稀釋；將K562—OX40L細胞與針對OX40L的抗體在RT下預溫育30min。K562—OX40L細胞的刺激時間在30-150min之間。按照ActiveMotifNE-試劑盒的供應(yīng)者用法說明，進行從細胞核提取蛋白。ActiveMotif的TransAMNFkB-ELISA(檢測按照供應(yīng)者的用法說明進行)用來確定OX40-信號傳導，其導致NFKB活化。所述檢測在TecanMTP-讀數(shù)儀中在波長450/620nm吸收處進行(圖3)。得到在0.6-5nM范圍內(nèi)的對于所有LC抗體的IC50值。實施例16T-細胞活化檢測檢測原理將人外周血單核細胞(PBL)用低于最佳濃度的T-細胞促分裂原植物凝集素(PHA)激活，并且用過量表達OX40L的K562細胞共同刺激。在檢測條件下，在37°C培養(yǎng)24hr的活化的T-細胞產(chǎn)生IL-2。應(yīng)用ELISA檢測，測定在上層清液中的細胞因子。為了確定Mab的阻滯作用，在與PBL共同培養(yǎng)之前，將K562—OX40L細胞用抗體的適當稀釋液預先溫育1小時。方法通過在Histopaque⑧-1077(Sigma)中的密度梯度離心，將人外周血單核細胞(PBL)從肝素化的全血中分離。用Hanks洗滌后，使用Turk's溶液計數(shù)細胞，并且將細胞以106/ml的濃度重懸在補充了青霉素、鏈霉素和谷氨酰胺(Gibco10378-016)以及10%FBS的RPMI1640(Gibco)中。K562對照細胞(野生型)保持在補充了上述物質(zhì)的相同的RPMI培養(yǎng)基中。將轉(zhuǎn)染了OX40L的K562細胞保持在補充了終濃度為50mg/ml的遺傳霉素(G418,Gibco)的相同的培養(yǎng)基中。將K562細胞(WT或OX40L+)用相同的培養(yǎng)基稀釋為1.5X1()s個細胞/ml，并且以50pl/孔(0.75X104/孔)分裝到96孔組織培養(yǎng)平板的每個孔中。將適當?shù)腗ab稀釋液以20pl/孔的體積添加到孔中，并且在37"C溫育1hr。每一份稀釋液在一式兩份的孔內(nèi)檢測。PBL以100|_11/孔(105個細胞/孔)的體積加入。PBL比K562細胞的最終比例是13:1。以20pl/孔(終濃度0.75ng/ml)加入PHA(10X)(SigmaL-9132)。用RPMI/10%FCS使每個孔的總體積達到200pl。將平板在37。C5。/。C02-濕潤的培養(yǎng)箱中溫育24hrs。將平板離心后，收集上層清液，并且按照制造者說明書，通過ELISA(BD,SanDiego,CA，CatNo2627KI)檢測IL-2(圖4)。為了計算IC50(阻滯OX40L-刺激的PBL的IL-2釋放的50%的Mab濃度)，將在對照培養(yǎng)物(PBL+PHA+K562WT)中產(chǎn)生的背景IL-2濃度從由K562xOX40L+細胞刺激的PBL產(chǎn)生的總IL-2中減去(圖5)。IC5。TAG34:0.07jiM;LC.001:2nM;LC005:10nM。IC50值在2-10nM范圍。實施例17破傷風檢測('TT-檢測，)檢測抗體對由破傷風毒素刺激的外周血淋巴細胞的抑制作用通過FicollHypaque將外周血單核細胞(PBMC)從肝素化的血液中分離。在大多數(shù)情形中，將新鮮分離的PBMC用于這一檢測。在一些情形中，也使用冷藏的PBMC。用于這一檢測的培養(yǎng)基是含有10X人男性AB血清(Sigma-Aldrich);2mM谷氨酰胺和Pen/Strep(抗生素青霉素和鏈霉素的現(xiàn)成可用的混合物(RocheDiagnosticsGmbHDE);以20ml重建的冷凍干燥物；每1000ml培養(yǎng)基用2ml)的RPMI。為了附著到塑料上，將每孔300.000PBMC在96孔平底平板上預培養(yǎng)過夜。第二天，將破傷風毒素(TT)(ChironBehring)加入到孔中，終濃度2-5叫/ml。陽性對照孔(最大增殖/刺激)只含有TT，抗體(如純化的IgG)加入所有其它的孔中，終濃度10pg/ml。小鼠MabTAG-34包含在檢測中(終濃度10嗎/ml)。使用單獨的非剌激性背景對照培養(yǎng)基。所有的檢測進行一式三份。繼續(xù)培養(yǎng)(37。C，5%C02，95%濕度)6天后，加入311-胸苷，終濃度為lpCurie/ml，并且在額外的16h培養(yǎng)期間后，收集平板并且在(3-計數(shù)器中確定結(jié)合的3H-胸苷(圖6)。55實施例18OX40L抗體與小鼠OX40L的交叉反應(yīng)性為了確定本發(fā)明的抗體與小鼠OX40L的交叉反應(yīng)能力，將連續(xù)稀釋的抗體和對照抗體與穩(wěn)定表達mOX40L的K562-mOX40L細胞一起溫育。還評估了與K562WT細胞和穩(wěn)定表達hOX40L的K562-hOX40L細胞的結(jié)合。針對匙孔血藍蛋白(a-KLH)的HuMab抗體用作陰性對照。包含抗體RM134L，大鼠抗-mOX40L(eBioscience，SanDiego,CA)作為mOX40L表達的陽性對照。包含抗體TAG-34,小鼠抗-mOX40L(MBL,Nagoya,Japan)作為hOX40L表達的陽性對照。為了檢測結(jié)合的人抗體，使用熒光素(FITC)-綴合的山羊抗-人IgG抗體。為了檢測結(jié)合的RM134L，將生物素化的兔抗-大鼠IgG抗體(DAKO,Glostrup,Denmark)與用藻紅蛋白(PE)(DAKCO綴合的鏈霉抗生物素蛋白組合應(yīng)用。為了檢測結(jié)合的TAG-34，使用FITC-綴合的兔抗-小鼠IgG抗體。使用GraphpadPrism軟件用非線性回歸(具有可變斜率的S型劑量-反應(yīng))確定關(guān)于在20pg/ml檢測的HuMabs的EC50值或最大結(jié)合(Bmax)的計算。結(jié)果按照本發(fā)明的LC.001能夠結(jié)合hOX40L，這由5.16±2.93嗎/ml的EC50值和385.22的Bmax(MFI)值表明，但不結(jié)合mOX40L或WT細胞，這分別由11.41和9.67的Bmax(MFI)值表明。此外，按照本發(fā)明的LC.001(IgG4)也能夠有效地結(jié)合hOX40L，這由8.19±1.05jng/ml的EC50值和3U.30的Bmax(MFI)值表明，但是不結(jié)合mOX40L或WT細胞，這分別由13.47和9.58的Bmax(MFI)值表明。如預計的那樣，陰性對照(x-KLH不與任何細胞結(jié)合(圖7)。因此，與人OX40L相比，按照本發(fā)明的OX40L抗體表現(xiàn)出至少30倍更低的與小鼠OX40L的結(jié)合。實施例19OX40LHuMabs激活補體系統(tǒng)的潛力Clq和C3c結(jié)合ELISA為了確定本發(fā)明的抗體誘導Clq結(jié)合和C3活化的能力，將ELISA平板用連續(xù)稀釋的抗體和對照抗體包被。非常弱地結(jié)合Clq的人IgG4(TheBindingSite,Birmingham,England)用作陰性對照。包含人IgGl(TheBindingSite)和a-KLH(IgGl)作為陽性對照。隨后，將包被的抗體與重組的Clq或作為C3來源的收集的人血清一起溫育。為了檢測結(jié)合的Clq，應(yīng)用與綴合了辣根過氧化物酶(HRP)(DAKO)的豬抗-兔IgG抗體組合的針對Clq的兔抗體(DAKO)。為了檢測活化的C3c(通過C3活化產(chǎn)生)，應(yīng)用與綴合了HRP(JacksonImmunoResearchLaboratories,WestGrove,PA)的兔抗-小鼠IgG抗體組合的小鼠抗-人C3c抗體(DAKO)。為了評估包被效率的不同，將包被的抗體用與HRP綴合的山羊抗-人IgG抗體顯現(xiàn)。使用GraphpadPrism軟件用非線性回歸(具有可變斜率的S型劑量-反應(yīng))確定關(guān)于在10ng/ml檢測的HuMabs的EC50值或最大結(jié)合(Bmax)的計算。結(jié)果按照本發(fā)明的LC.001能夠有效地結(jié)合Clq，這由2.19±0.42jxg/ml的EC50值和3.089的Bmax(OD405)值表明。此外，陽性對照人IgGl和抗-KLH都能夠有效地結(jié)合Clq，這由分別為4.17±1.08pg/ml和2.57±1.51jag/ml的EC50值以及分別為2.685和3.306的Bmax(OD405)值表明。如預計的那樣，陰性對照人IgG4不結(jié)合Clq，這由0.353的OD405Bmax值表明。并且，按照本發(fā)明的LC.001IgG4x失去了結(jié)合Clq的能力，這由0.357的OD405Bmax值表明。在排列與Clq結(jié)合的能力時，C3c通過LC.001的沉積以依賴于抗體濃度的方式發(fā)生，具有2.67士0.16叱/ml的EC50值和2.614的Bmax(OD405)值。此外，陽性對照人IgGl和抗-KLH都能有效地沉積C3c，這由分別為為5.45±0.36嗎/ml禾卩2.16±0.26pg/ml的EC50值以及分別為2.543和2.633的Bmax(OD405)值表明。如預計的那樣，陰性對照人IgG4不沉積C3c，這由0.095的OD405Bmax值表明。并且，按照本發(fā)明的LC.001IgG4x失去了沉積C3c的能力，這由O.O卯的OD405Bmax值表明(圖8和9)。實施例20OX40LHuMabs結(jié)合Fcy受體I、IIa和lib的潛力IgG-誘導的依賴于抗體的細胞的細胞毒性(ADCC)受到效應(yīng)細胞上的FcY受體(FqR)的調(diào)控。為了確定本發(fā)明的抗體結(jié)合FcYRs的能力，將穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染了人FcyRI、Fc7RIIa、FcyRIIb的IIA1.6細胞(來源于IIA1細胞的限制性稀釋；Jones,B.,等.，J.Immunol.136(1986)348-356)和野生型細胞用連續(xù)稀釋的抗體和對照抗體溫育。不結(jié)合FcyRI的人IgG2(TheBindingSiteLtd.,UK)和不結(jié)合FcyRII的人IgG4(TheBindingSite)用作陰性對照。包括用于FcyRI結(jié)合的人IgGl(TheBindingSite)和用于FcyRII結(jié)合的人IgG3(TheBindingSite)作為陽性對照。應(yīng)用與藻紅蛋白(PE)綴合的針對人IgG的抗體，通過FACS檢測結(jié)合的抗體。使用GraphpadPrism軟件用非線性回歸曲線適配(可變斜率)確定關(guān)于在10jug/ml撿測的HuMabs的EC50值或最大結(jié)合(Bmax)的計算。LC.001能夠有效地結(jié)合FcyRI(與對照IgGl抗體相當)，這由0.11±0.03嗎/ml的EC50值和8041.54的Bmax(MFI)值表明，但是不結(jié)合Fc丫RIIa和FcYRIIb，這由分別為25,06和21,18的Bmax(MFI)值表明。與LC.001相比，LC.001IgG4x較不有效地結(jié)合FcyRI，并且與對照IgG4抗體相當，具有0.86士0,12ng/ml的EC50值和6030.07的Bmax(MFI)值。沒有觀察到LC.001IgG4x與FcyRIIa和Fc^RIIb的結(jié)合(Bmax(MFI)值分別為21.40和19.27)，而對照IgG3抗體能夠與之結(jié)合(Bmax(MFI)值分別為536.65和418.59)(圖IO)。