專利名稱：：轉(zhuǎn)化破囊壺菌目微生物的產(chǎn)物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明主要涉及編碼破囊壺菌目乙酰乳酸合酶的分離的核酸分子，包括賦予破囊壺菌目微生物對磺酰脲化合物，咪唑啉酮類抑制劑和/或嘧啶基羥苯甲酸鹽降低的敏感性的乙酰乳酸合酶；涉及包含破囊壺菌目微生物轉(zhuǎn)化的選擇性標(biāo)記物的重組核酸分子，并涉及用本發(fā)明重組核酸分子轉(zhuǎn)化這類微生物的方法。本發(fā)明也涉及破囊壺菌表達(dá)系統(tǒng)可用的基因啟動子。本發(fā)明的重組核酸分子可用于外源核酸在破囊壺菌目微生物中的表達(dá)及用于在破囊壺菌目微生物中去除，突變或滅活基因。
背景技術(shù)：
：開發(fā)導(dǎo)致對破囊壺菌綱的分類學(xué)進(jìn)行了修正。分類學(xué)家將破囊壺菌放在藻類或藻類狀原生生物中。然而，由于分類不確定，對于本發(fā)明最好認(rèn)為本發(fā)明所述該菌株是破囊壺菌(目破囊壺菌目；科破囊壺菌科；屬破囊壺菌屬，Schizochytrium，Labyrinthuloides，或J即onochytrium)。分類學(xué)改變在下文中概括。本文公開的某些單細(xì)胞微生物菌株是破囊壺菌目的成員。破囊壺菌是分類史進(jìn)化的海洋真核生物。Moss(1986)，Bahnweb和Jackie(1986)，以及Chamberlain和Moss(1988)對破囊壺菌的分類地位問題進(jìn)行了綜述。為了方便，分類學(xué)家首先將破囊壺菌綱與藻菌綱(藻類狀真菌)的其它無色游動孢子真核生物放在一起。然而，藻菌綱這一名稱最后從分類學(xué)地位中去掉，破囊壺菌被保留在卵菌綱(雙鞭毛游動孢子真菌)中。最初假定卵菌綱與異鞭毛藻類相關(guān)，Barr(Barr，1983)總結(jié)的廣泛超微結(jié)構(gòu)和生化研究最終支持了這一假定。事實(shí)上卵菌綱被Leedale(1974)和其他藻類學(xué)家作為異鞭毛藻類的一部分接受。但由于其異養(yǎng)特性帶來的方便，卵菌綱和破囊壺菌綱被真菌學(xué)家(研究真菌的科學(xué)家)而不是藻類學(xué)家(研究藻類的科學(xué)家)大量研究。從另一分類學(xué)角度來看，進(jìn)化生物學(xué)家對于真核生物如何進(jìn)化的問題形成了兩個(gè)系統(tǒng)學(xué)派。一個(gè)學(xué)說認(rèn)為膜結(jié)合細(xì)胞器通過一系列的內(nèi)共生的外生起源(Margulis，1970);例如線粒體起源于細(xì)菌的細(xì)胞內(nèi)共生生物，葉綠體起源于藍(lán)藻類，鞭毛起源于螺旋體。另一學(xué)說提出膜結(jié)合的細(xì)胞器從原核祖先的無膜結(jié)合的系統(tǒng)通過自生加工逐漸進(jìn)化(Cavalier-Smith，1975)。然而兩組進(jìn)化生物學(xué)家都將卵菌綱和破囊壺菌綱從真菌中取出并與產(chǎn)色植物藻類一起放在產(chǎn)色植物界中(Cavalier-Smith，1981)(該界最近擴(kuò)展到包括其它原生生物且該界的成員現(xiàn)在稱為Stramenopiles)或與所有藻類一起放在Protoctista界中(Margulis禾口Sagen，1985)。隨著電子顯微鏡的發(fā)展，對破囊壺菌綱的兩個(gè)屬，S卩，破囊壺菌屬和7Schizochytrium的游動孢子超微結(jié)構(gòu)的研究(Perkins,1976;Kazama，1980;Barr，1981)提供了破囊壺菌綱與卵菌綱僅具有較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系的良好證據(jù)。另外，對5S核糖體RNA序列的對應(yīng)分析(多變量統(tǒng)計(jì))得到的遺傳數(shù)據(jù)表明破囊壺菌明顯是一類獨(dú)特的真核生物，完全區(qū)別于真菌，且與紅藻和褐藻，以及與卵菌綱的成員有最近的親緣關(guān)系(Ma皿ella，等，1987)。大多數(shù)分類學(xué)家同意將破囊壺菌從卵菌綱中取出(Bartnicki-Garcia，1988)?？傊?，采用Cavalier-Smith的分類系統(tǒng)(1981，1983)，將破囊壺菌與產(chǎn)色植物藻類一起分類進(jìn)產(chǎn)色植物界(Stramenopiles)中。該分類將它們放在與真菌完全不同的一個(gè)界中，而真菌都放在Euf皿gi界中。因此破囊壺菌的分類地位總結(jié)如下界產(chǎn)色植物界(Stramenopiles)門異鞭毛門目破囊壺菌目科破囊壺菌科屬石皮囊壺菌屬，Schizochytrium，Labyrinthuloides或J即onochytrium?！┰缙诘姆诸悓W(xué)家將破囊壺菌屬的一些原始的成員(具有變形蟲狀生活階段的成員)分入一個(gè)稱為Ulkenia的獨(dú)立屬中。然而，現(xiàn)在知道大多數(shù)(如果不是全部的話)破囊壺菌(包括破囊壺菌屬和Schizochytrium)表現(xiàn)出變形蟲狀階段且有人認(rèn)為Ulkenia本身不是一個(gè)正確的屬。本文使用的破囊壺菌屬將包括Ulkenia。盡管門和界的高級分類中的分類學(xué)地位不確定，但是破囊壺菌保持特有的和特征性的分類，其成員可分類在破囊壺菌目內(nèi)。Schizochytrium屬和其它破囊壺菌目微生物，由于能產(chǎn)生大量脂類化合物，包括高度不飽和脂肪酸(HUFAs)和多種類胡蘿卜素(例如，蝦青素)，因此具有相當(dāng)?shù)默F(xiàn)有和潛在商業(yè)價(jià)值。"_3高度不飽和脂肪酸極有經(jīng)濟(jì)價(jià)值，因?yàn)樗鼈兘鼇硪驯徽J(rèn)定為重要的飲食化合物，可避免動脈硬化和冠心病，可減輕感染病癥并延遲腫瘤細(xì)胞生長。這些有益作用是"-3HUFA導(dǎo)致對"-6脂肪酸所生成的化合物，以及從"-3HUFA本身直接生成的有益化合物進(jìn)行競爭性抑制的結(jié)果(Simopoulos等，1986)。"_6脂肪酸是發(fā)現(xiàn)于植物和動物中的主要HUFA。因而，破囊壺菌目微生物作為商業(yè)生產(chǎn)生物的進(jìn)一步發(fā)展，將顯著受益于經(jīng)由重組DNA技術(shù)對生物進(jìn)行具體遺傳變化的能力，包括增強(qiáng)極有價(jià)值的HUFA和類胡蘿卜素的生產(chǎn)。另外，更好地理解這種不甚了解的生物群體的生化和分子生物學(xué)的能力會提供有價(jià)值的信息來用于指導(dǎo)對未來菌株的開發(fā)。然而，本發(fā)明之前沒有適合轉(zhuǎn)化破囊壺菌，包括Schizochytrium屬和破囊壺菌屬成員的方法和重組構(gòu)建體。重要的是，具體用于轉(zhuǎn)化破囊壺菌目微生物和鑒定破囊壺菌目-特異性啟動子序列的選擇性標(biāo)記物的開發(fā)在本發(fā)明之前是沒有的。以前的研究者已描述了用于多種微生物，包括在并非破囊壺菌目成員的微藻中進(jìn)行轉(zhuǎn)化的方法和試劑。授予All皿tt等的美國專利6，027，900公開了用于真核生物藻類，特別是Phaeodactyl咖tricor皿tum的遺傳工程的遺傳融合體，它用光合藻類集光基因的啟動子和來自印度斯坦鏈異壁菌的Shble基因作為選擇性標(biāo)記物。該細(xì)胞在高鹽濃度(例如，10-35g/L)下生長，用ZeocinTM選擇轉(zhuǎn)化子。適于用此種方法轉(zhuǎn)化的微藻細(xì)胞為光合微藻，它可在高鹽濃度下生長。授予D皿ahay等的美國專利5，661，017公開了轉(zhuǎn)化含葉綠素C的藻類(例如硅藻)的方法，它使用含選擇性標(biāo)記物的重組構(gòu)建體，該選擇性標(biāo)記物與適于嘎標(biāo)記物在含葉綠素C的藻類中表達(dá)的調(diào)控序列可操作性連接。該文中稱，該選擇性標(biāo)記物可以是任何適合的標(biāo)記物，包括從細(xì)菌和真菌來源分離的標(biāo)記物，并優(yōu)選為新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶。該調(diào)控序列可包括任何來自含葉綠素C的藻類的調(diào)控序列，并優(yōu)選來自Cyclotellacryptica(例如，C.cryptica乙?！狢oA羧化酶調(diào)控序列)。然而，此方法不能通過簡單轉(zhuǎn)換而用于破囊壺菌目微生物的轉(zhuǎn)化，因?yàn)楸景l(fā)明之前，微生物如破囊壺菌目(例如，微藻)的轉(zhuǎn)化還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不到常規(guī)水平。成熟的細(xì)菌和酵母標(biāo)記物及轉(zhuǎn)化系統(tǒng)不一定能輕易適用于其它微生物。事實(shí)上，美國專利5，661，017指出"在發(fā)展真核生物微藻的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)上成功很少"(col.1，lines49-51)，一部分原因是很難向此種微生物引入外源DNA，還有一部分原因是缺乏適用于此類轉(zhuǎn)化的標(biāo)記物和載體。美國專利5，661，017所述系統(tǒng)特別用于含葉綠素C的藻類，因?yàn)槟切┌l(fā)明者認(rèn)為它們適宜轉(zhuǎn)化，特別在與其它藻類比較后。類似地，美國專利6，027，900教授了特異用于光合微藻的轉(zhuǎn)化方法，它認(rèn)為大多藻類對任何遺傳操作都是難操縱的(col.1，lines39-47)。適合細(xì)菌，酵母，昆蟲和動物細(xì)胞的系統(tǒng)不容易適合微藻。因而本發(fā)明之前，本領(lǐng)域存在對微藻特異的有效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)和方法的需要。另外，盡管破囊壺菌目現(xiàn)與產(chǎn)色植物藻類被分組到Stramenopiles，仍有本領(lǐng)域人員持意見認(rèn)為這些微生物與大多微藻截然不同，而且本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為破囊壺菌目成員被分類為微藻根本不適合。被認(rèn)為是微藻的微生物在進(jìn)化中至少有四次不同的變革，導(dǎo)致〃微藻〃型微生物被置于不同的界(例如紅藻，綠藻和金藻(產(chǎn)色植物界)都在不同的界)。結(jié)果，在其它微藻中有用的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)不指望對破囊壺菌有用。因而，盡管破囊壺菌目微生物具有商業(yè)價(jià)值，通過遺傳工程利用此種微生物的全部潛力的能力在迄今還未被意識到。本發(fā)明之前，本發(fā)明人未見到任何對破囊壺菌目微生物轉(zhuǎn)化有用的啟動子，選擇性標(biāo)記物或載體，任何關(guān)于適合破囊壺菌所用的選擇系統(tǒng)的知識?？偠灾?，本領(lǐng)域有開發(fā)轉(zhuǎn)化破囊壺菌目微生物的方法的需要，并從而提供了創(chuàng)造具有增強(qiáng)的商業(yè)價(jià)值的菌株的工具。另外，本領(lǐng)域有開發(fā)通過破囊壺菌目微生物的同源或非同源重組而突變或滅活特定基因的方法的需要，它提供一條改變細(xì)胞代謝并鑒定特定基因在破囊壺菌的功能的道路。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明一實(shí)施方案涉及分離的核酸分子，它包含選自如下的核酸序列(a)編碼蛋白的核酸序列，該蛋白具有選自SEQIDN0:15，SEQIDN0:19，SEQIDNO:22禾PSEQIDNO:24的氨基酸序列，其中所述蛋白為乙酰乳酸合酶；(b)編碼蛋白的核酸序列，該蛋白具有與氨基酸序列(a)至少約75%相同的氨基酸序列，其中所述蛋白為乙酰乳酸合酶；或(c)與核酸序列(a)或(b)完全互補(bǔ)的核酸序列。一方面，此核酸序列編碼具有與氨基酸序列(a)至少約85%相同的氨基酸序列的蛋白，并且其中所述蛋白為乙酰乳酸合酶。另一方面，此核酸序列編碼具有與氨基酸序列(a)至少約95%相同的氨基酸序列的蛋白，并且其中所述蛋白為乙酰乳酸合酶。另一方面，此核酸序列編碼具有與SEQIDN0:15不同的氨基酸序列的蛋白，該不同是由于在選自116G，117A，192P，200A，251K，358M，383D，592V，595W和599F的氨基酸位置的氨基酸缺失，插入或取代。一方面，此核酸序列編碼具有選自SEQIDNO:15，SEQIDNO:19，SEQIDNO:22禾PSEQIDNO:24的氨基酸序列的蛋白，并且其中所9述蛋白為乙酰乳酸合酶。另一方面，所述核酸序列選自SEQIDNO:14的核苷酸1260-3314，SEQIDNO:18的核苷酸1260-3314，SEQIDNO:21的核苷酸1260-3314，和SEQIDNO:23的核苷酸1260-3314。優(yōu)選，上面鑒定的核酸序列所編碼的蛋白的表達(dá)賦予用此核酸分子轉(zhuǎn)化的破囊壺菌目微生物對選自磺酰脲化合物，咪唑啉酮類抑制劑，和嘧啶基羥苯甲酸鹽的化合物降低的敏感性。在此實(shí)施方案的一方面中，該核酸序列編碼具有氨基酸序列選自SEQIDNO:19，SEQIDNO:22和SEQIDNO:24的蛋白。在此實(shí)施方案的另一方面，所述核酸序列選自SEQIDNO:14的核苷酸1260-3314，SEQIDNO:18的核苷酸1260-3314，SEQIDNO:21的核苷酸1260-3314，和SEQIDNO:23的核苷酸1260-3314。本發(fā)明一實(shí)施方案中，上述核酸序列編碼Schizochytrium乙酰乳酸合酶。一方面，Schizochytrium乙酰乳酸合酶的表達(dá)賦予用此核酸分子轉(zhuǎn)化的破囊壺菌目微生物對選自磺酰脲化合物，咪唑啉酮類抑制劑，和嘧啶基羥苯甲酸鹽的化合物降低的敏感性。本發(fā)明另一實(shí)施方案涉及包含可操作性連接到轉(zhuǎn)錄控制序列的上述任一種分離的核酸分子的重組核酸分子，該重組核酸分子。本發(fā)明另一實(shí)施方案涉及用此重組核酸分子轉(zhuǎn)化的破囊壺菌目的重組微生物。本發(fā)明另一實(shí)施方案涉及用于破囊壺菌目微生物轉(zhuǎn)化的重組載體。所述載體包括編碼乙酰乳酸合酶的核酸序列，所述乙酰乳酸合酶可賦予用此核酸分子轉(zhuǎn)化的破囊壺菌目微生物對選自磺酰脲化合物，咪唑啉酮類抑制劑，和嘧啶基羥苯甲酸鹽的化合物降低的敏感性。所述乙酰乳酸合酶具有選自如下的氨基酸序列(a)選自SEQIDNO:19，SEQIDNO:22和SEQIDNO:24的氨基酸序列；和(b)與氨基酸序列(a)至少約75%相同的氨基酸序列。編碼乙酰乳酸合酶的核酸序列是可操作性連接到轉(zhuǎn)錄控制序列。一方面，所述重組載體為表達(dá)載體。另一方面，所述重組載體為靶向載體。其它方面，載體內(nèi)的核酸序列編碼具有與氨基酸序列(a)至少約85%相同的，并且另一方面，至少約95%相同的氨基酸序列的乙酰乳酸合酶。一方面，此核酸序列編碼具有與SEQIDN0:15不同的氨基酸序列的蛋白，該不同是由于在選自116G，117A，192P，200A，251K，358M，383D，592V，595W禾口599F的氨基酸位置的氨基酸缺失，插入或取代。在優(yōu)選方面，所述乙酰乳酸合酶具有選自SEQIDNO:19，SEQIDNO:22和SEQIDNO:24的氨基酸序列。另一方面，所述核酸序列選自SEQIDNO:18的核苷酸1260-3314，SEQIDNO:21的核苷酸1260-3314，和SEQIDNO:23的核苷酸1260-3314。在重組載體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄控制序列可包括但不限于破囊壺菌目a-微管蛋白啟動子，破囊壺菌目乙酰乳酸合酶啟動子，來自破囊壺菌目聚酮化合物合酶(PKS)系統(tǒng)的啟動子，或破囊壺菌目脂肪酸脫氫酶啟動子。一方面，所述載體包含選自SEQIDN0:18，SEQIDNO:21禾PSEQIDNO:23的核酸序列。本發(fā)明另一實(shí)施方案涉及破囊壺菌目微生物的細(xì)胞的轉(zhuǎn)化方法。所述方法包括第一種步(a)向破囊壺菌目微生物的細(xì)胞引入含有編碼乙酰乳酸合酶的核酸序列的重組核酸分子，所述乙酰乳酸合酶賦予細(xì)胞對選自磺酰脲化合物，咪唑啉酮類抑制劑，和嘧啶基羥苯甲酸鹽的化合物降低的敏感性，其中此乙酰乳酸合酶具有選自如下的氨基酸序列(i)選自SEQIDNO:19，SEQIDNO:22和SEQIDNO:24的氨基酸序列；和(ii)與氨基酸序列(i)至少約75%相同的氨基酸序列。所述方法包括第二種步(b)選擇被重組核酸分子成功轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞，方法是在含至少一種抑制未轉(zhuǎn)化細(xì)胞的化合物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)(a)的細(xì)胞，該化合物選自磺酰脲化合物，咪唑啉酮類抑制劑，和嘧啶基羥苯甲酸鹽。一方面，此核酸序列編碼具有與氨基酸序列(i)至少約85%相同的，更優(yōu)選至少約95%相同的氨基酸序列的乙酰乳酸合酶。一方面此核酸序列編碼與SEQIDN0:15不同的氨基酸序列的蛋白，該不同是由于在選自116G，117A，192P，200A，251K，358M，383D，592V，595W禾口599F的氨基酸位置的氨基酸缺失，插入或取代。另一方面，所述乙酰乳酸合酶具有選自SEQIDNO:19，SEQIDNO:22和SEQIDNO:24的氨基酸序列。優(yōu)選，所述核酸序列選自SEQIDNO:18的核苷酸1260-3314，SEQIDNO:21的核苷酸1260-3314，和SEQIDNO:23的核苷酸1260-3314。另一方面，所述核酸序列與轉(zhuǎn)錄控制序列可操作地連接，所述轉(zhuǎn)錄控制序列選自破囊壺菌目a-微管蛋白啟動子，破囊壺菌目乙酰乳酸合酶啟動子，來自破囊壺菌目聚酮化合物合酶(PKS)系統(tǒng)的啟動子，和破囊壺菌目脂肪酸脫氫酶啟動子?！矫?，所述重組核酸分子還包含編碼細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白的核酸序列，其中此核酸序列編碼可操作性連接到轉(zhuǎn)錄控制序列的蛋白。本實(shí)施方案一方面，所述蛋白與選自二十二碳六烯酸(DHA)，二十二碳五烯酸(DPA)，二十碳五烯酸(EPA)和二十碳四烯酸(ARA)的脂肪酸的合成相關(guān)。本實(shí)施方案另一方面，所述蛋白選自脂肪酸合酶，脂肪酸脫氫酶，脂肪酸延伸酶(elongase)，與聚酮化合物合酶復(fù)合體相關(guān)的蛋白和與將脂肪酸摻入磷脂或三甘油酯分子相關(guān)的蛋白。一方面，所述蛋白為被核酸序列SEQIDN0:29編碼的"_3脂肪酸脫氫酶。另一方面，該蛋白為多烯脂肪酸異構(gòu)酶。另一方面，此類蛋白選自HMG-CoA合酶，HMG-CoA還原酶，角鯊烯合酶，八氫番茄紅素合酶，八氫番茄紅素脫氫酶，類胡蘿卜素環(huán)化酶，類胡蘿卜素羥化酶，類胡蘿卜素酮酶，維生素E和硫辛酸。本方法另一方面，步驟(a)中的所述重組核酸分子還包含與微生物內(nèi)靶核酸序列雜交的核酸序列，從而包含靶核酸序列的基因通過與第二種核酸序列同源重組而被突變或滅活。這方面，該靶核酸序列可編碼選自下組的蛋白脂肪酶，脂肪酸氧化酶，參與糖類合成的蛋白，參與類異戊二烯途徑產(chǎn)物合成的蛋白，參與細(xì)胞壁組分合成的蛋白，參與飽和脂肪酸合成途徑的蛋白，參與多聚不飽和脂肪酸合成途徑的蛋白，與聚酮化合物合酶復(fù)合體相關(guān)的蛋白和與將脂肪酸摻入磷脂或三甘油酯分子相關(guān)的蛋白。本方法還可包括向細(xì)胞引入至少一種附加的重組核酸分子的步驟，此重組核酸分子包含編碼要表達(dá)的蛋白的核酸序列，此核酸序列與轉(zhuǎn)錄控制序列可操作性連接。在另一方面，此方法還可包括向細(xì)胞引入至少一種附加的重組核酸分子的步驟，此重組核酸分子包含與微生物內(nèi)的靶核酸序列雜交的第二種核酸序列，導(dǎo)致包含靶核酸序列的基因通過與第二種核酸序列同源重組而被突變或滅活。另一方面，此方法還包括向細(xì)胞引入重組核酸分子的步驟，此重組核酸分子包含編碼博來霉素_結(jié)合蛋白的核酸序列。這方面，所述包含編碼博來霉素-結(jié)合蛋白的核酸序列的重組核酸分子還包含編碼細(xì)胞表達(dá)的第二種蛋白的核酸序列，其中所述編碼第二種蛋白的核酸序列為可操作性連接到轉(zhuǎn)錄控制序列。所述轉(zhuǎn)錄控制序列可包括但不限于破囊壺菌目a-微管蛋白啟動子，破囊壺菌目乙酰乳酸合酶啟動子，來自破囊壺菌目聚酮化合物合酶(PKS)系統(tǒng)的啟動子，和破囊壺菌目脂肪酸脫氫酶啟動子。本實(shí)施方案的另外的方面，所述包含編碼博來霉素-結(jié)合蛋白的核酸序列的重組核酸分子還包含與微生物內(nèi)靶核酸序列雜交的第二種核酸序列，從而包含靶核酸序列的基因通過與第二種核酸序列同源重組而被突變或滅活。一實(shí)施方案中，所述重組核酸分子包含核酸序列SEQIDNO:9。本發(fā)明方法中所述微生物可來自下列屬，包括但不限于破囊壺菌屬，Labyrinthuloides屬，Japonochytrium屬，禾口Schizochytri皿屬。一方面，此微生物來自下歹lj禾中，包括但不限于Schizochytriumsp.，Schizochytriumaggregatum,Schizochytriumlimaci皿m，Thraustochytriumsp.，Thraustochytriumstriatum,Thraustochytriumaureum，Thraustochytriumroseum，禾口Japonochytriumsp.本方法一實(shí)施方案中，所述引入步驟是用選自粒子轟擊，電穿孔，顯微射，脂轉(zhuǎn)染，吸附，感染和原生質(zhì)體融合的方法完成的。本發(fā)明另一實(shí)施方案涉及用重組核酸分子轉(zhuǎn)化的破囊壺菌目的重組微生物，該重組核酸分子包含了編碼乙酰乳酸合酶的核酸序列，乙酰乳酸合酶賦予此微生物對選自磺酰脲化合物，咪唑啉酮類抑制劑和/或嘧啶基羥苯甲酸鹽的化合物降低的敏感性。所述乙酰乳酸合酶具有選自下述的氨基酸序列(a)選自SEQIDNO:19，SEQIDNO:22和SEQIDN0:24的氨基酸序列；和(b)與氨基酸序列(a)至少約75%相同的氨基酸序列。一方面，該編碼乙酰乳酸合酶的核酸序列具有與氨基酸序列(a)至少約85%相同的氨基酸序列。另一方面，該編碼乙酰乳酸合酶的核酸序列具有與氨基酸序列(a)至少約95%相同的氨基酸序列。另一方面，所述乙酰乳酸合酶具有選自SEQIDN0:19，SEQIDN0:22和SEQIDNO:24的氨基酸序列。另一方面，該核酸序列選自下述SEQIDNO:18的核苷酸1260-3314，SEQIDNO:21的核苷酸1260-3314，和SEQIDNO:23的核苷酸1260-3314。另一方面，所述重組核酸分子包含選自SEQIDNO:18，SEQIDNO:21和SEQIDNO:23的核酸序列。優(yōu)選，此編碼乙酰乳酸合酶的核酸序列與在破囊壺菌目微生物中有功能的啟動子可操作性連接。一方面，此編碼乙酰乳酸合酶的核酸序列可操作性連接到選自破囊壺菌目a-微管蛋白啟動子，破囊壺菌目乙酰乳酸合酶啟動子，來自破囊壺菌目聚酮化合物合酶(PKS)系統(tǒng)的啟動子，和破囊壺菌目脂肪酸脫氫酶啟動子的轉(zhuǎn)錄控制序列。一實(shí)施方案中，所述重組核酸分子還包含編碼該微生物產(chǎn)生的第一種蛋白的核酸序列，其中此編碼第一種蛋白的核酸序列可操作性連接到轉(zhuǎn)錄控制序列。另一實(shí)施方案中，所述重組細(xì)胞還用含有編碼博來霉素-結(jié)合蛋白的核酸序列的重組核酸分子轉(zhuǎn)化。優(yōu)選，所述重組核酸分子包含核酸序列SEQIDNO:9。一實(shí)施方案中，所述包含編碼博來霉素-結(jié)合蛋白的核酸序列的重組核酸分子還包含編碼所述細(xì)胞產(chǎn)生的第二種蛋白的核酸序列，其中編碼第二種蛋白的核酸序列可操作性連接到轉(zhuǎn)錄控制序列。一實(shí)施方案中，此微生物也包括至少一種附加的重組核酸分子，它包含編碼所述細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白的核酸序列。本發(fā)明另一實(shí)施方案涉及分離的核酸分子，它包含選自如下的核酸序列(a)SEQIDNO:9的核苷酸441-894;(b)與SEQIDNO:9的核苷酸441-894的全長至少約95%相同的核酸序列，其中所述核酸序列具有至少基本的a-微管蛋白啟動子轉(zhuǎn)錄活性，和(c)分離的多核苷酸，它包含與多核苷酸(a)或(b)完全互補(bǔ)的核酸序列。優(yōu)選，所述分離的核酸分子包含SEQIDNO:4的核酸序列或包含SEQIDNO:9的核苷酸441-894。本發(fā)明另一實(shí)施方案涉及用于轉(zhuǎn)化破囊壺菌目微生物的重組載體，它包含編碼博來霉素_結(jié)合蛋白的核酸序列，該核酸序列與啟動子可操作性連接，所述啟動子選自破囊壺菌目a-微管蛋白啟動子，破囊壺菌目乙酰乳酸合酶啟動子，來自破囊壺菌目聚酮化合物合酶(PKS)系統(tǒng)的啟動子，和破囊壺菌目脂肪酸脫氫酶啟動子。一方面，所述破囊壺菌目乙酰乳酸合酶啟動子包含SEQIDNO:14的核苷酸1-1259。一方面，所述a_微管蛋白啟SEQIDNO:9的核苷酸441-894，以及與SEQIDNO:9的核苷酸441-894的全長至少約95%相同的核酸序列的核酸序列，其中所述核酸序列具有至少基本的a-微管蛋白啟動子轉(zhuǎn)錄活性。另一方面，來自破囊壺菌目PKS系統(tǒng)的啟動子包含SEQIDN0:34或包含SEQIDN0:34所含有的核酸序列，其中所述啟動子具有至少基本的PKS啟動子轉(zhuǎn)錄活性。另一方面，所述重組載體包含選自SEQIDNO:8和SEQIDNO:9的核酸序列。附圖簡述圖1闡述了重組質(zhì)粒pTUBZEO-11的構(gòu)建。圖2闡述了重組質(zhì)粒pTUBZE011-2的構(gòu)建。圖3A闡述了重組質(zhì)粒pM0N50200。圖3B闡述了重組質(zhì)粒pM0N50201。圖3C闡述了重組質(zhì)粒pM0N50202。圖3D闡述了重組質(zhì)粒pM0N50203。發(fā)明祥述本發(fā)明包含遺傳轉(zhuǎn)化破囊壺菌目微生物的方法和相關(guān)的物質(zhì)。所有本文公開用作本發(fā)明重組構(gòu)建體的重組子的單細(xì)胞微生物菌株，也可統(tǒng)稱為破囊壺菌，是破囊壺菌目的成員。根據(jù)本發(fā)明術(shù)語〃破囊壺菌〃，〃破囊壺菌目微生物〃和〃破囊壺菌目微生物〃可互換使用。本發(fā)明人未見到任何以前的報(bào)告描述用于Schizochytrium屬或其它破囊壺菌目微生物的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。本文所述的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)可用于向破囊壺菌目微生物引入外源基因，因而提供了創(chuàng)造具有增強(qiáng)的商業(yè)價(jià)值的菌株的工具。另外，本發(fā)明通過同源或非同源重組使特定的基因突變或滅活，提供了一種改變細(xì)胞代謝并鑒定特定基因在破囊壺菌目微生物中的功能的新方法。更具體地，本發(fā)明人用兩類轉(zhuǎn)化載體證實(shí)了破囊壺菌目Schizochytrium屬微生物(目破囊壺菌目；科破囊壺菌科；屬Schizochytrium屬)的遺傳轉(zhuǎn)化。這些載體可用標(biāo)準(zhǔn)方法引入細(xì)胞，隨后基于它們在選擇性化合物存在時(shí)生長的能力來鑒定并分離重組細(xì)胞。本發(fā)明人通過粒子轟擊引入這些載體，從而證實(shí)了它們的有效性，但其它引入載體的工具也可用(例如，電穿孔)并在本領(lǐng)域已知，而且應(yīng)為本發(fā)明所包括。