因此，與抗體LC.001的EC50值相比較，對于LC麓IgG4x結(jié)合FcyRI的EC50值是8倍。實施例21OX40LHuMabs與NK細胞上的FcyRIIIa結(jié)合的潛力為了確定本發(fā)明的抗體與天然殺傷(NK)細胞上的FcyRIIIa(CD16)結(jié)合的能力，將外周血單核細胞(PBMCs)分離，并且，在存在或不存在20嗎/ml針對FcryRIIIa的封閉小鼠抗體(抗-CD16,克隆3G8,RDI,Flanders,NJ)時，與20嗎/mlHuMab抗體和對照抗體一起溫育，以證實通過FcyRIIIa的結(jié)合。應(yīng)用不與FcyRIIIa結(jié)合的人IgG2和IgG4(TheBindingSite)作為58陰性對照。包含人IgGl和IgG3(TheBindingSite)作為對于FcyRIIIa結(jié)合的陽性對照。應(yīng)用與FITC-標記的山羊F(ab)2抗-人IgG(Fc)抗體(Protosimmunoresearch,Burlingame,CA)組合的PE-標記的小鼠抗-人CD56(NK-纟田胞表面牛示i己)抗體(BDBiosciencesPharmingen,SanDiego，CA)，通過FACS分析而檢測在NK細胞上結(jié)合的抗體。確定了20pg/ml檢測的HuMab的最大結(jié)合(Bmax)。LC.001能夠有效地結(jié)合FcYRIIIa(與對照IgGl抗體相當)，這由641.37的Bmax(MFI)值表明。加入針對FcyRnia的封閉抗體消除了LC.001與NK細胞的結(jié)合(與145.38的背景染色相比，Bmax(MFI)值為194.61)。LC.001IgG4x不結(jié)合FcyRIIIa,并且表現(xiàn)相當于對照IgG4抗體，具有170.52的Bmax(MFI)值，這導致大約僅為LC.001Bmax的10%的LC.001IgG4x的Bmax。加入針對FcyRIIIa的封閉抗體對LC.001IgG4x結(jié)合沒有影卩向(Bmax(MFI)值174,26)(圖ll)。實施例22hMab—hOX40L和MabTAG-34與HUVEC(初級人臍靜脈內(nèi)皮細胞/幼細胞)結(jié)合的作用描述內(nèi)皮細胞表達hOX40L(Kotani，A.，等.，Immunol.Lett.84(2002)1-7)。人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)天然表達hOX40L，并且因此可以用作"內(nèi)皮細胞模型"。這一檢測的目的是確定在與抗體TAG-34和LC.001結(jié)合后HUVEC細胞上的hOX40L的命運。將HUVEC解凍，并且在T175-燒瓶(Sarstedt)中在ECG-M培養(yǎng)基十2。/。FCS中擴展4天。將細胞接種在24孔平板中(10.000個細胞/L)。3天后，將培養(yǎng)基換成ECG-M+0.5%FCS。加入10嗎/ml的抗體(<KLH>(針對匙孔血藍蛋白的抗體),TAG-34或LC.001，用于誘導下調(diào))，并且溫育2,5h或24h。用TAG-34或LC.001將HUVEC細胞重新染色。用每種為10pg/ml的Alexa488標記的針對小鼠IgG(=<111>)或者Alexa488標記的針對人IgG(=〈h"的二級抗體進行FACS-染色。FACS-測定在FACS-掃描儀(BectonDickinson)中進行，并且計算平均熒光密度(MFI)。〈KLf^抗體用作非特異性的陰性對照。表7表明，加入LC.001在2，5或24h后都沒有導致OX40L在HUVEC細胞上表達的下調(diào)(將第4行與第5和6行比較)。然而，加入TAG34在2,5h后和在24h后都表現(xiàn)出對在HUVEC細胞上hOX40L的強(約3倍)下調(diào)(將第IO行與第11和12行比較)。濃度為10pg/ml的按照本發(fā)明的抗體沒能誘導OX40L在HUVEC細胞上表達的下調(diào)。表7用于下調(diào)的Mab用于染色的Mab用于FACS的二級MabMFI2.5h24hl.培養(yǎng)基對照一<h>5.175.392.培養(yǎng)基對照LC連<h>28.5224.993.<KLH>—<h>4.764.744.<KLH>LC.001<h>31.4423.075丄C週一<h>36.5230.786.LC扁LC.001<h>38.5838.697.培養(yǎng)基-對照—<m>3,663.188.培養(yǎng)基-對照TAG-34<m>31.8125.329.<KLH>-<m>3,683.4310.<KLH>TAG-34<m>30.7931.58ll.TAG-34一<m〉9.447.3912.TAG34TAG-34<m>8.9714.89實施例23TAG34,LC.001和LC.005的蛋白質(zhì)印跡分析制備40和100nghOx40L-His(R&D系統(tǒng)，具有28-34kDa的理論大小)和分子量標記MagikMarkXP(Invitrogen;20，30，40,50,60，80,100，120,220kDa)用于凝膠-電泳。因此，將xpl蛋白質(zhì)，2.5plNuPageLDS(十二垸基硫酸鋰鹽)樣品緩沖液(4X),1)ilNuPage還原劑(10X)，和H20加10^混合在一起，并且在70。C變性10min。此后，將樣品上樣到NuPage凝膠上(Novex;10%Bis-Tris)，并且在150V1XMOPS電泳緩沖液(Novex)中電泳1h。在半干室中，使用lxNuPage轉(zhuǎn)移緩沖液(lX緩沖液，O.P/。抗氧化劑，10%甲醇)持續(xù)1h/50mA，將所述凝膠通過半干印跡(Semi-Dry-Blot)印跡到PVDF膜上(Millipore;通過在甲醇中溫育5min并且在1X轉(zhuǎn)移緩沖液中溫育10min而將膜活化)。在RT下?lián)u動lh，將膜在lxPBS/5。/。牛奶/0,5%吐溫中封閉。將一級抗體(pAB)在lxPBS/l。/。牛奶/0.5。/。吐溫中稀釋，加入并且在4。C溫育過夜。LC.001:1.9pl(1.6pg)，在4ml的總體積中LC,005:1.1pl(1.6|Lig)/4mlTAG34:1.6jil(1.6)ig)/4ml將膜在1XPBS/0.5。/。吐溫中洗滌3X。將二級抗體(sAB)在1XPBS/1%牛奶/0.5%吐溫中稀釋，加入并且在RT溫育1.5h。對于LC.OOl和LC.005，將1:10000稀釋的針對人IgG的多克隆抗體(Pierce)用作sAB;對于TAG34，將1:400稀釋的來自Lumi-Light蛋白質(zhì)印跡試劑盒(Roche)的針對小鼠IgG的多克隆抗體用作sAB。將膜用lxPBS/0.5%吐溫洗滌2X持續(xù)30min。按照制造者的用法說明使用Lumi-Light蛋白質(zhì)印跡試劑盒(Roche)用于檢測。蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果在圖12中顯示。LC.001能夠檢測(十二烷基硫酸)變性的OX40L，而LC.005和TAG34不能結(jié)合變性的OX40L。參考文獻列表Atiba,H.,etal.'Biochem.Biophys.Res.Conmmn,251(1998)131-136Alciba,H.，etal.，J.Exp.Med.191(2000)375-380Angal,S,,etal.,Mol.Immimol.30(1993)105-108Aplin,J.D"andWriston,J.C.丁r.，CRCCrit.Rev.Biochem,10(1981)259-306Arestides,R.S.,etal.，Eur.JfImmunol.32.(2002)2874-2880Armour,K丄.，etaLEur.J.Immunol.29(1999)2613—2624Ausubel;R,etal.,ed.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingandWileyInterscience,NewYork(1987)Barnes,L.M.,etal.,Biotech.Bioeng.73(2001)261-270Barnes,L.M.,etal.,Cytotechnology32(2000)109-123Baum,P.R,，etah,EMBOJ.13(1994)3992-4001Bkzar,B.R.，etal.,B〗ood101(2003)3741-3748Boerner,P.,etal"J.Immunol.147(1991)86-95Bruggemann,M.，etal.,YearImmunol.7(1993)33-40Bmnhouse,R.,andCebra,J.J.,Mol.Immunol.16(1979)907-917Burgess>J.K.,etal.,J.AllergyClin.Immunol.113(2004)683-689Burton,D.R.,etal.，Nature288(1980)338-344Burton,D.R.,Mol.Immunol.22(1985)161-206Capel,PJ.,etal.,Immunomethods4(1994)25-34Carter,P.，etal.,Proc.Natl,Acad.Sci.USA89(1992)4285-4289Chen,J.,etaL，EMBOJ.12(1993〉821-830Chen,J,>etal.,Int.Immunol.5(1993)647-656Choi,T.K.,etal.,Nat.Genet.4(1993)117-123Coleetal.，MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss，p.77(1985)deHaas,M.,etal.,J.Lab.Clin.Med.126(1995)330-341Duncan,A.R.，andWinter,G.，Nature332(1988)738-740Durocher>Y.,etal"Nucl.Acids.Res.30(2002)E9Edelman，G.M.,etal.,Proc.Natl,Acad.Sd.USA63(1969)78-85Edge,A.S.,etal.,Anal.Biochem.118(19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oGlyLysGlyLei:GluTrpVal354045SerlielieSerGlySerGlyGlyPheThrTyrTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrlieSerArgAspAsnSerArgThrThrLeuTyr65707580LeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysAspArgLeuValAlaProGlyThrPheAspTyrTrpGlyGin100105110GlyAlaLeuValThrValSerSer115120<210>3<211>107<212>PRT<213>人工的<223>輕鏈，LC.005的可變區(qū)<,>3Glu工leVaLLeuThrGinSerProGlyThrLeuSerLeuSerProGly151015勺白oT工2oc一」p人GluArgAlaThrLeuSerCysArgAlaSerGinSerValSerSerAsn202530TyrLeuAlaTrpTyrGinGinLysProGlyGinAlaProArgLeuLeu354045lieTyrGlyAlaSerSerArgMaThrGlylieProAspArgPheSer505560GlySerGJLySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerArgLeuGlu65707580ProGluAspPheAlaValTyrTyrCysGinGinTyrGlySerSerPhe859095ThrPheGlyProGlyThrLysValAsplieL>ys100105<210>4<211>120<212>PRT<213>人工的<220><223>重鏈，LC.005的可變區(qū)GinValGinLeuVal5GluSerGlyGlyGlyValValGinProGlyArg1015Ser!>euArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerAsnPhe202530GlyMetHisTrpVaLArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGJLuTrpVal354045AlaAlalieTrpTyrAspGlyHisAspLy3TyrTyrSerTyrTyr.Val505560LysGlyArgPheThrlieSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuPhe65707580LeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaVal"TyrTyrCys859095AlaArgAspSerSerSerTrpTyrArgTyrPheAspTyj:TrpGlyGin100105110GlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>5<211>107<212>PRT<213>人工的<220><223>輕鏈，LC.010的可變區(qū)<400>5GlulieValLeuThrGinSerPro15GluArgAlaThrLeuSerCysArg20TyrlieuAlaTrpTyrGinGinLys3540lieTyrGlyAlaSer50GlySerGlySerGlyThrAspPhe6570GlyThrLeuSerLeuSerProGly1015AlaSerGinSerVaiSerSerSer2530ProGlyGinAlaProArgLeuLeu45ThrLeuThrlieSerArgLeuGlu7580SerArgAlaThrGlylieProAspArgPheSer5560ProGluAspPheAlaValTyrTyrCysGinGinTyrGlySerSerPhe859095ThrPheGlyProGlyThrLysValAsplielys100105<210>6<211>120<212>PRT<213>人工的<220><223>重鏈，LC.010的可變區(qū)69<400〉6GinValGinLeuValGluSerGlyGlyGlyVal10ValGinProGlyArg15SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerAsnPhe202530■GlyMetHisTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045AlaAlalieTrpTyrAspGlyHisAspLys.TyrTyrAlaTyrTyrVal505560LysGlyArgPheThrlieSerArgAspAsnSerLys657075AsnThrLeuPhe80LeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaArgAspSerSerSerTrpTyrArgTyrPheAspTyrTrpGlyGin100105GlyThrLeuValThrValSerSer115120110<210><211><212〉<213><220><223>58PRT人工的輕鏈，LC.029的可變區(qū)<4.O0>7MetLieuHisProLeuCysLysValGlySerHisGinGlySerValAla51015ValAspLeuGlyGinlieSerLeuSerProSerAlaAlaCysSerLeu202530LyslieLeuGLnLeulieThrValAsnSerlielieValSerLeuThr354045PheGlyGlyGlyThrLysValGlu工lelys5055<210><211><212><213><220><223><400>8120PRT人工的重鏈，LG.029的可變區(qū)8GinValGinLeuValGluSerGlyGlyGly.ValValGinProGlyArg1510'15SerLeuflxgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerAsnPhe202530GlyMetHisTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045AlaAlalieTrpTyrAspGlyHisAspLysTyrTyrSerTyrTyrVal505560LysGlyArgPheThrlieSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuPhe65707580LeuGinMetAsnSerLeuArgMaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859035AlaArgAspSerSerSerTrpTyrArgTyrPheAspTyrTrpGlyGin100105110GlyThrLeuValThrVaiSerSer115120<210>9<211>57<212>PRO"<213>人工的<220><223>輕鏈，LC.019的可變區(qū)<備>9MetProProValTrpLysValGlySerHisGinGlySerAlaAlaVal1015AspLeuGlyGinlieSerLeuSerProSerAlaAlaCysSerLeuLys202530lieLeuGinLeulieThrValAsnSerLeulieValThrLeuThrPhe3540GlyGlyGlyThrLysValGlulieLys455055<210><211><212><213><220><223><權(quán)>10116PRT人工的重鏈，LG.019的可變區(qū)10GinValGinLeuValGluSerGlyGlyGlyV&lValGinProGlyArg1015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyr202530ThrMetHisTrpValArgGinMaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045AlaVallieTrpTyrAspGlySerAsn!LysTyrTyrValAspSerVal505560LysGlyArgPheThrlieSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuTyr65707580LeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys85909572AlaArgLysAsnTrpSerPheAspPheTrpGlyGinGlyThrLeuVal100105110ThrValSerSer115<210><211><212><213><220><223><400>11106PRT人工的輕鏈，LG.033的可變區(qū)(a)11GlulieValLeuThrGinSerProAlaThrLeuSerLeuSerProGly151015GluArgAlaThrLeuSerCysArgAlaSerGinGlyValSerArgTyr202530LeuAlaTrpTyrGinGinLysProGlyGinAlaProArgLeuLeulie354045TyrAspAlaSerAsnArgAlaThrGlylieProAlaArgValSerGly505560.SerGlyProGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSerLeuGluPro657075B0GluAspPheAlaValAspTyrCysGinGinArgSerAsnTrpGinTyr859095ThrPheGlyGinGlyThrLysLeuGlulie100105<210>12<211>121<212>PRT<213>人工的<220><223>重鏈，LG.033的可變區(qū)<400>12GinLysGinIeuValGluPheGlyGlyGlyValValGinProGlyArg1510.15SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSer.GlyPheThrPheSerAsnTyr202530GlyMetHisTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045AlaVallieTrpAsnAspGlySerAsnLysTyrTyrValAspSer"Val5055LysGlyArgPhelielieSerArgAspAsnSerLys'AsnThrLeuTyr65707580LeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaArgAspArgMetGlylieTyrTyrTyrGlyMetAspValTrpGly100105110GinGlyThrThrValThrValSerSer115120<210><211><212><213><223>13107PRT人工的輕鏈，恒定區(qū)"00>13ArgThrValAlaAlaProSerValPheliePhe510ProProSerAspGlu15GinLeuLysSerGlyThrAlaSejrValVaJLCysLeuLeuAsnAsnPhe202530TyrProArgGluAlaLysValGinTrpLysValAspAsnAlaLeuGin354045SerGlyAsnSerGinGluSerValThrGluGinAspSerLysAspSer50556074ThrTyrSerLeuSerSerThrLeuThrLeuSerLysAlaAspTyr:Glu65707580LysMsLysValTyrAlaCysGluValThrHisGinGlyLeuSerSer859095ProValThrLysSerPheAsnArgGlyGluCys100105<210><211><212><213><220><223><400>14330PRT人工的重鏈，恒定區(qū)(Y1)14AlaSerThrLysGlyProSerValPheProLeuAlaProSerSerLys151015SerThrSerGlyGlyThrAlaAlaLeuGlyCysLeuValLysAspTyr202530PheProGluProValThrValSerTrpAsnSerGlyAlaLeuThrSer354045GlyValHisThrPheProAlaValLeuGinSerSerGlyLeuTyrSer505560LeuSerSerValValThrValProSerSerSerJjeuGlyThrGinThr65707580TyxlieCysAsnValAsnHisLysProSerAsnThrI<ysValAspl>ys859095LysValGluProLysSerCysAspLysThrHisThrCysProProCys.100105110ProAlaProGiuLeuLeuGlyGlyProSerValPheLeuPheProPro115120125LysProLysAspThurLeuMetlieSerArgThrProGluValThrCys130135140ValValValAspValSerHisGluAspProGluValLysPheAsnTrp145150155160TyrValAspGlyValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGlu16517D175GluGinTyrAsnSerThrTyrArgValValSerValLeuThrValLeu1B01B5190HisGinAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsn195200205LysAlaLeuProAlaProlieGluLysThrlieSerLysMaLysGly210215220GinProArgGluProGinValTyrThrLeuProProSerArgAspGlu225230235240LeuThrLysAsnGinValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPheTyr2250255ProSerAsplieAlaValGluTrpGluSerAsnGlyGinProGluAsn2602652，0AsnTyrLysThrThrProProValLeuAspSerAspGlySerPhePhe275280285Leu丁yrSerLysLeviThrValAspLysSerArgTrpGinGinGlyAsn290295300ValPheSerCysSerValMetHisGluMaLeuHisAsnHisTyrThi305310315320GinLysSerLeuSerLeuSerProGlyLys325330<210>15<211>327<212>PRT<213>人工的76<220><223>重鏈，恒定區(qū)(y4)<400>15AlaSerTh.rLysGlyProSerValPheProLeuAlaProCysSerArg15ID15SerThrSerGluSerThrAlaAlaLeuGlyCysLeuValLysAspTyr202530PheProGluProValThrValSerTrpAsnSerGlyAlaLeuThrSer354045GlyValHisThrPheProAlaValLeuGinSerSerGlyLeuTyrSer505560LeuSer5erValValThrValProSerSerSerLeuGlyThrLysThr65707580TyrThrCysAsnValAspHisLysProSerAsnThrLysValAspLys859095ArgValGluSerLysTyxGlyProProCysProSerCysProAlaPro100105110GluPheLeuGlyGlyProSerValPheLeuPheProProLysProLys115120125AspThrLeuMetlieSerArgThrProGluValThrCysValValVal130135140AspValSerGinGluAspProGluValGinPheAsnTrpTyrValAsp14515015516DGlyValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGluGluGinPhe165170175AsnSerThrTyrArgValValSerValLeuThrValLeuHisGinAsp180185190TrpLeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsnLysGlyLeti195200205ProSerSerlieGluLysThrlieSerLysAlaLysGlyGinProArg210215220GluProGinValTyrThrLeuProProSerGinGluGluMetThrLys225230235240AsnGinValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPheTyrProSerAsp245250255IeAlaValGluTrpGluSerAsnGlyGinProGluAsnAsnTyrLys260265270ThrThrProProValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyrSer275280285ArgLeuThrValAspLysSerArgTrpGinGluGlyAsnValPheSer290295300CysSerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGinLysSer305310315320LeuSerLeuSerLeuGlyLys325<210>16<211>104<212>PRT<213>人工的<220><223>輕鏈，LC.033的可變區(qū)(b)<備>16GlulieValLeuThrGinSerProAlaThrLeuSerLeuSerProGly51015GluArgAlaThrLeuSerCysArgAlaSerGinSerValSerSerTyr202530LeuAlaTrpTyrGinGinLysProGlyGinAlaProArgLeuLeulie354045TyrAspAlaSerAsnArgAlaThrGlylieProAlaArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSerLeuGluPro65707580GluAspPheAlaValTyrTyrCysGinGinArgSerAsnTrpThrPhe85GlyGinGlyThr!LysValGlulie1009095<210><211><212><213>17120PRT人土的<220><223>重鏈，LC.059的可變區(qū)<400>17GluValGinLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGinProGlyGly151015SerLeuArg!LeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyr202530AlaMetAsnTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045SerlielieSerGlySerGlyGlyPheThrTyrTyrAlaAspSerVsl505560LysGlyArgPheThrlieSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuTyr65707580LeuGinMetAsnArgLeuArgAlaGluAspThrAlalieTyrPheCys859095AlaLysAspAsplieProAlaAlaGlyThrPheAspProTrpGlyGin10010511079GlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>18<211>106<212>PRT<213>人工的<220><223〉輕鏈，LG.060的可變區(qū)<400>18AlalieGinLeuThrGln..SerProSerSerLeuSerAlaSerValGly151015AspArgVal'ThrlieThrCysArgAlaSerGinGlylieSerSerAla202530LeuAlaTr:pTyrGinGinLysProGlyLysAlaProLysLeu1/eu工le354045TyrAspValSerSerLeuGluSerGlyValProSerArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSerLeuGinPro65707580GluAspPheAlaThrTyrTyrCysGinGinPheAsnSerTyrTrpThr859095PheGlyGinGlyThrLysValGlulieLys100105<210><211><212><213><220><223>重鏈，LC.060的可變區(qū)<麵>19GluValGinLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGinProGlyGly151015勺白T工p人SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyr202530AlaMetSerTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045SerLeulieSerGlySerGlyGlyLeuThrLysTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrlieSerArgAspAsnSerLysArgThrLeuTyr65707580LeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysAsplieLeuValThrGlyAlaLeuAspTyrTrpGlyGinGly100105110ThrLeuValThrValSerSer115<210>20<211>120<212>PRT<213>人工的<220><223>重鏈，LG.063的可變區(qū)<400>20GluValGinLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGinProGlyGly510■15SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyr202530AlaMetAsnTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045SerlielieSerGlySerGlyGlyPheThrTyrTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrlieSerArgAspAsnSerLysLysThrLeuTyr6570758081LeuGinMetSerArgLeuArgAlaGluAspThrAla工leTyrPheCys859095Ala.LysAspAsplieProAlaAlaGlyThrPheAspProTrpGlyGin100105110GlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>21<211>5<212>PRT<213>人工的<220><223>GDR/抗體片段<C>21SerTy;cThrMetHis15<210>22<211>5<C212>PRT<213>人工的<220><223>CDR/抗體片段<400>22Sex:TyrAlaMetSer<210><211><212><213><220