針對一種轉(zhuǎn)化載體，例如，本文命名為pTUBZE011-2的重組載體，制備嵌合基因，其中來自印度斯坦鏈異壁菌的ble基因(其編碼〃博來霉素-結(jié)合蛋白〃)被置于來自Schizochytrium微管蛋白基因啟動子的下游。SV40終止子被置于此構(gòu)建體中ble基因的下游。此載體能保證ble基因在Schizochytrium中表達(dá)，從而賦予對ZeocinTM和相關(guān)化合物的抗性，所述化合物當(dāng)以適當(dāng)水平被包括在生長培養(yǎng)基內(nèi)時(shí)，對野生型細(xì)胞是有毒的。此構(gòu)建體中ble基因和SV40終止子的來源是商業(yè)化的載體，叫做pSV40/Zeo，它得自InvitrogenCorporation(Carlsbad，CA)(技術(shù)手冊180202，VersionB，〃ZeoCassetteVectors〃；InvitrogenCorporation,1600FaradayAve.，Carlsbad,CA92008)。該微管蛋白基因啟動子經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分離；用于該反應(yīng)的引物之一是基于通過隨機(jī)SchizochytriumcDNA測序項(xiàng)目得到的序列數(shù)據(jù)。pTUBZEOll-2的圖譜見圖2所示，pTUBZE011-2的核苷酸序列用SEQIDNO:9表示。用這種載體進(jìn)行的Schizochytrium轉(zhuǎn)化用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來確認(rèn)并用DNA印跡分析來檢測整合入Schizochytrium基因組的載體序列的存在。13ble基因已被以前的研究者作為各種生物的遺傳轉(zhuǎn)化的選擇性標(biāo)記物，包括細(xì)菌，非破囊壺菌微藻，真菌，原生動物，植物，和動物細(xì)胞(見，例如，美國專利6，027，900;Lumbreras等.，1998，PlantJ.14:441-447;Rohe等.，1996，Curr.Genet.29:587-590;Messina等.，1995，Gene165:213-217;G證reroetal.，1992，ppl.Microbiol.Biotechnol.36:759-762;Perez等，1989，PlantMol.Biol.13:365-373;Gatigno等，1990Gene91:35-41)。ble基因編碼〃博來霉素-結(jié)合蛋白〃，它賦予對多種抗生素，包括博來霉素，腐草霉素和Zeocin的抗性(Drocourt等，1990，核酸sRes.18:4009)。此類基因可購自InvitrogenCorporation,這是本發(fā)明人用于制備Schizochytrium轉(zhuǎn)化載體pTUBZE011-2的基因來源。然而，相信本發(fā)明人是產(chǎn)生下述轉(zhuǎn)化載體的第一種人，所述載體中ble基因與破囊壺菌啟動子相連，使得該基因在破囊壺菌表達(dá)。第二套轉(zhuǎn)化載體用乙酰乳酸合酶基因(als)的體外定點(diǎn)誘變來創(chuàng)造，該基因是本發(fā)明人從Schizochytrium基因組文庫中分離的。這些突變改變了所編碼的酶(ALS)的氨基酸序列，使它對sulfometuronmethyl和其它磺酰脲化合物，咪唑啉酮類抑制劑和嘧啶基羥苯甲酸鹽的敏感性大大降低，而這些化合物原本是破囊壺菌目微生物所敏感的。磺酰脲化合物，如sulfometuronmethyl(S匪)通常對細(xì)胞有毒，因?yàn)樗鼈兡芙Y(jié)合并滅活各種生物的乙酰乳酸合酶(ALS)。ALS催化纈氨酸，亮氨酸，和異亮氨酸生物合成的第一種步。咪唑啉酮，triazolopyrimidines，和其它化合物已示可結(jié)合并滅活來自某些生物的ALS。來自其他生物的，編碼乙酰乳酸合酶(也叫乙酰羥酸合酶)的基因的突變形式以前被用作酵母和植物轉(zhuǎn)化的選擇性標(biāo)記物(Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.40:441-470，1989)。然而，本發(fā)明之前沒有一篇報(bào)道描述來自Schizochytrium屬或其它破囊壺菌目成員的als基因的序列或性質(zhì)，或描述破囊壺菌目als基因突變體賦予對磺酰脲類，咪唑啉酮或嘧啶基羥苯甲酸鹽化合物的抗性的用途。事實(shí)上，就本發(fā)明人所知，無任何關(guān)于破囊壺菌目微生物對這些選擇試劑(包括sulfometuronmethyl)的敏感性的報(bào)道，因而，本發(fā)明之前并不知道這種選擇性標(biāo)記物是否適用于破囊壺菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。值得注意的是，與已知als基因具有較高同源性的基因出現(xiàn)在各種生物中，但它們不編碼能催化乙酰乳酸合成的酶(BiochimicaetBiophysicaActa1385:401-419,1998)。因而并不清楚，克隆的als同系物(homologue)事實(shí)上編碼ALS。為明確確定是否克隆的Schizochytrium基因真是als基因，本發(fā)明人通過轉(zhuǎn)化試驗(yàn)證實(shí)，sulfometuronmethyl-抗性與突變的假定Schizochytriumals基因的表達(dá)陽性相關(guān)。本發(fā)明人制備了三種不同的含als基因突變體的轉(zhuǎn)化載體其中一種als基因突變體編碼的酶在595位是纈氨酸而不是色氨酸(質(zhì)粒pM0N50201，或ALSmutl-7)，另一在192位為谷氨酰胺而不是脯氨酸(質(zhì)粒pM0N50202，或ALSmut2-2)，第三種形式同時(shí)含有這兩種突變(質(zhì)粒pM0N50203，或ALSmut3-5)。在這些載體中，所述重組als基因突變體的表達(dá)受天然als基因啟動子和終止子的控制。這些載體，以及含有野生型Schizochytriumals基因的載體(質(zhì)粒pM0N50200，或AE-5)的圖譜見圖3A-3D所示。用這些ALS突變體-編碼載體進(jìn)行的Schizochytrium轉(zhuǎn)化用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來確認(rèn)，并用DNA印跡分析來檢測整合入Schizochytrium基因組的載體序列的存在。如下具體所述，既然本發(fā)明人已經(jīng)鑒定了als基因的完整序列，因而也可以制備其它突變，特別是如下的突變。因而，所述als基因突變體意在舉例，并非唯一可能的突變。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)已被用來經(jīng)共轉(zhuǎn)化向破囊壺菌目細(xì)胞引入外源基因。這些情況中，所述外源基因被置于多種Schizochytrium啟動子和適宜終止子(例如，SV40或Schizochytrium基因終止子區(qū))之間。例如，本發(fā)明人已產(chǎn)生并引入了編碼線蟲Caenorhabditiselegans的"_3脂肪酸脫氫酶的合成基因(本文為SEQIDNO:29)，以增加二十二碳六烯酸在Schizochytrium中的水平。SEQIDNO:30代表SEQIDNO:29編碼的脫氫酶的氨基酸序列。含有外源基因的表達(dá)盒也可通過直接包括在含有選擇性標(biāo)記物的轉(zhuǎn)化載體中而被引入破囊壺菌目細(xì)胞。而且，本發(fā)明人也用ALS突變體-編碼載體證實(shí)，同源重組出現(xiàn)在Schizochytrium中，這表明用重組工具滅活或突變具體的天然Schizochytrium基因的可行性。關(guān)于本文所述的破囊壺菌目啟動子序列，對已經(jīng)報(bào)道的破囊壺菌目成員的所有核苷酸和蛋白序列進(jìn)行了序列數(shù)據(jù)庫(GenBank)檢索，結(jié)果表明截止本發(fā)明時(shí)，沒有Schizochytrium屬或任何其它破囊壺菌目成員的啟動子序列的報(bào)道。唯一被報(bào)道來自任何Schizochytrium種的基因是S.aggregatum的5S核糖體RNA(GenBank序列號X06104和M13616)。破囊壺菌目成員(尤其Ulkefaia種)，Labyrinthuloides屬和破囊壺菌屬的5S和18S核糖體RNA序列已有報(bào)道，但這與本發(fā)明沒有關(guān)系。來自Thraustochytriumaureuin的"公認(rèn)T3/T7-樣RNA聚合酶"基因的部分編碼區(qū)已有報(bào)道(NucleicAcidsResearch15:648-654，1996)，但此類基因的啟動子序列未被報(bào)道。本發(fā)明可用于將任何目的基因或其它核苷酸序列引入破囊壺菌目微生物。此類核苷酸序列包括，但不限于編碼與脂肪酸(例如，脂肪酸二十二碳六烯酸(DHA)，二十二碳五烯酸(DPA)，二十碳五烯酸(EPA)和二十碳四烯酸(ARA))合成相關(guān)的蛋白(例如，酶)的核酸。所述蛋白包括，但不限于脂肪酸合酶，脂肪酸脫氫酶，脂肪酸延伸酶，與聚酮化合物合酶復(fù)合體相關(guān)的蛋白，和/或與將這類脂肪酸摻入磷脂或三甘油酯分子相關(guān)的蛋白。例如，本發(fā)明已用于將編碼各種"_3脂肪酸脫氫酶的基因引入Schizochytrium中，以嘗試經(jīng)過二十二碳五烯酸(DPA)的"-3去飽和作用增加二十二碳六烯酸(DHA)在細(xì)胞中的水平。在另一例中，已證實(shí)紅藻Pilota的公認(rèn)多烯脂肪酸異構(gòu)酶在Schizochytrium中的表達(dá)。編碼破囊壺菌聚酮化合物合酶復(fù)合體的基因(即，聚酮化合物合酶系統(tǒng))已用GenBank序列號AF378329(0RFA)，F(xiàn)378328(0RFB)和AF378329(0RFC)登記。本發(fā)明也用于向破囊壺菌目微生物引入其它編碼與類異戊二烯生物合成途徑相關(guān)的蛋白的基因和核苷酸序列。此類蛋白包括，但不限于HMG-CoA合酶和HMG-CoA還原酶。其它適合的蛋白包括與來自類異戊二烯亞單位的分子的合成相關(guān)的蛋白，所述分子包括，但不限于各種類固醇化合物和各種類胡蘿卜素化合物。與各種類胡蘿卜素化合物的合成相關(guān)的蛋白包括，但不限于角鯊烯合酶，八氫番茄紅素合酶，八氫番茄紅素脫氫酶，和各種類胡蘿卜素環(huán)化酶，羥化酶和酮酶。本發(fā)明也用于向破囊壺菌中引入一或多種編碼與抗氧化化合物合成相關(guān)的蛋白的核酸序列，所述化合物包括，但不限于維生素E和硫辛酸。另外，本發(fā)明可用于向破囊壺菌目微生物引入任何基因或其它核苷酸序列載體，以滅活或去除基因(即，〃剔除〃或〃定向基因破壞〃)?；虻臏缁罨蛉コǔＳ糜谠鰪?qiáng)微生物的商業(yè)價(jià)值。例如，可能希望去除編碼飽和和多聚不飽和脂肪酸合成途徑的酶的基因(或調(diào)節(jié)此類基因表達(dá)的核酸)。另一方面，可能希望抑制或剔除編碼下述蛋白的基因，所述蛋白參與其它為破囊壺菌目微生物所產(chǎn)生的有價(jià)值化合物的降解，或者減少所需的化合物的價(jià)值。例如，編碼脂肪酶，脂肪酸氧化酶，和具有討厭的滋味或氣味的蛋白的基因可能是本發(fā)明希望剔除的目標(biāo)。另一方面，可能希望剔除編碼與化合物合成相關(guān)的蛋白的基因，其合成與其它目的分子有競爭。例如，此類基因包括，但不限于編碼參與糖類生物合成的蛋白的基因，編碼參與類異戊二烯途徑各種產(chǎn)物(例如，固醇或特定類胡蘿卜素化合物)的合成的蛋白的基因，和編碼參與細(xì)胞壁組分的合成的蛋白的基因。例如，已利用本發(fā)明將基因引入Schizochytrium細(xì)胞中，以嘗試滅活與來自Shewanella的聚酮化合物合酶基因同源的基因，從而評估他們在高度不飽和脂肪酸(HUFA)的生產(chǎn)中的作用。如實(shí)施例6所舉例，本發(fā)明也可用來滅活，去除或突變天然的參與脂肪酸，類胡蘿卜素，固醇，維生素或其它化合物的產(chǎn)生的基因，從而提高與這些化合物相關(guān)的產(chǎn)物的商業(yè)價(jià)值或可接受性。在一些實(shí)施方案中，如上討論，可能需要促進(jìn)給定蛋白的產(chǎn)生，而在其他實(shí)施方案中，可能需要抑制同種蛋白的產(chǎn)生。此類決定是基于具體微生物的指定用途和生產(chǎn)目的。本發(fā)明也用于確定在Schizochytrium中進(jìn)行遺傳重組的過程。其它用于引入破囊壺菌目的基因和核酸分子對那些本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的，并且所有此類基因和分子都應(yīng)為本發(fā)明所包括。下文中主要就本發(fā)明的破囊壺菌目als基因和/或ALS蛋白描述了本發(fā)明的各種實(shí)施方案。然而，應(yīng)理解對術(shù)語和方法的一般定義可應(yīng)用于其它下述基因，核酸和蛋白的討論。本發(fā)明是部分基于編碼選擇性標(biāo)記物的核酸序列的鑒定，分離和產(chǎn)生，所述選擇性標(biāo)記物適于在破囊壺菌目微生物轉(zhuǎn)化的重組構(gòu)建體中應(yīng)用。這樣的選擇性標(biāo)記物允許對本發(fā)明重組構(gòu)建體所成功轉(zhuǎn)化的微生物進(jìn)行篩選?？捎糜诒景l(fā)明破囊壺菌目轉(zhuǎn)化的一種選擇性標(biāo)記物為破囊壺菌乙酰乳酸合酶(即ALS)。優(yōu)選，所述乙酰乳酸合酶已經(jīng)過修飾，突變，或者選擇，能抵抗磺酰脲化合物，咪唑啉酮類抑制劑和/或嘧啶基羥苯甲酸鹽的抑制(即這種ALS為天然乙酰乳酸合酶的同系物)。根據(jù)本發(fā)明，乙酰乳酸合酶為具有乙酰乳酸合酶生物活性的蛋白，包括全長蛋白，融合蛋白，或天然乙酰乳酸合酶的任何同系物。