><223>CDR/抗體片段<,>23AsnPheGlyMetHis15勺白p人82<211>5<212>PRT<213>人工的<220><223>GDR/抗體片段<400>24AsnTyrQlyMetHis<210>25<211>5<212>PRT<213>人工的<220><223>GDR/抗體片段<400>25SerTyrAlaMetAsn15<210>26<211>17<212>PRT<213>人工的<220><223>CDR/抗體片段<400>26lielieSerGlySerGlyGlyPhsThrTyrTyrAlaAspSerValLys151015Gly<210>27<21]>17<212>PRT<213>人工的<220><223>CDR/抗體片段<400>27AlalieTrpTyrAspGlyHisAspLysTyrTyrSerTyrTyrValLys151015Gly<210>28<211>17<212>PRT<213>人工的<220><223>GDR/抗體片段<糊>28AlalieTrpTyrAspGlyHisAspLysTyrTyrAlaTyxTyrValLys151015Gly<210>29<211>17<212>PRT<213>人工的<220><223>CDR/抗體片段<碼>29VallieTrpTyrAspGlySerAsnLysTyrTyrValAspSerValLys1.51015Gly<210>30<211>17<T212:>PRT<213>人工的<220><223>GDR/抗體片段<400>30VallieTrpAsnAspGlySerAsnLysTyrTyrValAspSerValLys151015Gly<210〉31<211>18<212>PRT<213>人工的<220><223〉CDR/抗體片段<鋼>31lielieSerGlySerGlyGlyPheThr"TyrTyrAlaAspSerValLys151015GlyArg<210>32<211>18<212>PRT<213>人工的<220><223>CDR/抗體片段<400>32LeulieSerGlySerGlyGJLyLeuThrLysTyrAlaAspSerValLys151015GlyArg<210>33<211>11<212>PRT<213>人工的<220><223>CDR/抗體片段<■>33AspSerSerSerTrpTyrArgTyrPheAspTyr151085<210><211><212><213>3411PRT人工的<220><223〉GDR/抗體片段<禱>3")AspArgLeuValAlaProGlyThrPheAspTyi1510<210><211><212><213><220><223><秦>GDR/抗體片段35LysAsnTrpSerPheAspPhe<210><211><212><213><220><223><400>3512PRT人工的CDR/抗體片段36AspArgMetGlylieTyrTyrTyrGlyMetAspVal1510<210><211><212><213>3712PRT人工的<220><223>CDR/抗體片段<:400>37LysAspAsplieProAlaAlaGlyThrPheAspPro1510勺白p-人<210>38<211>11<212>PRT<213>人工的《220><223>GDR/抗體片段<糊>3BLysAsplieLeuValThrGlyAlaLeuAspTyr15-10<210>39<211>11<212>PRT<213>入工白勺<220〉<223>GDR/抗體片段<400>39ArgAlaSerGinGlylieSerSerTrpLeuAla1510<210><211><213>4012PRT人工的<220><223>CDR/抗體片段<400>40ArgAlaSerGinSerValSerSerSerTyrLeuAla1510<210>"<211>12<212>PRT<213>人工的<220><223>CDR/抗體片段《400>41ArgAlaSerGinSerValSerSerAsnTyrLeuAla151087<210>42<2U>11<212>EOT<213>人工的<220><223>CDR/抗體片段<柳>42ArgAlaSerGinGlyValSerArgTyrLeuMa1510<210>43<211>11<212>PRT<213>人工的<220><223>CDR/抗體片段<400>43ArgAlaSerGinSerValSerSerTyrLeuAla1510<210>"<211>24<212>PRT'<213>人工的<220><223>CDR/抗體片段<400>44LeuSerAlaSerValGlyAspArgValThrlieThrCysArgAlaSer151015GinGlylieSerSerAlaLeuAla20<210>45<211>7<212>PRT<213>人工的<220><223i>CDR/抗體片段<400>45GlyAlaSerSerArgAlaThr15<210>46<211>7<212>PRT<213>人工的<220><223>GDR/抗體片段<400>46MaAlaSerSerLeuGinSer<210><211><212><213><220><223>CDR/抗體片段<鄉(xiāng)>47MetProProValTrpLysVal15<210>43<211>7<212>PRT<213>人工的<:220><223>CDR/抗體片段<400>48AspAlaSerAsnArgAlaThr15<210>49<211>7<212>PRT<213>人工的<220><223>CDR/抗體片段<働>49勺白T工RJp人LeuHisProLeuCysLysVal<210>50<211>7<212>PRT<213>人工的<220><223>GDR/抗體片段<楊>50AspValSerSerLeuGluSer<210〉51<211>8<212>PRT<213>人工的<220><223〉GDR/抗體片段<■>51AsnSerLeulieValThrLeuThr15<21D>52<211>9<212>PRT<213>人工的<220><223>CDR/抗體片段<4O0>52GinGinTyrAsnSerTyrProTyrThr15<210>53<211〉8<212>PRT<213>人工的<220><223>CDR/抗體片段<400>5390GinGinTyxGlySerSerPheThr<210>54<211>9<212>PRT<213>人工的<220><:223>CDR/抗體片段<400>54GinGinArgSerAsnTrpGinTyrThr15<210>55<211>7<212>PRT<213>人工的<220><223>CDR/抗體片段<咖>55GinGinArgSerAsnTrpThr<210>56<211>8<212>PRT<213>人工的<220><223>GDR/抗體片段AsnSerlieneValSerLeuThr15<210>57<212>PRT<213>人工的<220><223>CDR/抗體片段91<柳>5"GinGinPheAsnSerTyrTrpThrPhe15<210><211><212><213><220><223><400〉58450PRT人工的LC.001的重鏈(人IgG1型)58GluValGinLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGinProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheAsnSerTyr202530AlaMetSerTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045SerlielieSerGlySerGlyGlyPheThrTyrTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrlieSerArgAspAsnSerArgThrThrLeuTyr65707580LeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys8590"95AlaLysAspArgLeuValAlaProGlyThrPheAspTyrTrpGlyGin100105110GlyAlaLeuValThrValSerSerAlaSerThrLysGlyProSerVal115120125PheProLeuAlaProSerSerLysSerThrSerGlyGlyThrAlaflla130135140LeuGlyCysLeuValLysAspTyrPheProGluProValThrValSer145150155160TrpAsnSerGlyAlaLeuThr'SerGlyValHisThrPheProAlaVal165170175lieuGli}SerSerGlyLeuTyrSerLeuSerSerValValThrValPro'180185190SerSerSerteuGlyThrGinThrTyxlieCysAsnV3lAsnHisLys195200205ProSerAsnThrLysValAspLysLysValGinProLysSerCysAsp210215220LysThrHisThrCysProProCysProAlaProGluleuIeuGlyGly225230235240ProSerValPheLeuPheProProLysProLysAspThrLeuMetlie245250255SerArgThrProGluValThrCysValValValMpValSerHisGlu260265270AspProGluValLysPheAsnTrpTyrValAspGlyValGluValHis275280285AsnAlaLysThrLysProArgGluGluGinTyrAsnSerThrTyrArg230295300ValValSerValLeuThrValLeuHisGinAspTrpLeuA白nGlyLys305310315320GluTyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeuProAlaProlieGlu325330335LysThrlieSerLysAlaLysGlyGinProArgGluProGinValTyr340345350ThrLeuProProSerArgAspGluLeuThrLysAsnGinValSerLeu355360365ThrCysLeuValLysGlyPheTyrProSerAsplieAlaValGluTrp37037538093GluSerAsnGlyGinProGluAsnAsnTyrLysThrThrProProVal385390395400LeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyrSerLysLeuThrValAsp405410415LysSerArgTrpGinGinGlyAsnValPheSerCysSerValMetHis420425430GluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGinLysSerLeuSerLeuSei:Pro435440445GlyLys450<210><211><212><213><220><223><400>GluVal59PRT人工的LC.001的重鏈(L234A,L235A人IgG1突變體)59GLnLeulieuGlu5SerGlyGlyGlyLeuValGinProGlyGly1015