乙酰乳酸合酶的同系物包括與天然乙酰乳酸合酶不同的蛋白，該不同是由于至少一或幾個(gè)，但不限于一或幾個(gè)氨基酸被去除(例如，所述蛋白的截短型，如肽或片段)，插入，倒位，替代和/或衍生(例如，通過糖基化，磷酸化，乙?；?，十四酰化，異戊二烯化，十六?；０坊?或加入糖基磷脂酰肌醇)。天然乙酰乳酸合酶的優(yōu)選同系物見下詳述。根據(jù)本發(fā)明分離的蛋白，如分離的乙酰乳酸合酶，為從其天然環(huán)境取出(即經(jīng)過了人工處理)的蛋白，也可包括例如，純化的蛋白，部分純化的蛋白，重組產(chǎn)生的蛋白，和合成產(chǎn)生的蛋白。類似地，"分離的"不必反映該核酸分子被純化的程度。優(yōu)選，本發(fā)明分離的乙酰乳酸合酶是重組產(chǎn)生的。"破囊壺菌乙酰乳酸合酶"指乙酰乳酸合酶(包括天然乙酰乳酸合酶的同系物)，它來自破囊壺菌目微生物或根據(jù)對破囊壺菌目微生物的天然乙酰乳酸合酶的結(jié)構(gòu)(例如，序列)的了解而制備。換言之，破囊壺菌目乙酰乳酸合酶包括任何下述乙酰乳酸合酶，它具有破囊壺菌目微生物的天然乙酰乳酸合酶的結(jié)構(gòu)和功能或位破囊壺菌目微生物的天然乙酰乳酸合酶的生物活性(即具有生物活性)同系物，如本文詳述。因此，破囊壺菌目乙酰乳酸合酶可包括純化蛋白，部分純化蛋白，重組蛋白，突變/修飾蛋白和合成蛋白?！?，蛋白的生物活性或生物作用指該蛋白表現(xiàn)或?qū)嵤┑娜魏喂δ埽龉δ苁窃摰鞍椎奶烊恍问皆隗w內(nèi)(即在該蛋白的天然生理環(huán)境)或體外(即在實(shí)驗(yàn)室條件下)測量或觀察到的。例如，乙酰乳酸合酶的生物活性包括乙酰乳酸合酶的酶活性。對蛋白的修飾，例如在同系物或模擬物(mimetic)中的修飾(見下討論)，可導(dǎo)致蛋白具有與天然蛋白相同的生物活性，或?qū)е碌鞍拙哂信c天然蛋白相比降低或升高的生物活性。造成蛋白表達(dá)降低或蛋白活性降低的修飾，可被稱為蛋白的滅活(完全或部分)，下調(diào)，或作用減弱。類似地，造成蛋白表達(dá)升高或蛋白活性升高的修飾，可被稱為蛋白的擴(kuò)增，過量表達(dá)，活化，增強(qiáng)，上調(diào)，或作用增強(qiáng)。本發(fā)明乙酰乳酸合酶優(yōu)選在乙酰乳酸合酶同系物中出現(xiàn)的修飾，與天然乙酰乳酸合酶相比基本不變，或與天然蛋白相比至少基本不降低合酶的基本生物活性。然而，與天然形態(tài)相比，所述同系物在除蛋白的功能或酶活性外的性質(zhì)上有不同，如與天然蛋白相比，對某些化合物的抑制作用的敏感性降低。優(yōu)選，與衍生出同系物的天然乙酰乳酸合酶相比，天然乙酰乳酸合酶的同系物對結(jié)合并滅活天然乙酰乳酸合酶的化合物具有降低的(即減少的，減弱的)敏感性。例如，磺酰脲化合物，如sulfometttronmethyl(S匪)，通常對細(xì)胞有毒，因?yàn)樗鼈兡芙Y(jié)合并滅活乙酰乳酸合酶(ALS)。咪唑啉酮，triazolopyrimidines，和其它類似化合物(本文統(tǒng)稱咪唑啉酮類抑制劑)也顯示可結(jié)合并滅活A(yù)LS。因而，天然乙酰乳酸合酶的同系物優(yōu)選在保持乙酰乳酸合酶酶活性的同時(shí)，具有對磺酰脲化合物，和咪唑啉酮類抑制劑(例如，具有已遭破壞的此抑制劑的結(jié)合位點(diǎn)或具有對此抑制劑降低的親和力的結(jié)合位點(diǎn))，及對嘧啶基羥苯甲酸鹽，降低的敏感性。如本文所用，具有〃乙酰乳酸合酶生物活性〃或被稱為〃乙酰乳酸合酶〃的蛋白指催化纈氨酸，亮氨酸，和異亮氨酸生物合成第一種步的蛋白。更具體地，本發(fā)明的分離的乙酰乳酸合酶，包括全長蛋白，截短蛋白，融合蛋白和同系物，可通過蛋白催化從丙酮酸合成乙酰乳酸的能力來被直接鑒定。乙酰乳酸合酶生物活性可被本領(lǐng)域技術(shù)人員用適合的體外或體內(nèi)酶活性試驗(yàn)來評價(jià)?！獙?shí)施方案中，本發(fā)明乙酰乳酸合酶具有下述氨基酸序列，該序列與選自SEQIDNO:15，SEQIDNO:19，SEQIDNO:22，SEQIDNO:24的氨基酸序列，或上述任何序列的至少約600個(gè)氨基酸有至少約65%相同，其中所述蛋白為乙酰乳酸合酶(即具有乙酰乳酸合酶生物活性)。更優(yōu)選，本發(fā)明的乙酰乳酸合酶具有，與SEQIDN0:15，SEQIDN0:19，SEQIDNO:22或SEQIDNO:24任一，或者與SEQIDNO:15，SEQIDNO:19，SEQIDNO:22或SEQIDN0:24任一的至少約600個(gè)氨基酸有至少約70X相同，再更優(yōu)選至少約75X相同，再更優(yōu)選至少約80%相同，再更優(yōu)選至少約85%相同，再更優(yōu)選至少約90%相同，再更優(yōu)選至少約95%相同，再更優(yōu)選至少約96%相同，再更優(yōu)選至少約97%相同，再更優(yōu)選至少約98%相同，再更優(yōu)選至少約99%相同的氨基酸序列，其中所述蛋白具有乙酰乳酸合酶生物活性。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的乙酰乳酸合酶具有，與選自SEQIDN0:15，SEQIDNO:19，SEQIDNO:22，SEQIDNO:24的氨基酸序列，或所述任何序列的至少95個(gè)氨基酸，有至少約75%相同的氨基酸序列，其中所述蛋白為乙酰乳酸合酶(即具有乙酰乳酸合酶生物活性)。更優(yōu)選，本發(fā)明的乙酰乳酸合酶具有，與SEQIDNO:15，SEQIDNO:19，SEQIDN0:22或SEQIDN0:24，或SEQIDN0:15，SEQIDN0:19，SEQIDN0:22或SEQIDN0:24任一的至少95個(gè)氨基酸，至少約80%相同，再更優(yōu)選至少約85%相同，再更優(yōu)選至少約90%相同，再更優(yōu)選至少約95%相同，再更優(yōu)選至少約96%相同，再更優(yōu)選至少約97%相同，再更優(yōu)選至少約98%相同，再更優(yōu)選至少約99%相同的氨基酸序列，其中所述蛋白具有乙酰乳酸合酶生物活性。再更優(yōu)選，本發(fā)明的乙酰乳酸合酶具有下述氨基酸序列，該序列與SEQIDN0:15，SEQIDN0:19，SEQIDN0:22或SEQIDN0:24，或與SEQIDN0:15，SEQIDNO:19，SEQIDNO:22或SEQIDNO:24任一的至少100個(gè)氨基酸，再更優(yōu)選125，再更優(yōu)選150，再更優(yōu)選175，再更優(yōu)選200，再更優(yōu)選225，再更優(yōu)選250，再更優(yōu)選275，再更優(yōu)選300，再更優(yōu)選325，再更優(yōu)選350，再更優(yōu)選375，再更優(yōu)選400，再更優(yōu)選425，再更優(yōu)選450，再更優(yōu)選475，再更優(yōu)選500，再更優(yōu)選525，再更優(yōu)選550，再更優(yōu)選575個(gè)氨基酸，具有上述任一相同性百分比，其中所述蛋白具有乙酰乳酸合酶生物活性。如本文所用，除非另有說明，對于相同性百分?jǐn)?shù)(％)是指使用(l)用標(biāo)準(zhǔn)默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行BLAST2.0BasicBLAST同源性檢索，使用blastp進(jìn)行氨基酸檢索，blastn用于核酸檢索，通過默認(rèn)篩選查詢序列的低復(fù)雜性區(qū)域(在Altschul，S.F.，Madden,T.L.，Schaaffer，A.A.，Zhang，J.，Zhang，Z.，Miller，W.&Lipman，D.J.(1997)，"間隔的BLAST和PSI-BLAST:新產(chǎn)生的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索程序"。NucleicAcidsRes.25:3389-3402中描述，本文引用以其整體作為參考)；(2)BLAST2序列對比(使用下述參數(shù))；(3)和/或使用標(biāo)準(zhǔn)默認(rèn)參數(shù)的PSI-BLAST(位置特異性重復(fù)BLAST)進(jìn)行的同源性評估。應(yīng)注意由于BLAST2.0BasicBLAST和BLAST2之間在標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)上的一些區(qū)別，兩個(gè)特定序列使用BLAST2程序可能認(rèn)為具有明顯的同源性，而使用其中一個(gè)序列作為查詢序列以BLAST2.0BasicBLAST進(jìn)行檢索時(shí)在最匹配的序列中可能沒有鑒定出第二種個(gè)序列。另外，PSI-BLAST提供了一個(gè)"提問檔(profile)"檢索的自動的，容易使用的版本，它是尋找序列同源性的一個(gè)敏感途徑。該程序首先進(jìn)行有間隔的BLAST數(shù)據(jù)庫檢索。PSI-BLAST程序使用來自任何有效序列對比的信息返回構(gòu)建位置特異性記分矩陣，它代替查詢序列用于下一輪數(shù)據(jù)庫檢索。因此，應(yīng)明白可使用這些程序中的任一種測定相同性百分?jǐn)?shù)。使用Tatusova和Madden,(1999)，"Blast2序列_用于比較蛋白質(zhì)和核苷酸序列的一種新工具"，F(xiàn)EMSMicrobiolLett.174:247-250所述BLAST2序列可互相對比兩個(gè)具體序列，本文引用該文獻(xiàn)以其整體作為參考。使用BLAST2.O算法以blastp或blastn進(jìn)行BLAST2序列對比，在兩個(gè)序列之間進(jìn)行有間隔的BLAST檢索(BLAST2.0)允許在所得的序列對比中引入間隔(缺失和插入)。為了本文清楚的目的，使用如下標(biāo)準(zhǔn)默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行BLAST2序列對比。對于blastn，使用0BL0SUM62矩陣匹配得分=1錯(cuò)配罰分=-2空出間隔(5)和延伸間隔(2)罰分間隔—x下降(dropoff)(50)期望(expect)(10)序列大小(wordsize)(11)篩選(上)對于blastp，使用0BL0SUM62矩陣空出間隔(11)和延伸間隔(1)罰分18間隔_x下降(50)期望(10)序列大小(3)篩選(上)。本發(fā)明的乙酰乳酸合酶也能包括具有下述氨基酸序列的蛋白，所述氨基酸序列包含SEQIDN0:15，SEQIDN0:19，SEQIDN0:22或SEQIDNO:24任一的至少30個(gè)鄰接氨基酸殘基(即與SEQIDN0:15，SEQIDN0:19，SEQIDNO:22或SEQIDNO:24任一的30個(gè)鄰接氨基酸具有100%相同性的30個(gè)鄰接氨基酸殘基)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的乙酰乳酸合酶包括具有下述氨基酸序列的蛋白，所述氨基酸序列包含SEQIDN0:15，SEQIDN0:19，SEQIDN0:22或SEQIDNO:24任一的至少50，再更優(yōu)選至少75，再更優(yōu)選至少100，再更優(yōu)選至少115，再更優(yōu)選至少130，再更優(yōu)選至少150，再更優(yōu)選至少200，再更優(yōu)選，至少250，再更優(yōu)選，至少300，再更優(yōu)選，至少350，再更優(yōu)選，至少400，再更優(yōu)選，至少450，再更優(yōu)選，至少500，再更優(yōu)選，至少550，再更優(yōu)選，至少600，再更優(yōu)選，至少650，個(gè)鄰接氨基酸殘基。所述蛋白具有乙酰乳酸合酶生物活性。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"鄰接的"或"連續(xù)的"對于本文所述核酸或氨基酸序列是指以不中斷的序列相連。例如，對于第一種個(gè)序列含有第二種個(gè)序列的30個(gè)鄰接(或連續(xù))的氨基酸，是指第一種個(gè)序列包含與第二種個(gè)序列中30個(gè)氨基酸殘基的不中斷的序列具有100%相同性的30個(gè)氨基酸殘基的不中斷的序列。類似地，對于第一種個(gè)序列與第二種個(gè)序列具有"100%相同性"是指第一種個(gè)序列與第二種個(gè)序列完全匹配，在核苷酸或氨基酸之間沒有間隔。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的乙酰乳酸合酶(包括乙酰乳酸合酶同系物)，包括具有下述氨基酸序列的蛋白，所述氨基酸序列與天然乙酰乳酸合酶氨基酸序列足夠相似，以致于編碼該同系物的核酸序列在中等，高度，或極高嚴(yán)格條件(下文描述)下能夠雜交到(即，與其雜交)編碼天然乙酰乳酸合酶氨基酸序列的核酸分子(即，編碼天然乙酰乳酸合酶氨基酸序列的核酸鏈的互補(bǔ)鏈)上。優(yōu)選，乙酰乳酸合酶由這樣一種核酸序列編碼，該核酸序列在中等，高度或極高嚴(yán)格條件下與編碼下述蛋白質(zhì)的核酸序列雜交，所述蛋白質(zhì)含有由SEQIDNO:15，SEQIDNO:19，SEQIDNO:22或SEQIDNO:24中任一個(gè)代表的氨基酸序列。甚至更優(yōu)選，本發(fā)明的乙酰乳酸合酶由下述核酸序列編碼，該核酸序列在中等，高度或極高嚴(yán)格條件下與SEQIDNO:15的核苷酸1260-3314，SEQIDNO:18的核苷酸1260-3314，SEQIDNO:21的核苷酸1260-3314，或SEQIDNO:23的核苷酸1260-3314互補(bǔ)。該雜交條件見下詳述。編碼本發(fā)明的乙酰乳酸合酶的核酸序列的核酸序列互補(bǔ)指與編碼乙酰乳酸合酶的鏈互補(bǔ)的核酸鏈的核酸序列。理想的是，編碼給定氨基酸序列的雙鏈DNA，包含單鏈DNA并且它的互補(bǔ)鏈具有與單鏈DNA互補(bǔ)的序列。類似地，本發(fā)明的核酸分子可為雙鏈或單鏈，并且包括那些核酸分子，它們在嚴(yán)格雜交條件下與編碼氨基酸序列SEQIDNO:15，SEQIDNO:19，SEQIDNO:22或SEQIDNO:24的核酸序列，和/或與編碼任一此氨基酸序列的核酸序列互補(bǔ)，構(gòu)成穩(wěn)定雜交體。推定互補(bǔ)序列的方法對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是已知的。應(yīng)注意由于氨基酸測序和核酸測序技術(shù)不是完全無誤差的，因此本文提供的序列最多代表本發(fā)明的乙酰乳酸合酶的表觀序列。乙酰乳酸合酶同系物可以是天然等位基因變異或天然突變所致。本發(fā)明的乙酰乳酸合酶同系物也能用本領(lǐng)域已知技術(shù)產(chǎn)生，該技術(shù)包括，但不限于直接修飾所述蛋白，或者用，例如，經(jīng)典或重組DNA技術(shù)修飾編碼所述蛋白的基因，來造成隨機(jī)誘變或定點(diǎn)誘變。編碼乙酰乳酸合酶的核酸的一種天然等位基因變體是，與編碼氨基酸序列SEQIDN0:15的基因在基因組中基本相同的一或多個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)的基因，但其由于例如突變或重組造成的天然變異而具有相近但不相同的序列。天然等位基因變體通常編碼與相應(yīng)基因編碼的蛋白具有類似活性的蛋白。一類等位基因變體開編碼具有不同核酸序列(由于遺傳密碼簡并性)的相同蛋白。等位基因變體也開在該基因的5'或3'非翻譯區(qū)(例如，調(diào)控區(qū))包含變更。等位基因變體是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。本發(fā)明的乙酰乳酸合酶蛋白也包括基因融合體(例如，用于過度表達(dá)可溶性活性重組蛋白)，誘變基因(如帶有密碼子修飾以增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的基因)，和截短基因(如去除了膜結(jié)合結(jié)構(gòu)域以產(chǎn)生可溶性膜蛋白的基因，或去除了在特定重組宿主中耐受差的信號序列的基因)的表達(dá)產(chǎn)物。本發(fā)明蛋白和/或同系物的最小大小為足夠具有乙酰乳酸合酶生物活性的大小。優(yōu)選，本發(fā)明的蛋白為至少30個(gè)氨基酸長，再更優(yōu)選，至少約50，再更優(yōu)選至少75，再更優(yōu)選至少100，再更優(yōu)選至少115，再更優(yōu)選至少130，再更優(yōu)選至少150，再更優(yōu)選至少200，再更優(yōu)選，至少250，再更優(yōu)選，至少300，再更優(yōu)選，至少350，再更優(yōu)選，至少400，再更優(yōu)選，至少450，再更優(yōu)選，至少500，再更優(yōu)選，至少550，再更優(yōu)選，至少600，再更優(yōu)選，至少650，再更優(yōu)選，至少684個(gè)氨基酸長。對該蛋白的最大大小除了操作限制，沒有限制，因?yàn)樗龅鞍卓砂ㄒ阴Ｈ樗岷厦傅鞍椎囊徊糠只蛉L乙酰乳酸合酶，如果需要還可加上附加序列(例如，融合蛋白序列)。本發(fā)明也包括融合蛋白，它包括與一或多個(gè)融合節(jié)段結(jié)合的含有乙酰乳酸合酶的結(jié)構(gòu)域(即，根據(jù)本發(fā)明乙酰乳酸合酶的氨基酸序列)。本發(fā)明所用的適宜融合節(jié)段包括，但不限于具有下述功能的節(jié)段增強(qiáng)蛋白的穩(wěn)定性；提供其它所需生物活性；和/或輔助乙酰乳酸合酶的純化(例如，通過親和層析)。適宜的融合節(jié)段可以是具有所需功能的任何大小的結(jié)構(gòu)域(例如，賦予增加的穩(wěn)定性，溶解度，作用或生物活性；和/或簡化蛋白的純化)。融合節(jié)段可與所述蛋白上含乙酰乳酸合酶的結(jié)構(gòu)域的氨基和/或羧基末端相連，并易于剪切，以便直接回收乙酰乳酸合酶。融合蛋白優(yōu)選通過培養(yǎng)融合核酸分子轉(zhuǎn)染的重組細(xì)胞來產(chǎn)生，該融合核酸分子編碼的蛋白包括與含乙酰乳酸合酶的結(jié)構(gòu)域的氨基和/或羧基末端結(jié)合的融合節(jié)段。本發(fā)明也包括乙酰乳酸合酶的模擬物。本文中術(shù)語〃模擬物〃用于指能模擬天然肽的生物學(xué)作用的任何肽或非-肽化合物，通常是由于模擬物具有模擬天然肽基本結(jié)構(gòu)的基本結(jié)構(gòu)和/或具有天然肽的特征性生物學(xué)性質(zhì)。模擬物可包括，但不限于相對于原型具有實(shí)質(zhì)性(substantial)修飾的肽，如與天然肽無側(cè)鏈相似性(這樣的修飾可以，例如，降低它對降解作用的易感性)；抗獨(dú)特型和/或催化抗體，或其片段；分離的蛋白的非蛋白部分(例如，糖類結(jié)構(gòu))；或合成或天然的有機(jī)分子，包括，例如通過綜合(combinatorial)化學(xué)鑒定的核酸和藥物。此模擬物可用各種本領(lǐng)域已知方法設(shè)計(jì)，篩選和/或鑒定?？捎糜谠O(shè)計(jì)本發(fā)明所用的模擬物或其它治療性化合物的各種藥物設(shè)計(jì)方法，見Maulik等，1997，MolecularBiotechnology:TherapeuticApplicationsandStrategies,Wiley-Liss，Inc.，全文弓l入本文作為參考。乙酰乳酸合酶模擬物可從，例如，分子多樣性策略(相關(guān)策略的結(jié)合使得迅速構(gòu)建大的化學(xué)多樣分子文庫)獲得，從天然或合成化合物的文庫，特別是來自化學(xué)文庫或綜合文庫(即序列或大小不同但具有相似構(gòu)架的化合物文庫)的天然或合成化合物的20文庫獲得，或者通過合理的，直接的(directed)或隨機(jī)的藥物設(shè)計(jì)獲得。見例如，Maulik等.，見上文.在分子多樣性策略中，采用生物學(xué)，酶學(xué)和/或化學(xué)方法從，例如，肽，寡核苷酸，糖類和/或合成的有機(jī)分子合成大化合物文庫。發(fā)展分子多樣性策略的嚴(yán)格參數(shù)包括亞單位多樣性，分子大小，和文庫多樣性。篩選此類文庫的一般目的是，連續(xù)應(yīng)用綜合篩選來獲得對所需靶的高親和力配體，然后通過隨機(jī)設(shè)計(jì)或定向設(shè)計(jì)策略使所得分子最優(yōu)化。分子多樣性的方法見Maulik，等.，如上詳述。Maulik等還公開了，例如，定向設(shè)計(jì)方法，隨機(jī)設(shè)計(jì)方法，以及基于網(wǎng)格坐標(biāo)的方法。在定向設(shè)計(jì)中，使用者直接從適當(dāng)選擇的片段的片段文庫創(chuàng)建新分子；在隨機(jī)設(shè)計(jì)中，使用者使用遺傳或其他算法來隨機(jī)突變片段和它們的組合，同時(shí)應(yīng)用選擇標(biāo)準(zhǔn)來評估候選配體的吻合性；在基于網(wǎng)格坐標(biāo)的方法中，使用者計(jì)算三維受體結(jié)構(gòu)與小片段探針之間的相互作用能量，之后將所需的探針位置連接起來。根據(jù)本發(fā)明，乙酰乳酸合酶可來自任何破囊壺菌目微生物，尤其Schizochytrium屬任何微生物。在一實(shí)施方案中，優(yōu)選本發(fā)明的乙酰乳酸合酶具有選自SEQIDN0:15，SEQIDNO:19，SEQIDN0:22，或SEQIDNO:24的氨基酸序列。具有氨基酸序列SEQIDNO:15的蛋白是破囊壺菌目微生物的天然(即野生型)乙酰乳酸合酶，具體是Schizochytrium乙酰乳酸合酶。氨基酸序列SEQIDNO:19，SEQIDNO:22，SEQIDNO:24為修飾的序列，導(dǎo)致得到的酶，與氨基酸序列SEQIDNO:15所代表的天然蛋白相比，對磺酰脲化合物，咪唑啉酮類抑制劑和嘧啶基羥苯甲酸鹽的敏感性降低。應(yīng)注意，SEQIDNO:19，SEQIDNO:22和SEQIDN0:24所代表的蛋白具有乙酰乳酸合酶生物活性。對磺酰脲化合物，咪唑啉酮類抑制劑和嘧啶基羥苯甲酸鹽的敏感性降低的乙酰乳酸合酶是本發(fā)明優(yōu)選的乙酰乳酸合酶，因?yàn)榫幋a這類合酶的核酸序列可作為選擇性標(biāo)記物用于本發(fā)明的重組載體中。因而，本發(fā)明一實(shí)施方案涉及修飾的乙酰乳酸合酶，包括SEQIDNO:15，SEQIDNO:19，SEQIDNO:22和SEQIDNO:24任一的任何同系物，其中所述同系物具有乙酰乳酸合酶生物活性，尤其是，其中宿舍同系物與氨基酸序列SEQIDN0:15所代表的天然蛋白相比，對磺酰脲化合物，咪唑啉酮類抑制劑和嘧啶基羥苯甲酸鹽的敏感性降低。一方面，所述乙酰乳酸合酶同系物包括下述蛋白，它具有與SEQIDN0:15不同的氨基酸序列，該不同是由于在一或多個(gè)下述位置116G，117A，192P，200A，251K，358M，383D，592V，595W，或599F發(fā)生氨基酸缺失，插入或取代。這些位置對應(yīng)于酵母乙酰乳酸合酶中的已知ALS突變位點(diǎn)(即分別是116G，117A，192P，200A，251K，354M，379D，583V，586W，和59(F)(見Mazur和Falco，1989，An皿.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.40:441-470，全文引入本文作為參考)。其它可能的突變位點(diǎn)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，可根據(jù)其它生物的ALS中的成功氨基酸突變而知曉。將這些位點(diǎn)應(yīng)用于破囊壺菌目ALS中的對應(yīng)位點(diǎn)，也是本發(fā)明所包括的范圍。如上述，本發(fā)明部分基于轉(zhuǎn)化破囊壺菌微生物的重組構(gòu)建體的發(fā)現(xiàn)和產(chǎn)生。因而，本發(fā)明一實(shí)施方案涉及分離的核酸分子，它包含編碼破囊壺菌目乙酰乳酸合酶的核酸序列，和與其完全互補(bǔ)的核酸序列。編碼本發(fā)明乙酰乳酸合酶的核酸分子包括編碼上述任何乙酰乳酸合酶蛋白(包括同系物)的核酸分子。更具體的是，本發(fā)明一實(shí)施方案涉及分離的核酸分子，它包含的核酸序列編碼的蛋白具有與選自SEQIDNO:15，SEQIDNO:19，SEQIDN0:22，SEQIDNO:24的氨基酸序列，所述任一序列的至少約600個(gè)氨基酸，至少約65%相同的氨基酸序列，其中所述蛋白為乙酰乳酸合酶(即具有乙酰乳酸合酶生物活性)。更優(yōu)選，本發(fā)明分離的核酸分子具有編碼氨基酸序列的核酸序列，該氨基酸序列與SEQIDNO:15，SEQIDN0:19，SEQIDNO:22或SEQIDN0:24，或SEQIDN0:15，SEQIDNO:19，SEQIDN0:22或SEQIDNO:24任一的至少約600個(gè)氨基酸，有至少約70%相同，再更優(yōu)選，至少約75%相同，再更優(yōu)選至少約80%相同，再更優(yōu)選至少約85%相同，再更優(yōu)選至少約90%相同，再更優(yōu)選至少約95%相同，再更優(yōu)選至少約96%相同，再更優(yōu)選至少約97%相同，再更優(yōu)選至少約98%相同，再更優(yōu)選至少約99%相同，其中所述蛋白具有乙酰乳酸合酶生物活性。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的核酸分子具有編碼氨基酸序列的核酸序列，該氨基酸序列與選自SEQIDNO:15，SEQIDNO:19，SEQIDNO:22，SEQIDNO:24的氨基酸序列，任一所述序列的超過至少95氨基酸，至少約75%相同，其中所述蛋白為乙酰乳酸合酶(即具有乙酰乳酸合酶生物活性)。更優(yōu)選，本發(fā)明的分離的核酸分子具有編碼氨基酸序列核酸序列，該氨基酸序列與SEQIDN0:15，SEQIDN0:19，SEQIDN0:22或SEQIDNO:24任一，或與SEQIDNO:15，SEQIDNO:19，SEQIDN0:22或SEQIDN0:24任一的至少95個(gè)氨基酸，有至少約80%相同，再更優(yōu)選至少約85%相同，再更優(yōu)選至少約90%相同，再更優(yōu)選至少約95%相同，再更優(yōu)選至少約96%相同，再更優(yōu)選至少約97%相同，再更優(yōu)選至少約98%相同，再更優(yōu)選至少約99%相同，其中所述蛋白具有乙酰乳酸合酶生物活性。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的核酸分子具有編碼下述氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列具有SEQIDN0:15，SEQIDN0:19，SEQIDN0:22或SEQIDN0:24，或SEQIDNO:15，SEQIDNO:19，SEQIDNO:22或SEQIDNO:24任一的至少100個(gè)氨基酸，再更優(yōu)選125，再更優(yōu)選150，再更優(yōu)選175，再更優(yōu)選200，再更優(yōu)選225，再更優(yōu)選250，再更優(yōu)選275，再更優(yōu)選300，再更優(yōu)選325，再更優(yōu)選350，再更優(yōu)選375，再更優(yōu)選400，再更優(yōu)選425，再更優(yōu)選450，再更優(yōu)選475，再更優(yōu)選500，再更優(yōu)選525，再更優(yōu)選550，再更優(yōu)選575個(gè)氨基酸，其中所述蛋白具有乙酰乳酸合酶生物活性。相同性百分比如上述用BLAST2.0BasicBLAST默認(rèn)參數(shù)來確定?！獙?shí)施方案中，編碼本發(fā)明的乙酰乳酸合酶的核酸分子包括分離的核酸分子，它在中等嚴(yán)格條件，再更優(yōu)選在高度嚴(yán)格條件，再更優(yōu)選在極高嚴(yán)格條件與編碼天然乙酰乳酸合酶的核酸序列的互補(bǔ)鏈雜交。優(yōu)選，編碼本發(fā)明的乙酰乳酸合酶的分離的核酸分子包含核酸序列，它在中等或高度嚴(yán)格條件與編碼包含氨基酸序列SEQIDNO:15，SEQIDNO:19，SEQIDN0:22或SEQIDNO:24的蛋白的核酸序列的互補(bǔ)鏈雜交。