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheAsnSerTyr202530AlaMetSerTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyL>euGluTrpVal354045SerlielieSerGlySerGlyGlyPheThrTyrTyrMaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrlieSerArgAspAsnSerArgThrThrLeuTyr65707580LeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys85909594AlaLysAspArgLeuValAlaProGlyThrPheAspTyrTrpGly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oGinValTyr340345350ThrLeuProProSerArgAspGluLeuThrLysAsrGinValSerLeu355360365AsnAsnTyrLysThrThrProProVal385390,395400LeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyrSerLysLeuThrValAsp405410.415LysSerArgTrpGinGinGlyAsnValPheSerCysSerValMetHis42D425430GluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGinLysSerLeuSerLeuSerPro435440445GlyLys450<210><211><212><213><220><223>63450PRT人工的LC.005的重鏈(L234A,L235A人IgG1突變體)63GinValGinLeuValGluSerGlyGlyGlyValValGinProGlyArg1015SerLeuArgLe\JSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerAsnPhe202530GlyMetHisTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045AlaAlalieTipTyrAspGlyHisAspLysTyrTyrSerTyrTyrVal505560LysGlyArgPheThrlieSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuPhe65707580Leu.GinMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaArgAspSerSerSerTrpTyrArgTyrPheAspTyrTrpGlyGin100105110GlyThr!LeuValThrValSerSerAlaSerThrLysGlyProSerVal115120125PhsProLeuAlaProSerSerLysSerThrSerGlyGlyThrAla/Ua130135140LeuGlyCysLeuValLysAspTyrPheProGluProValThrValSer145150155160TrpAsriSerGlyAlaLeuThrSerGlyValHisThrPheProAlaVal165170175LeuGinSerSerGlyLeuTyrSerLeuSerSerValValThrValPro18018519DSerSerSerLeuGlyThrGinThrTyrlieCysAsnValAsnHisLys195200205ProSerAsnThrLysValAspLysLysValGluProLysSerCysAsp210215220LysThrHisThrCysProProCysProAlaProGluAlaAlaGlyGly225230235240ProSerValPhelieuPheProProLysProLysAspThrLeuMetlie245250255SerArgThrProGluValThrCysValValValAspValSerHisGlu260265270AspProGluValLysPheAsnTrpTyrValAspGlyValGluValHis2752B0285AsnPdaLysThrLysProAxgGluGluGinTyrAsnSerThrTyrArg290295300ValValSerValLeuThrValLeuMsGinAspTrpLeuAsnGlyLys30531D315320GluTyrLysCysLysVaLSerAsnLysAlaleuProAlaProlieGlu325330335103LysThrlieSerLysMaLysGlyGinProArgGluProGinValTyr340345350ThrLeuProProSerArgAspGluLeuThriysAsnGinValSerLeu355360365ThrCysLeuValLysGlyPheTyrPro'SerAsplieAlaValGluTrp370375380GluSerAsnGlyGinProGluAsnAsnTyrLysThrThrProProVal385390395■LeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyrSerLysLeuThrValAsp405410'415LysSerArgTrpGinGinGlyAsnValPheSerCysSerValMetHis420425430GluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGinLysSerLeuSerLeuSerPro435"0445GlyLys450<210>S4<211>447<212>PRT<213>人工的<220><223>LC.005的重鏈(S228P人IgG4突變體)<■>GinValGinLeuValGluSerGlyGlyGlyValValGinProGlyArg1015SerLeuArgLeuSerCysMaAlaSerGlyPheThrPheSerAsnPhe202530GlyMetHisTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045AlaAlalieTrpTyrAspGlyHisAspLysTyrTyrSerTyrTyrVal505560LysGlyArgPheThr工leSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuPhe65707580LeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaArgAspSerSerSerTrpTyrArgTyrPheAspTyrTrpGlyGin100105110GlyThrLeuValThrValSerSerAlaSerThrLysGlyProSerValU5120125PheProLeuAlaProCysSerArgSerThrSerGluSerThrAlaAla130135140LeuGlyCys"LeuValLysAspTyrPheProGluProValThrVaiSer"5150155160TrpAsnSerGlyAlaLeuThrSerGlyValHisThrPheProAlaVal1651，01*5LeuGinSerSerGlyLeuTyrSerleuSerSerValValThrVaJLPro180185190SerSerSerLeu.GlyThrLysThrTyrThrCysAsnValAspHisLys195200205ProSerAsnThrLysValAspLysArgValGluSerLysTyrGlyPro210215220ProCysProProCysProAlaProGluPheI^uGJLyGlyProSerVal225230235240PheLeuPheProProLysProLysAspThrLeuMetlieSerArgThr245250255ProGluValThrCysValValValAspValSerGinG3_uAspProGlu260265270105ValGinPheAsnTrpTyrValAspGlyValGluValHisAsnAlaLys2752802B5ThrLysProArgGluGluGinPheAsnSerThrTyrArgValVa丄Ser290295300ValIiSUThrValI^uHisGinAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLys305310315320CysLysValSerAsnLysGlyLeuProSerSerlieGluLysThrlie325330335SerLysAlaLysGlyGinProArgGluProGinValTyrThfrL>euPro340345350ProSerGinGluGluMetThrLysAsnGinValSerLeuThrCysLeu355360365ValLysGlyPheTyrProSerAsplieAlaValGJLuTrpGluSerAsn370375380GlyGinProGluAsnAsnTyrLysThrThrProProValLeuAspSer385390335■AspGlySerPhePheLeuTyrSerArgLeuThrValAspLysSerArg405410415TrpGinGluGlyAsnValPheSerCysSerValMetHisGluAlaLeu420425430HisMnHisTyrThrGinLysSerLeuSerLeuSerLeuGlyLys435"0"5<210>65<211>2"<212>PRT<213>人工的<220><223>LC.005的輕鏈<400>65106GlulieVaiLeuThrGinSerProGlyThrI^uSer!>euSeiProGly151015GluArgAlaThrLeuSerCysArgMaSerGinSerValSerSerAsn202530TyrLeuAlaTrpTyrGinGinLysProGlyGinAlaProArgLeuLeu354045工leTyrGlyAlaSerSerArgMaThrGlylieProAspArgPheSer505560GlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerArgLeuGlu65707580ProGluAspPheAlavalTyrTyrCysGinGinTyrGlySerSerPheB59095ThrPheGlyProGlyThrLysValAsplieLysArgThrValAlaAla100105110ProSerValPhe工lePheProProSerAspGluGinLeuLysSerGly115120125Thr1AlaSerValValCysLeuLeuAsnAsnPheTyrProArgGluAla130135140LysValGinTrpLysValAspAsnAlaLeuGinSerGlyAsnSei:Gin145150155160GluSerValThrGluGinAspSerLysAspSerThrTyrSerLeuSer165170175SerThrLeuThrLeuSerLysAlaAspTyrGlu!LysHisLysValTyr180185190AlaCysGluValThrHisGinGlyLeuSerSerproValThrLysSer195200205PheAsnArgGlyGluCys210<210><211><212><213><220><223><■>GluValGln66449PRT人工的LG.060的重鏈(人IgG1型)66LeuLe。