在一實(shí)施方案中，分離的核酸分子包含下述核酸序列，它在中等，高度或極高嚴(yán)格條件下與SEQIDNO:14的核苷酸1260-3314，SEQIDNO:18的核苷酸1260-3314，SEQIDNO:21的核苷酸1260-3314，和SEQIDNO:23的核苷酸1260-3314所示核酸序列的互補(bǔ)序列雜交。本文使用的雜交條件是指標(biāo)準(zhǔn)雜交條件，在該條件下使用核酸分子鑒定相似的核酸分子。該標(biāo)準(zhǔn)條件在例如，Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryMa皿al，ColdSpringHarborLabsPress,1989中公開。Sambrook等，出處同上，在本文中引用以其整體作為參考(具體參見，第9.31-9.62頁)。另外，計(jì)算合適的雜交和洗滌條件以完成允許各種程度的核苷酸錯(cuò)配的雜交的公式在例如，Meinkoth等，1984，Anal.Biochem.138,267-284中公開；Meinkoth等，出處同上，在本文中引用以其整體作為參考。22更具體地說，本文提及的中等嚴(yán)格的雜交和洗滌條件是指在雜交反應(yīng)中允許分離與用于探測的核酸分子具有至少約70%的核酸序列相同性的核酸分子的條件(即，允許約30%或更少的核苷酸錯(cuò)配的條件)。本文提及的高度嚴(yán)格的雜交和洗滌條件是指在雜交反應(yīng)中允許分離與用于探測的核酸分子具有至少約80%的核酸序列相同性的核酸分子的條件(即，允許約20%或更少的核苷酸錯(cuò)配的條件)。本文提及的極高嚴(yán)格的雜交和洗滌條件是指在雜交反應(yīng)中允許分離與用于探測的核酸分子具有至少約90%的核酸序列相同性的核酸分子的條件(即，允許約10%或更少的核苷酸錯(cuò)配的條件)。如上所述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用Meinkoth等，出處同上中的公式計(jì)算合適的雜交和洗滌條件以達(dá)到這些特定的核苷酸錯(cuò)配水平。該條件可依賴于形成的是DNA:RNA還是DNA:DNA雜交體而變化。計(jì)算的DNA:DNA雜交體的解鏈溫度比DNA:RNA雜交體低l(TC。在具體實(shí)施方案中，DNA:DNA雜交體的嚴(yán)格雜交條件包括在6XSSC(0.9MNa+)的離子強(qiáng)度下在約2(TC和約35。C之間(低度嚴(yán)格)，更優(yōu)選的是，在約2『C和約4(TC之間(更嚴(yán)格)，且甚至更優(yōu)選的是，在約35t:和約45t:之間(甚至更嚴(yán)格)的溫度下，在合適的洗滌條件下的雜交。在具體實(shí)施方案中，DNA:RNA雜交體的嚴(yán)格雜交條件包括在6XSSC(0.9MNa+)的離子強(qiáng)度下在約3(TC和約45°C之間，更優(yōu)選的是，在約38t:和約5(TC之間，且甚至更優(yōu)選的是，在約45t:和約55t:之間的溫度下，以同樣嚴(yán)格的洗滌條件的雜交。這些值根據(jù)大于約100個(gè)核苷酸，0%甲酰胺和約40%的G+C含量的分子的解鏈溫度計(jì)算。另外，可按Sambrook等，出處同上，第9.31至9.62頁提供的經(jīng)驗(yàn)計(jì)算Tm值。一般來說，洗滌條件應(yīng)當(dāng)盡可能嚴(yán)格，且對于選定的雜交條件應(yīng)是合適的。例如，雜交條件可包括鹽和溫度條件的組合，該溫度比計(jì)算的特定雜交體的Tm低約20-25t:，且洗滌條件一般包括鹽和溫度條件的組合，該溫度比計(jì)算的特定雜交體的Tm低約12-2(TC。適用于DNA:DNA雜交體的雜交條件的一個(gè)例子包括在6XSSC(50%甲酰胺)中在約42t:下雜交2-24小時(shí)，接著進(jìn)行洗滌步驟，包括在室溫下在約2XSSC中的一次或多次洗滌，接著在更高溫度和更低離子強(qiáng)度下進(jìn)一步洗滌(例如，在約37t:下在約0.1X-0.5XSSC中洗滌至少一次，接著在約68t:下在約0.1X-0.5XSSC中洗滌至少一次)。在另一實(shí)施方案中，編碼本發(fā)明乙酰乳酸合酶的核酸分子包括含下述核酸序列的分離的核酸分子，該核酸序列編碼的氨基酸序列具有包含SEQIDN0:15，SEQIDN0:19，SEQIDNO:22或SEQIDNO:24任一的至少30個(gè)鄰接氨基酸殘基的蛋白，(即與SEQIDNO:15，SEQIDNO:19，SEQIDNO:22或SEQIDNO:24任一的30個(gè)鄰接氨基酸具有100%相同性的30個(gè)鄰接氨基酸殘基)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，分離的核酸分子包含編碼下述蛋白的核酸序列，該蛋白具有的氨基酸序列包含SEQIDNO:15，SEQIDNO:19，SEQIDNO:22或SEQIDNO:24任一的至少50個(gè)，再更優(yōu)選至少75，再更優(yōu)選至少100，再更優(yōu)選至少115，再更優(yōu)選至少130，再更優(yōu)選至少150，再更優(yōu)選至少200，再更優(yōu)選，至少250，再更優(yōu)選，至少300，再更優(yōu)選，至少350，再更優(yōu)選，至少400，再更優(yōu)選，至少450，再更優(yōu)選，至少500，再更優(yōu)選，至少550，再更優(yōu)選，至少600，再更優(yōu)選，至少650，個(gè)鄰接氨基酸殘基。所述蛋白具有乙酰乳酸合酶生物活性。在一實(shí)施方案中，編碼乙酰乳酸合酶的分離的核酸分子包含一種核酸序列，該核酸序列具有SEQIDNO:15的核苷酸1260-3314，SEQIDN0:18的核苷酸1260-3314，SEQIDNO:21的核苷酸1260-3314，和SEQIDNO:23的核苷酸1260-3314的至少60個(gè)鄰接的核苷酸，再更優(yōu)選至少150，再更優(yōu)選至少225，再更優(yōu)選至少300，再更優(yōu)選至少345，再更優(yōu)選至少390，再更優(yōu)選至少450，再更優(yōu)選至少525，再更優(yōu)選至少600，再更優(yōu)選至少750，再更優(yōu)選至少900，再更優(yōu)選至少1050，再更優(yōu)選至少1200，再更優(yōu)選至少1350，再更優(yōu)選至少1500，再更優(yōu)選至少1650，再更優(yōu)選至少1800，再更優(yōu)選至少1950，個(gè)鄰接的核苷酸。本發(fā)明特別優(yōu)選的核酸分子包括SEQIDNO:14的核苷酸1260-3314(編碼SEQIDN0:15)，SEQIDNO:18的核苷酸1260-3314(編碼SEQIDN0:19)，SEQIDNO:21的核苷酸1260-3314(編碼SEQIDN0:22)，或SEQIDNO:23的核苷酸1260-3314(編碼SEQIDNO:24)，SEQIDNO:14，SEQIDNO:18，SEQIDNO:21或SEQIDNO:23。根據(jù)本發(fā)明，分離的核酸分子是從其天然環(huán)境中取出(即，對其進(jìn)行了人工操作)的核酸分子，其天然環(huán)境是天然狀態(tài)下發(fā)現(xiàn)該核酸分子的基因組或染色體。因此，"分離的"不必反映該核酸分子被純化的程度，但是表明該核酸分子不包括天然狀況下發(fā)現(xiàn)該核酸分子的完整基因組或完整染色體。分離的核酸分子可包括基因。包括基因的分離的核酸分子不是包括該基因的染色體的一個(gè)片段，而是包括編碼區(qū)和與該基因相關(guān)的調(diào)控區(qū)，但是沒有在同一染色體中天然發(fā)現(xiàn)的其它基因。分離的核酸分子也可包括一種特定的核酸序列，其側(cè)翼(即，在該序列的5'和/或3'端)為天然狀況下一般不是該特定核酸序列側(cè)翼的其它核酸(即，異源序列)。分離的核酸分子可包括DNA，RNA(即，mRNA)，或DNA或RNA之一的衍生物(例如，cDNA)。盡管短語"核酸分子"主要是指物理學(xué)核酸分子且短語"核酸序列"主要是指核酸分子上的核苷酸序列，但是兩個(gè)短語可交換使用，特別是對于能編碼蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域的核酸分子或核酸序列。優(yōu)選，本發(fā)明的分離的核酸分子用重組DNA技術(shù)(例如，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增，克隆)或化學(xué)合成來產(chǎn)生。分離的核酸分子包括天然的核酸分子及其同系物，包括，但不限于，天然等位基因變異體和修飾的核酸分子，其中的核苷酸以這樣的方式插入，缺失，取代，和/或顛倒，即該修飾對蛋白的生物學(xué)活性產(chǎn)生了所需的影響。蛋白質(zhì)同系物(例如，由核酸同系物編碼的蛋白質(zhì))在上文中已有詳細(xì)討論?？墒褂帽绢I(lǐng)域的技術(shù)人員已知的許多方法來產(chǎn)生核酸分子同源物(參見，例如，Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLabsPress,1989)。例如，可使用各種技術(shù)修飾核酸分子，該技術(shù)包括，但不限于，傳統(tǒng)誘變技術(shù)和重組DNA技術(shù)，例如定點(diǎn)誘變，化學(xué)處理核酸分子以誘導(dǎo)突變，限制性酶裂解核酸片段，連接核酸片段，核酸序列選定區(qū)域的PCR擴(kuò)增和/或誘變，合成寡核苷酸混合物并連接混合物組以"構(gòu)建"核酸分子的混合體及其組合。通過篩選核酸編碼的蛋白質(zhì)的功能和/或通過與野生型基因雜交可從修飾的核酸混合物中選擇核酸分子同源物。類似地，本發(fā)明核酸分子大小的最小值是足夠編碼具有所需生物活性的蛋白，或足夠構(gòu)成能與編碼天然蛋白的核酸分子的互補(bǔ)序列(例如，在中等，高度或極高嚴(yán)格條件下)構(gòu)成穩(wěn)定雜交體的探針或寡核苷酸引物的大小。因此，編碼所述蛋白的核酸分子的大小取決于核酸組成、該核酸分子與互補(bǔ)序列間的同源性或相同性百分比，以及雜交條件本身(例如，溫度，鹽濃度，和甲酰胺濃度)。用作寡核苷酸引物或探針的核酸分子大小的最小值一般是如果該核酸分子富含GC則為至少約12個(gè)到約15個(gè)核苷酸的長度且如果它們富含AT則為至少約15到約18個(gè)堿基的長度。對本發(fā)明的核酸分子大小的最大值沒有限制，實(shí)際的限制是該核酸分子可包括蛋白_編碼序列(例如，乙酰乳酸合酶_編碼序列)的部分或編碼全長蛋白的核酸序列。本發(fā)明一實(shí)施方案包括用于轉(zhuǎn)化破囊壺菌目微生物的重組載體。根據(jù)本發(fā)明，重組載體是一種改造的(即，人工產(chǎn)生的)核酸分子，它用作處理選定核酸序列并將該核酸序列導(dǎo)入宿主細(xì)胞的工具。因此重組載體適用于克隆，測序，和/或處理選定的核酸序列，例如通過表達(dá)和/或傳遞選定的核酸序列到宿主細(xì)胞中以形成重組細(xì)胞。該載體一般含有異源核酸序列，異源核酸序列是天然狀況下未發(fā)現(xiàn)與需要克隆或傳遞的核酸序列相連的核酸序列，盡管該載體也可含有天然狀況下發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明的核酸分子相連的或者用于表達(dá)本發(fā)明的核酸分子的調(diào)控核酸序列(例如，啟動子，非翻譯區(qū))(下面詳細(xì)討論)。該載體可以是RNA或者是DNA，是原核的或者真核的，且一般是一種質(zhì)粒。該載體可作為染色體外因子(例如，質(zhì)粒)維持或者可整合進(jìn)重組生物(例如，微生物或植物)的染色體中。該完整載體可在宿主細(xì)胞內(nèi)適當(dāng)保留，或者在某些情況下，可刪除質(zhì)粒DNA，留下本發(fā)明的核酸分子。整合的核酸分子可受染色體的啟動子的控制，受天然或質(zhì)粒啟動子控制，或受數(shù)個(gè)啟動子的結(jié)合的控制。所述核酸分子的單或多拷貝可整合到染色體。本發(fā)明的重組載體包含根據(jù)本發(fā)明的破囊壺菌目微生物的至少一選擇性標(biāo)記物，如編碼破囊壺菌目乙酰乳酸合酶(天然蛋白或同系物)的核酸序列或編碼ble基因的核酸序列(下述)。如本文所用，術(shù)語〃重組核酸分子〃主要用于指連接到重組載體中，需要經(jīng)過克隆、操作、轉(zhuǎn)化而進(jìn)入宿主細(xì)胞的核酸序列(即插入子)。—般來說，重組核酸分子包括與一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列可操作地相連的至少一個(gè)本發(fā)明的核酸分子。本文所用的短語"重組分子"或"重組核酸分子"主要是指與轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列可操作地相連的核酸分子或核酸序列，但是當(dāng)核酸分子是本文討論的重組分子時(shí)，上述短語可與短語"核酸分子"交換使用。根據(jù)本發(fā)明，短語"可操作地相連"是指核酸分子與轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列以這樣的方式相連，即該連接使得該分子轉(zhuǎn)染(即，轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)染，接合或?qū)?進(jìn)宿主細(xì)胞時(shí)能夠表達(dá)。轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列是控制轉(zhuǎn)錄開始，延長，或終止的序列。特別重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列是那些控制轉(zhuǎn)錄開始的序列，例如啟動子，增強(qiáng)子，操縱子和阻抑序列。合適的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列包括在該重組核酸分子導(dǎo)入的宿主細(xì)胞或生物體中能起作用的任何轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。相信本發(fā)明人是第一個(gè)分離并鑒定了至少三種這樣的啟動子，如本文其它處所詳述。優(yōu)選啟動子包括，但不限于，破囊壺菌目乙酰乳酸合酶啟動子(本文用SEQIDNO:14的核苷酸1-1259表示)，破囊壺菌目a-微管蛋白啟動子(本文用SEQIDNO:9的核苷酸441-894來表示)，來自破囊壺菌目聚酮化合物合酶(PKS)系統(tǒng)的啟動子(包含在SEQIDN0:34中)，和破囊壺菌目脂肪酸脫氫酶啟動子(包含在SEQIDN0:31中；應(yīng)注意，脂肪酸脫氫酶啟動子指美國臨時(shí)專利申請60/284，116的脫氫酶啟動子，見上文)。a_微管蛋白啟動子，乙酰乳酸合酶啟動子，和脂肪酸脫氫酶啟動子的克隆和測序在實(shí)施例部分?jǐn)⑹?。在?yōu)選實(shí)施方案中，a-微管蛋白啟動子包含天然破囊壺菌a-微管蛋白啟動子序列(SEQIDNO:9的核苷酸441-894)，或與SEQIDNO:9的核苷酸441-894至少95%相同的核酸序列，其中該啟動子具有至少基本的a-微管蛋白啟動子轉(zhuǎn)錄活性。類似地，優(yōu)選乙酰乳酸合酶啟動子包含天然破囊壺菌乙酰乳酸合酶啟動子的核酸序列(在SEQIDN0:14核苷酸1-1259中表示)，或與SEQIDNO:14核苷酸l-1259至少75%，再更優(yōu)選80%，再更優(yōu)選85%，再更優(yōu)選90%，再更優(yōu)選95%相同的核酸序列，其中所述啟動子具有至少基本的乙酰乳酸合酶啟動子轉(zhuǎn)錄活性。優(yōu)選PKS啟動子包含天然破囊壺菌目PKS啟動子的核酸序列(在SEQIDNO:34中表示)，或與SEQIDNO:34至少75%，再更優(yōu)選80%，再更優(yōu)選85%，再更優(yōu)選90%，再更優(yōu)選95%相同的核酸序列，其中所述啟動子具有至少基本的PKS啟動子轉(zhuǎn)錄活性。最后，優(yōu)選脂肪酸脫氫酶啟動子包含天然破囊壺菌目脂肪酸脫氫酶啟動子的核酸序列(在SEQIDNO:31中表示)，或被包含在與SEQIDNO:31至少75%，再更優(yōu)選80%，再更優(yōu)選85%，再更優(yōu)選90%，再更優(yōu)選95%相同的核酸序列中，其中所述啟動子具有至少基本的脂肪酸脫氫酶啟動子轉(zhuǎn)錄活性。確定百分比相同性的方法已在前面針對本文乙酰乳酸合酶序列敘述，并為本文所包括。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組載體為表達(dá)載體。本文所用的短語"表達(dá)載體"用于指適合于產(chǎn)生編碼產(chǎn)物(例如，目的蛋白)的載體。在該實(shí)施方案中，將編碼需要產(chǎn)生的蛋白的核酸序列插入重組載體中以產(chǎn)生重組核酸分子。編碼需要產(chǎn)生的蛋白的核酸序列以這樣的方式插入載體中，即將該核酸序列與載體中的調(diào)控序列(例如，本發(fā)明的破囊壺菌目啟動子)可操作地連接使得能夠在重組宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯該核酸序列。本發(fā)明的選擇性標(biāo)記物確保能選出成功引入了本發(fā)明重組核酸分子的重組微生物。在另一實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的重組核酸分子的重組載體是一種定向載體。本文所用的短語"定向載體"用于指這樣一種載體，即它用于將特定核酸分子傳遞進(jìn)重組宿主細(xì)胞，其中該核酸分子用于刪除或滅活宿主細(xì)胞或微生物內(nèi)的內(nèi)源性基因(即，用于定向基因破壞或敲除技術(shù))。該載體本領(lǐng)域也稱為"敲除"載體。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面，該載體的一部分，但更典型的是插入載體中的核酸分子(即，插入片段)具有與宿主細(xì)胞中靶基因(即，刪除或失活針對的基因)的核酸序列同源的核酸序列。載體插入片段的核酸序列設(shè)計(jì)成與靶基因結(jié)合以便靶基因與插入片段進(jìn)行同源重組，從而刪除，滅活或減弱該內(nèi)源性靶基因(即，通過突變或刪除至少一部分內(nèi)源性靶基因)。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明優(yōu)選的重組載體為適宜用在破囊壺菌目微生物中，并包括編碼本發(fā)明乙酰乳酸合酶分子的核酸序列的重組載體。優(yōu)選，所述乙酰乳酸合酶相對于天然形式(SEQIDNO:15)已被修飾，致使所述合酶賦予該重組載體所轉(zhuǎn)染的破囊壺菌目微生物對磺酰脲化合物，咪唑啉酮類抑制劑和/或嘧啶基羥苯甲酸鹽降低的敏感性。優(yōu)選，該重組載體包含編碼乙酰乳酸合酶蛋白的核酸序列，該蛋白包含與SEQIDN0:15不同的氨基酸序列，該不同是由于在一或多個(gè)下述位置116G，117A，192P，200A，251K，358M，383D，592V，595W，或599F發(fā)生氨基酸缺失，插入或取代。一實(shí)施方案中，所述乙酰乳酸合酶蛋白具有包括，但不限于SEQIDN0:19，SEQIDN0:22和SEQIDNO:24的氨基酸序列。優(yōu)選，所述重組載體包含選自下列的核酸序列SEQIDNO:18的核苷酸1260-3314，SEQIDNO:21的核苷酸1260-3314，和SEQIDNO:23的核苷酸1260-3314。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含賦予所需抗性的ALS-編碼核酸序列的重組載體包括SEQIDNO:18，SEQIDNO:21和SEQIDNO:23。在一實(shí)施方案中，適宜賦予用所述重組載體轉(zhuǎn)染的破囊壺菌目微生物對磺酰脲化合物，咪唑啉酮類抑制劑和/或嘧啶基羥苯甲酸鹽降低的敏感性的重組載體，包含SEQIDNO:15，這是天然Schizochytrium乙酰乳酸合酶序列。在本實(shí)施方案中，所述重組載體被設(shè)計(jì)成過度表達(dá)天然合酶，而此過度表達(dá)具有賦予微生物對特定的化合物的抗性的效應(yīng)。在本實(shí)施方案中，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將預(yù)料到使用重組DNA技術(shù)通過操縱例如，宿主細(xì)胞內(nèi)核酸分子的拷貝數(shù)，轉(zhuǎn)錄這些核酸分子的效率，翻譯所得轉(zhuǎn)錄子的效率，和翻譯后修飾的效率可改進(jìn)轉(zhuǎn)染的核酸分子的表達(dá)調(diào)控。另外，可遺傳改造啟動子序列以便與天然啟動子相比表達(dá)水平提高。用于控制核酸分子表達(dá)的重組技術(shù)包括，但不限于，將該核酸分子整合進(jìn)一個(gè)或多個(gè)宿主細(xì)胞染色體中，給質(zhì)粒添加載體穩(wěn)定性序列，取代或修飾轉(zhuǎn)錄控制信號(例如，啟動子，操縱子，增強(qiáng)子)，取代或修飾翻譯控制信號(例如，核糖體結(jié)合位點(diǎn)，Shine-Dalgarno序列)，修飾核酸分子以符合該宿主細(xì)胞的密碼子用法，和除去使轉(zhuǎn)錄子不穩(wěn)定的序列。本發(fā)明一實(shí)施方案中，適于轉(zhuǎn)化破囊壺菌目微生物的重組載體，包含來自印度斯坦鏈異壁菌的Shble基因作為選擇性標(biāo)記物(它編碼〃博來霉素_結(jié)合蛋白)，以及如本文上述的破囊壺菌目啟動子。優(yōu)選的重組載體包含ble基因和破囊壺菌目啟動子，包括，例如，SEQIDN0:8或9所示載體序列。印度斯坦鏈異壁菌博來霉素_結(jié)合蛋白的氨基酸序列在本文為SEQIDNO:10。本發(fā)明的重組核酸分子也可含有其它調(diào)控序列，例如翻譯調(diào)控序列，復(fù)制起點(diǎn)，和與該重組細(xì)胞相適應(yīng)的其它調(diào)控序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，包括整合進(jìn)宿主細(xì)胞染色體中的那些分子的本發(fā)明的重組分子還含有分泌信號(即，信號片段核酸序列)以便使得表達(dá)的蛋白質(zhì)從產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的細(xì)胞中分泌出來。合適的信號片段包括天然狀況下與表達(dá)該蛋白質(zhì)相關(guān)的信號片段或者能夠指導(dǎo)根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)分泌的任何異源性信號片段。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組分子包含使得表達(dá)蛋白能夠傳遞到宿主細(xì)胞膜上并插入膜中的前導(dǎo)序列。合適的前導(dǎo)序列包括天然狀況下與該蛋白質(zhì)相關(guān)的前導(dǎo)序列，或者能夠指導(dǎo)該蛋白質(zhì)傳遞并插入細(xì)胞膜中的任何異源性前導(dǎo)序列。在描述了各種可用于轉(zhuǎn)化破囊壺菌目微生物的工具以后，本發(fā)明一實(shí)施方案涉及破囊壺菌目微生物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化方法。所述方法包括第一種步(a)將本文上述重組核酸分子引入破囊壺菌目微生物細(xì)胞。所述重組核酸分子包含編碼乙酰乳酸合酶的核酸序列，所述乙酰乳酸合酶賦予該細(xì)胞對選自如下的化合物降低的敏感性磺酰脲化合物，咪唑啉酮類抑制劑，和嘧啶基羥苯甲酸鹽。所述乙酰乳酸合酶已在上文中詳述，它包括具有氨基酸序列SEQIDNO:19，SEQIDNO:22或SEQIDNO:24，及任一所述序列或上述SEQIDNO:15的同系物的乙酰乳酸合酶。此方法包括第二種步(b)選擇已用所述重組核酸分子成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，方法是在包含至少一抑制未轉(zhuǎn)化細(xì)胞的化合物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)(a)的細(xì)胞，所述化合物選自下述磺酰脲化合物，咪唑啉酮類抑制劑，和嘧啶基羥苯甲酸鹽。在此類化合物存在時(shí)能夠生長的細(xì)胞已被成功轉(zhuǎn)化。本方法所用重組核酸分子包含本文上述任一種本發(fā)明重組載體，并通常包括至少一種編碼重組細(xì)胞(即包含重組表達(dá)載體)產(chǎn)生的蛋白的核酸序列，或用于在重組細(xì)胞(即包含重組靶向載體)中定點(diǎn)去除或滅活內(nèi)源基因的核酸序列?！獙?shí)施方案中，所述重組核酸分子還包含編碼由所述細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白的核酸序列，其中編碼所述蛋白的所述核酸序列與轉(zhuǎn)錄控制序列可操作性連接。希望在破囊壺菌目中產(chǎn)生的蛋白對本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，并且全部為本發(fā)明所包括。特別優(yōu)選的蛋白包括，但不限于與選自二十二碳六烯酸(DHA)，二十二碳五烯酸(DPA)，二十碳五烯酸(EPA)和二十碳四烯酸(ARA)的脂肪酸的合成相關(guān)的蛋白。此類蛋白包括，例如，脂肪酸合酶，脂肪酸脫氫酶，脂肪酸延伸酶，與聚酮化合物合酶復(fù)合體相關(guān)的蛋白，以及與將脂肪酸摻入磷脂或三甘油酯分子相關(guān)的蛋白。一方面，所述蛋白為核酸序列SEQIDN0:29編碼的"_3脂肪酸脫氫酶。SEQIDN0:30表示該脫氫酶的氨基酸序列。另一方面，所述蛋白為多烯脂肪酸異構(gòu)酶。一實(shí)施方案中，可用本方法在破囊壺菌目微生物中產(chǎn)生的蛋白，包括與類異戊二烯生物合成途徑相關(guān)的蛋白。所述蛋白包括，但不限于HMG-CoA合酶，HMG-CoA還原酶，角鯊烯合酶，八氫番茄紅素合酶，八氫番茄紅素脫氫酶，類胡蘿卜素環(huán)化酶，類胡蘿卜素羥化酶，類胡蘿卜素酮酶。在另一實(shí)施方案中，可用本方法在破囊壺菌目微生物中產(chǎn)生的蛋白包括，但不限于維生素E和硫辛酸?！獙?shí)施方案中，本發(fā)明方法所用重組核酸分子包括與微生物內(nèi)靶核酸序列雜交的核酸序列，從而包含該靶核酸序列的基因通過與所述第二種核酸序列同源重組而突變或滅活。此類核酸序列可與下述基因同源編碼飽和和多聚不飽和的脂肪酸合成途徑的酶的基因(或調(diào)控所述基因表達(dá)的核酸)，編碼參與破囊壺菌目微生物產(chǎn)生的其它有價(jià)值的化合物的降解或者減低所需化合物的價(jià)值的蛋白的基因，或編碼與化合物合成相關(guān)的蛋白的基因，該化合物合成與其它目的分子有競爭。例如，耙核酸序列包括，但不限于編碼下述蛋白的序列脂肪酶，脂肪酸氧化酶，參與糖類合成的蛋白，參與類異戊二烯途徑產(chǎn)物合成的蛋白，參與細(xì)胞壁組分合成的蛋白，參與飽和脂肪酸合成途徑的蛋白，參與多聚不飽和脂肪酸合成途徑的蛋白，與聚酮化合物合酶復(fù)合體相關(guān)的蛋白和與將脂肪酸摻入磷脂或三甘油酯分子相關(guān)的蛋白。本發(fā)明一實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)化破囊壺菌目微生物的方法包括向細(xì)胞引入至少一種附加的重組核酸分子的步驟，所述分子包含編碼要表達(dá)蛋白的核酸序列，該核酸序列與轉(zhuǎn)錄控制序列可操作性連接?；蛘?，所述附加的重組核酸分子可包括與所述微生物中靶核酸序列雜交的第二種核酸序列，從而包含該靶核酸序列的基因通過與第二種核酸序列同源重組而突變或滅活。