GluSerGlyGlyGly510LeuValGinProGlyGly15SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyr202530AlaMetSerTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045SerI>eulieSerGlySerGlyGlyLeuThrLysTyrMaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrlieSerArgAspAsnSerLysArgThrLeuTyr65707580LeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys.859095AlaLysAsplieLeuValThrGlyAlaLeuAspTyrTrpGlyGinGly100105110ThrLeuValThrValSerSerAlaSerThrLysGlyProSerValPhe115120125ProLeuAlaProSerSerLysSerThrSerGlyGlyThrAlaMaLeu130135140GlyCysLeuValLysAspTyrPheProGluProValThrValSerTrp145150155160AsnSerGlyAlaLeuThrSerGlyValHisThrPheProAlaValLeu165170175108GinSerSerGlyLeuTyrSerLeuSerSerValValThrValProSer180185190SerSerLeuGlyThrGinThrTyrlieCysAsnValAsnHisLysPro195200205SerAsnThrLysValAspLysLysValGluProLysSerCysAspLys210215220ThrHisThrCysProProCysProAlaProGluI^uL>euGlyGlyPro225230235240SerValPheLeuPheProProLysProLysAspThrLeuMetTCleSer245250255ArgThrProGluValThrCysValValValAspValSerHisGluAsp260265270ProGluValLysPheAsnTrpTyrVaiAspGlyValGluValHisAsn275280285AlaLy^ThrLysProArgGluGluGinTyrAsnSerThrTyrArgVal290295300ValSerValLeuThrValLeuHisGinAspTrpLeuAsnGlyLysGlu305310315320TyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeuProAlaProlieGluLys325330335Thr工leSerLysAlaLysGlyGinProArgGluProGinValTyrThr340345350LeuProProSerArgAspGluLeuThrLysAsnGinValSerLeuThr355360365CysLeuValLysGlyPheTyrProSerAsplieAlaValGluTrpGlu370375380SerAsnGlyGinProGluAsnAsnTyrLysThrThrProProValLeu3B5390395400109AspSerAspG工ySerPhePheLeuTyrSerLysLeuThrValAspLys405410415SerArgTrpGinGinGlyAsnValPheSerCysSerValMetHisGlu420425430AlaLeuHisAsnHisTyrThrGin!LysSerLeuSerlieuSerProGly435440"5<210><211><212><213><c220><223><，>GluVslGin67449PRT人工的LC.060的重鏈(L234A,L235A人IgG1突變體)67LeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGinProGlyGly51015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyr2025'30AlaMetSerTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045SerLeulieSerGlySerGlyGlyLeuThrLysTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrlieSerArgAspAsnSerLysArgThrLeuTyr65707580LeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysAsplieLeuValThrGlyAlaLeuAspTyrTrpGlyGinGly100105110Thr乙euValThrValSerSerAlaSerThrLysGlyProSerValPhe115120125ProLeuAlaProSerSerLysSerThrSerGlyGlyThrAlaAlaLeu130135140GlyCysLeuValLysAspTyrPheProGluProValThrValSerTrp145150155160AsnSerGlyAlaLeuThrSerGlyValHisThrPheProAlaValLeu165170175GinSerSerGlyLeuTyrSerLeuSerSerVa丄ValThrValProSer1801B5190SerSerLeuGlyThrGinThrTyrlieCysAsnVaiAsnHisLysPro195200205SerAsnThrLysValAspLysLysValGluProLysSerCysAspLys210215220ThrHisThrCysProProCysProAlaProGluAlaAlaG工yGlyPro225230235240SerValPheLeuPheProProLysProLysAspThrLeuMetlieSer245250255ArgThrProGluValThrCysValValValAspValSerHisGluAsp260265270ProGluValLysPheAsnTrpTyrValAspGlyValGluValHisAsn275280285AlaLysThrLysProArgGluGluGinTyrAsnSerThrTyrArgVal290295300VaiSerValLeuThrValLeuHisGinAspTrpLeuAsnGlyLysGlu305310315320TyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeuProAlaProlieGluLys325330335ThrlieSerLysAlaLysGlyGinProArgGluProGinValTyrThr340345350;LeuProProSei:ArgAspGluLeuThrLysAsnGinValSerLeuThr3553S0365CysLeuValLysGlyPheTyrProSerAsplieAlaValGluTrpGlu370375380SerAsnGlyGinProGluAsnAsnTyrLysThrThrProProValLeu385390395400AspSerAspGlySerPhePheLeuTyrSerLysLeuThrValAspLys40540415SerArgTrpGinGinGlyAsnValPheSerCysSerVaJLMetHisGlu420425430AlaLeuHisAsnHisTyrThrrGinLysSerLeuSerLeuSerProGly435440445Ijys<210>68<211>446<212>PRT<2U>人工的<220><223>LC.060的重鏈(S228P人IgG4突變體)GluValGinLeu!>euGluSerGlyGlyGlyLeuValGinProGlyGly51015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyr202530AlaMetSerTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045SerLeu工leSerGlySerGlyGlyLeuThrLysTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrlieSerArgAspAsnSex:LysArgThrLeuTyr65707580LeuGinMetAsnSerLeuAxgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysAsplieLeuValThrGlyAlaLeuAspTyrTrpGlyGinGly100105110ThrLeuValThrValSerSerAlaSerThrLysGlyProSerValPhe115120125ProLeuAlaProCysSerArgSerThrSerGluSerThrAlaAlaLeu130135140GlyCysLeuValLysAspTyrPheProGluProValThrValSerTrp145150155160AsnSerGlyAlaLeuThrSerGlyValHisThrPheProAlaValLeu165170175GinSerSerGlyLeuTyrSerLeuSerSerValValThrValProSer180185190SerSerLeuGlyThrLysThrTyrThrCysAsnValAspHisLysPro195200205SerAsnThrLysValAspLysArgValGluSerLysTyrGlyProPro210215220CysProProCysProAlaProGluPheLeuGlyGlyProSe:cValPhe225230235240PheProProLysProLysAspThrLeuMetlieSerArgThrPro245250255GluValThrCysValValValAspValSerGinGluAspProGluVal260265270G工nPheAsnTrpTyrValAspGlyValGluValHisAsnAlaLysThr275280285LysProArgGluGluGinPheAsnSerThrTyrArgValValSerVal290295300LeuThrValLeuHisGinAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLysCys305310315320LysValSerAsnLysGlyLeuProSerSerlieGluLysThrlieSer325330335LysAlaLysGlyGinProArgGluProGinValTyrThrLeuProPro340345350SerGinGluGluMetThrLysAsnGinValSerLeuThrCysLeuVal355360365LysGlyPheTyrProSerAsplieAlaValGluTrpGluSerAsnGly370375380GinProGluAsnAsnTyrLysThrThrProProValLeuAspSerAsp385390395400GlySerPhePheLeuTyrSerArgLeuThrValAspLysSerArgTrp405410415GinGluGlyAsnValPheSerCysSerValMetHisGluAlaLeuHis420425430AsnHisTyrThrGinLysSerLeuSerIjeuSerLeuGlyLys435440445<210>《211><212><213><220><223><權(quán)>69213PRT人工的LG.060的輕鏈69114AlalieGinLeuThrGinSerProSerSerLeuSerAlaSerValGly151015AspArgValThr工leThrCysArgAlaSerGinGlylieSerSerAJ.a202530LeuAlaTrpTyrGinGinl>ysProGlyLysAlaProLysLeuLeulie354045TyrAspValSerSerLeuGluSerGlyValProSerArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSerLeuGinPro65707580GluAspPheAlaThrTyrTyrCysGinGinPheAsnSerTyrTrpThr859095PheGlyGinGlyThrLysValGlulieLysArgThrValAlaAlaPro100105110SerValPheliePheProProSerAspGluGinLeuLysSerGlyThr115120125AlaSerValValCysLeuLeuAsnAsnPheTyrProArgGluAlaLys130135140ValGinTrpLysValAspAsnAlaLeuGinSerGlyAsnSerGinG冬u"5150155SerValThrGluGinAspSerLysAspSerThrTyrSerLeuSerSer165170175ThrLeuThrLeuSerLysMaAspTyrGluLysHis!>ysValTyrAla180185190CysGluValThrHisGinGlyLeuSerSerProValThrLysSerPhe195200205AsnArgGLyGluCys210權(quán)利要求1.一種結(jié)合OX40L、包括可變輕鏈和可變重鏈的抗體，其特征在于所述可變重鏈包括選自SEQIDNOs33-38的CDR3和/或所述可變輕鏈包括選自SEQIDNOs51-57的CDR3。2.按照權(quán)利要求1的抗體，其特征在于所述可變重鏈包括選自SEQIDNOs:21-25的CDRl和選自SEQIDNOs:26-32的CDR2，和/或所述可變輕鏈包括選自SEQIDNOs:39-44的CDRl和選自SEQIDNOs:45-50的CDR2。3.按照權(quán)利要求1或2的抗體，其特征在于所述抗體結(jié)合OX40L，并且所述抗體包括獨立地選自由下列組合組成的組的可變區(qū)組合a)由氨基酸序列SEQIDNO:l定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和由SEQIDNO:2定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；b)由氨基酸序列SEQIDNO:3定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和由SEQIDNO:4定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；c)由氨基酸序列SEQIDNO:5定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和由SEQIDNO:6定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；d)由氨基酸序列SEQIDNO:7定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和由SEQIDNO:8定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；e)由氨基酸序列SEQIDNO:9定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和由SEQIDNO:IO定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；f)由氨基酸序列SEQIDNO:ll或16定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和由SEQIDNO:12定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；g)由氨基酸序列SEQIDNO:l定義的輕鏈(VO可變結(jié)構(gòu)域和由SEQIDNO:17定義的重鏈(VH)可變結(jié)構(gòu)域；h)由氨基酸序列SEQIDNO:18定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和由SEQIDNO:19定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；i)由氨基酸序列SEQIDNO:l定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和由SEQIDNO:20定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域。4.按照權(quán)利要求1-3中任一項的抗體，其特征在于所述人輕鏈可變區(qū)包括獨立地選自由SEQIDNO:1，3，5,7,9，11，16和18組成的組的氨基酸序列。5.按照權(quán)利要求1-4中任一項的抗體，其特征在于所述人重鏈可變區(qū)包括獨立地選自由SEQIDNO:2,4,6,8,10，12，17,19和20組成的組的氨基酸序列。6.按照權(quán)利要求1-5中任一項的抗體，其特征在于所述抗體包括由氮基酸序列SEQIDNO:l定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和由SEQIDNO:2，17或20定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域。7.按照權(quán)利要求1-6中任一項的抗體，其特征在于所述抗體包括由SEQIDNO:13定義的k輕鏈恒定區(qū)或者SEQIDNO:61,65或69的輕鏈恒定區(qū)。8.按照權(quán)利要求1-7中任一項的抗體，其特征在于所述抗體包括由SEQIDNO:14或SEQIDNO:15定義的重鏈恒定區(qū)或者SEQIDNO:58的重鏈恒定區(qū)。9.按照權(quán)利要求1-8的抗體，其特征在于所述抗體是人抗體。10.按照權(quán)利要求1-8的抗體，其特征在于所述抗體是嵌合的或人源化的抗體。11.按照權(quán)利要求1-10中任一項的抗體，其中所述抗體以小于10—8M的Ko值與OX40L結(jié)合。12.按照權(quán)利要求ll的抗體，其中所述Kd在10—'M0力M范圍。13.按照權(quán)利要求1-12中任一項的抗體，其特征在于它在ELISA檢測中表現(xiàn)出抑制，在0.5pg/mlOX40L的包被濃度，通過阻滯固定的OX40L和可溶的OX40之間的相互作用而進行抑制，具有1nM-4nM范圍的IC50值。14.按照權(quán)利要求1-13中任一項的抗體，其特征在于所述抗體是Fab、F(ab，)2或單鏈片段。15.按照權(quán)利要求1-13中任一項的抗體，其特征在于它由選自由下列細胞系組成的組的細胞系產(chǎn)生hu-Mab<hOX40L>LC.001，hu-Mab<hOX40L>LC.005，hu-Mab<hOX40L>LC.010，hu-Mab<hOX40L〉LC.019，hu-Mab<hOX40L>LC.029和hu-Mab<hOX40L>LC.033。16.—種編碼權(quán)利要求1-14中任一項的抗體分子的核酸分子。17.—種包括權(quán)利要求16的核酸分子的載體。18.—種包括權(quán)利要求17的載體的宿主細胞。19.一種用于制備權(quán)利要求1-14中任一項的抗體分子的方法，其包括將權(quán)利要求18的宿主細胞在允許所述抗體分子合成的條件下培養(yǎng)，并且從所述培養(yǎng)物回收所述抗體分子。20.—種組合物，其包括權(quán)利要求1-15中任一項的抗體分子或者通過權(quán)利要求19的方法產(chǎn)生的抗體分子。21.權(quán)利要求20的組合物，其是一種藥物組合物或診斷組合物。22.—種藥物組合物，其包括權(quán)利要求1-15中任一項的抗體和至少一種藥用賦形劑。23.權(quán)利要求1-15中任一項定義的抗體用于制備預防和治療炎癥疾病的藥物的應(yīng)用。24.試劑盒，其包括權(quán)利要求1-15中任一項的抗體分子，權(quán)利要求16的核酸分子，權(quán)利要求17的載體或權(quán)利要求18的宿主細胞。25.—種抗體，其特征在于所述抗體結(jié)合OX40L，是人IgGl種類并且包括Y重鏈SEQIDNO:58,62或66。26.按照權(quán)利要求1的抗體，其特征在于包括a)丫重鏈SEQIDNO:58和k輕鏈SEQIDNO:61，b)y重鏈SEQIDNO:62和k輕鏈SEQIDNO:65或c)y重鏈SEQIDNO:66和k輕鏈SEQIDNO:69。27.按照權(quán)利要求26的抗體，其特征在于所述抗體是包含突變L234A/L235A的IgGl種類，并且包括y重鏈SEQIDNO:59,63或67。28.按照權(quán)利要求27的抗體，其特征在于包括a)y重鏈SEQIDNO:59和k輕鏈SEQIDNO:61，b)y重鏈SEQIDNO:63和k輕鏈SEQIDNO:65或c)丫重鏈SEQIDNO:67和k輕鏈SEQIDNO:69。29.按照權(quán)利要求1的抗體，其特征在于所述抗體是含有突變S228P的IgG4種類，包括y重鏈seqIDno:60，64或68。30.按照權(quán)利要求29的抗體，其特征在于包括a)y重鏈SEQIDNO:60和k輕鏈SEQIDNO:61,b)y重鏈SEQIDNO:64和k輕鏈SEQIDNO:65或c)y重鏈SEQIDNO:68和k輕鏈SEQIDNO:69。全文摘要本發(fā)明涉及抗-OX40L抗體，并且特別地涉及抗-OX40L抗體及其變體，其含有衍生于人源的Fc片段并且不結(jié)合補體因子C1q。這些抗體具有給受炎癥疾病折磨的患者帶來益處的新穎性和創(chuàng)造性特點。文檔編號C12P21/08GK101684157SQ20091014253公開日2010年3月31日申請日期2005年9月16日優(yōu)先權(quán)日2004年9月17日發(fā)明者伊沃·格勞斯,保羅·帕倫,埃爾西·歐吉,弗蘭克·雷貝阿斯,揚·范德溫克爾,拉爾夫·舒馬赫,澤貝爾·斯特凡,瑪麗亞·芬特斯,約瑟夫·恩德爾,阿蘭·拉布里吉恩,馬丁·蘭岑德費爾,馬丁·弗里斯瑪-范武格特申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司