這樣一來，有可能將多個(gè)蛋白引入細(xì)胞，和/或滅活多個(gè)基因。所述附加的重組核酸分子可與第一種重組核酸分子同時(shí)引入破囊壺菌目微生物(即共轉(zhuǎn)化)，或作為后來的轉(zhuǎn)化(例如，為〃堆積〃性狀的目的)。—實(shí)施方案中，所述方法還包括向細(xì)胞引入至少一種附加的包含編碼博來霉素_結(jié)合蛋白的核酸序列的重組核酸分子的步驟。在本實(shí)施方案中，該附加的重組核酸分子優(yōu)選在后續(xù)步驟中引入，而不是進(jìn)行共轉(zhuǎn)化。優(yōu)選，所述包含編碼博來霉素-結(jié)合蛋白的核酸序列的重組核酸分子還包含編碼第二種被細(xì)胞表達(dá)的蛋白的核酸序列，其中所述編碼第二種蛋白的核酸序列可操作性連接到轉(zhuǎn)錄控制序列?；蛘?，或另外，所述包含編碼博來霉素-結(jié)合蛋白的核酸序列的重組核酸分子還包含與該微生物中靶核酸序列雜交的第二種核酸序列，從而包含該靶核酸序列的基因通過與第二種核酸序列同源重組而突變或滅活。一實(shí)施方案中，此重組核酸分子包含核酸序列SEQIDNO:9。適宜用本發(fā)明方法轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞包括，但不限于任何破囊壺菌目微生物。宿主細(xì)胞可為未轉(zhuǎn)化細(xì)胞或已轉(zhuǎn)染了至少一種核酸分子的細(xì)胞。本發(fā)明所用優(yōu)選宿主細(xì)胞包括來自下列屬的微生物包括，但不限于破囊壺菌屬，Labyrinthuloides屬，J即onochytrium屬，禾PSchizochytrium屬。這些屬中優(yōu)選的種的包括，但不限于任何Schizochytrium禾中，包括Schizochytriumaggregatum，Schizochytriumlimacinum，Schizochytriumzninutum;任何石皮囊壺菌禾中(包括前Ulkenia禾中如U.visurgensis，U.amoeboida，U.sarkariana，U.profunda,U.radiata，U.分鐘uta禾口Ulkeniasp.BP-5601)，并包括Thraustochytri咖striatum,Thraustochytri咖aure咖，Thraustochytriumroseum;禾口任何Japonochytrium禾中。特另U優(yōu)選破囊壺菌目菌株包括，但不限于:Schizochytriumsp.(S31)(ATCC20888);Schizochytriumsp.(S8)(ATCC20889);Schizochytriumsp.(1X-RM)(ATCC18915);Schizochytriumsp.(SR21);Schizochytriumaggregat咖(GoldsteinetBelsky)(ATCC28209);Schizochytriumlimacin咖(HondaetYokochi)(IFO32693);Thraustochytri墜p.(23B)(ATCC20891);Thraustochytri咖striatum(Schneider)(ATCC24473);Thraustochytriumaureum(Goldstein)(ATCC34304);Thraustochytri咖roseum(Goldstein)(ATCC28210);禾口Japonochytri咖sp.(LI)(ATCC28207)。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"轉(zhuǎn)化"用于指將異源核酸分子(即，重組核酸分子)插入微生物細(xì)胞，如破囊壺菌目微生物細(xì)胞的任何方法。在微生物系統(tǒng)中，術(shù)語"轉(zhuǎn)化"用于描述由于微生物獲得異源核酸所致的遺傳變化，它與術(shù)語"轉(zhuǎn)染"基本同義。適宜的轉(zhuǎn)化技術(shù)包括，但不限于粒子轟擊，電穿孔，顯微注射，脂轉(zhuǎn)染，吸附，感染和原生質(zhì)體融合?！獙?shí)施方案中，用本發(fā)明方法產(chǎn)生的蛋白通過在有效產(chǎn)生所述蛋白的條件下培養(yǎng)表達(dá)所述蛋白的細(xì)胞(即重組破囊壺菌目微生物)來產(chǎn)生。在一些例中，所述蛋白可被回收，并在其他例中，該微生物可被完整收獲或?yàn)榱呀馕镄问讲⒂米鳌ㄉ锪?biomass)〃。在另一實(shí)施方案中，去除或滅活靶基因的方法是，在能發(fā)生細(xì)胞內(nèi)重組的有效條件下，培養(yǎng)已用包含本發(fā)明靶向載體的重組分子轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，從而使靶基因被去除或滅活。優(yōu)選培養(yǎng)細(xì)胞為本發(fā)明的重組細(xì)胞。有效培養(yǎng)條件包括，但不限于允許蛋白產(chǎn)生和/或重組的有效培養(yǎng)基，生物反應(yīng)器，溫度，PH和氧氣條件。有效培養(yǎng)基指通常用于培養(yǎng)破囊壺菌目細(xì)胞的任何培養(yǎng)基。所述培養(yǎng)基一般包括含水培養(yǎng)基，它具有可同化的碳，氮和磷酸鹽來源，及適合的鹽，礦物質(zhì)，金屬離子和其它營養(yǎng)物，如維生素。適宜的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的實(shí)施例見實(shí)施例部分的具體討論。適于破囊壺菌目微生物的培養(yǎng)條件也見August23，1994授予Barclay的美國專利5，340，742;全文引入本文作為參考。本發(fā)明的細(xì)胞可在常規(guī)發(fā)酵生物反應(yīng)器，搖瓶，試管，微滴皿，和培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。培養(yǎng)可在適于重組細(xì)胞的溫度，pH和氧含量下進(jìn)行。所述培養(yǎng)條件在本領(lǐng)域技術(shù)人員的專門技術(shù)之內(nèi)?；谟糜诋a(chǎn)生的載體和宿主系統(tǒng)，本發(fā)明所得蛋白可保留在重組細(xì)胞內(nèi)；被分泌到發(fā)酵培養(yǎng)基中；被分泌到兩個(gè)細(xì)胞的膜間空間中；或被保留在細(xì)胞膜的外表面。術(shù)語"回收所述蛋白〃指收集全部包含所述蛋白的完整發(fā)酵培養(yǎng)基并且不需要暗示附加的分離或純化步驟。用本發(fā)明方法產(chǎn)生的蛋白可用各種標(biāo)準(zhǔn)蛋白純化技術(shù)純化，如，但不限于，親和層析，離子交換層析，過濾，電泳，疏水作用層析，凝膠過濾層析反相層析，伴刀豆球蛋白A層析，層析聚焦和差異溶解。用本發(fā)明方法產(chǎn)生的蛋白優(yōu)選以〃實(shí)質(zhì)純的〃形式回收。本文中"實(shí)質(zhì)純"指保證所述蛋白作為商業(yè)產(chǎn)品有效應(yīng)用的純度。而本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及破囊壺菌目的重組微生物，它已用包含編碼本發(fā)明乙酰乳酸合酶的核酸序列的重組核酸分子轉(zhuǎn)化。優(yōu)選，所述乙酰乳酸合酶賦予該微生物對選自下述的化合物降低的敏感性磺酰脲化合物，咪唑啉酮類抑制劑，和嘧啶基羥苯甲酸鹽。用于轉(zhuǎn)化此類微生物的適宜重組核酸分子和序列已在上面詳述。此類微生物還可用其它重組核酸分子轉(zhuǎn)化，包括包含ble基因選擇性標(biāo)記物和破囊壺菌目轉(zhuǎn)錄控制序列的重組核酸分子，如本文上述。本發(fā)明重組破囊壺菌目微生物見實(shí)施例部分?jǐn)⑹?。根?jù)本發(fā)明，本發(fā)明的重組破囊壺菌目微生物用本文所述的重組載體遺傳工程化，以便表達(dá)目的蛋白(此29類蛋白實(shí)例見上述)，和/或用本文所述的重組載體遺傳工程化以便定點(diǎn)去除或滅活靶基因。如本文所用，重組微生物具有用重組技術(shù)從其正常(即野生型或天然)形式經(jīng)過修飾(即突變或改變)的基因組。本發(fā)明的重組微生物可包括下述微生物，該微生物中已插入，去除或修飾(即突變；例如，通過核苷酸的插入，去除，取代，和/或倒位)核酸分子，導(dǎo)致所述修飾在該微生物中提供所需效應(yīng)。如本文所用，導(dǎo)致基因表達(dá)，基因功能，或基因產(chǎn)物(即，由該基因編碼的蛋白)功能降低的遺傳修飾可指基因的失活(完全或部分)，缺失，中斷，阻斷或下調(diào)。例如，導(dǎo)致該基因編碼的蛋白質(zhì)的功能下降的基因遺傳修飾可由該基因的完全缺失(即，該基因不存在，且因此該蛋白質(zhì)不存在)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)不完全翻譯或不翻譯(例如，蛋白質(zhì)不表達(dá))的基因突變，或降低或消除該蛋白的天然功能(即表達(dá)降低或無酶活性或作用的蛋白質(zhì))的基因突變引起。導(dǎo)致基因表達(dá)或功能增強(qiáng)的遺傳修飾可指基因的擴(kuò)增，過度表達(dá)，激活，增強(qiáng)，增加，或上調(diào)。根據(jù)本發(fā)明，重組破囊壺菌目微生物可用任何破囊壺菌目微生物產(chǎn)生。優(yōu)選破囊壺菌目的屬包括，但不限于破囊壺菌屬，Labyrinthuloides屬，J即onochytrium屬，和Schizochytrium屬。優(yōu)選這些屬內(nèi)的種包括，但不限于任何Schizochytrium種，包括Schizochytriumaggregatum，Schizochytriumlimacinum;任何石皮囊壺菌禾中(包括前Ulkenia禾中如U.visurgensis，U.amoeboida，U.sarkariana，U.profunda,U.radiata，U.分鐘uta禾口Ulkeniasp.BP—5601)，Thraustochytriumstriatum,Thraustochytriumaureum，Thraustochytriumroseum;禾口任何J即onochytrium禾中。特另U優(yōu)選石皮囊壺菌巨的菌株包括，但不限于-Schizochytriumsp.(S31)(ATCC20888);Schizochytri墜p.(S8)(ATCC20889);Schizochytriumsp.(LC-RM)(ATCC18915);Schizochytriumsp.(SR21);Schizochytriumaggregatum(GoldsteinetBelsky)(ATCC28209);Schizochytri咖1imacinum(HondaetYokochi)(IF032693);Thraustochytriumsp.(23B)(ATCC20891);Thraustochytri咖striatum(Schneider)(ATCC24473);Thraustochytriumaureum(Goldstein)(ATCC34304);Thraustochytriumroseum(Goldstein)(ATCC28210);和J即onochytriumsp.(LI)(ATCC28207)。下述實(shí)施例旨在闡述本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例實(shí)施例1此實(shí)施例描述了重組質(zhì)粒pTUBZE011-2的產(chǎn)生。重組質(zhì)粒pTUBZE011-2的構(gòu)建見圖.1和2闡述。該質(zhì)粒包含來自印度斯坦鏈異壁菌的ble基因，該基因與從Schizochytriumsp.分離的a-微管蛋白基因啟動子功能性偶聯(lián)。此質(zhì)粒如下產(chǎn)生。從Schizochytriumsp.cDNA文庫分離cDNA克隆(CGNE0002-001-B6)并作為大規(guī)模SchizochytriumcDNA測序項(xiàng)目的一部分進(jìn)行部分測序(SEQIDN0:1)。該核苷酸序列通過BLASTX同源性搜索確定能編碼a_微管蛋白(Gish，W.andD.States.1993.Nat.Genet.3:266-272)。從堿基116到550推斷出的氨基酸序列與來自Pelveticafastigiata的a-微管蛋白(GenBank序列號U58642)的開始145個(gè)氨基酸93%相同。為分離與此類基因相關(guān)的啟動子，從Schizochytriumsp細(xì)胞分離基因組DNA，并用"GenomeWalker"試劑盒(ClontechLaboratories,Inc.，PaloAlto，CA)處理，包括限制性內(nèi)切酶酶學(xué)消化基因組DNA來生成平端，之后將消化的DNA與試劑盒里提供的特異的雙鏈DNA銜接分子連接。然后用試劑盒里提供的外部銜接引物(API)及a-微管蛋白特異性引物PGR20(SEQIDN0:2)，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增此a-微管蛋白編碼序列的上游DNA。此類基因的進(jìn)一步擴(kuò)增用試劑盒里提供的嵌套銜接引物(AP2)和嵌套a-微管蛋白特異性引物PGR19(SEQIDNO:3)來進(jìn)行。所得PCR產(chǎn)物被亞克隆到質(zhì)粒pCR2.l-TOPO(InvitrogenCorp.，Carlsbad,CA)。測序亞克隆片段之一；緊接在a_微管蛋白基因起始密碼子前的725bp的序列被命名為SEQIDNO:4。用基于這種方式獲得的DNA序列的寡核苷酸引物，用T叫DNA聚合酶(Perkin-ElmerCorp.，Norwalk，CT)進(jìn)行PCR，產(chǎn)生修飾的a-微管蛋白啟動子區(qū)，其中NcoI限制性位點(diǎn)被摻入DNA片段的3'末端；該NcoI位點(diǎn)包含與a-微管蛋白編碼區(qū)在同一位置的起始密碼子。用于此反應(yīng)的引物為PGR33(SEQIDNO:5)和PGR34(SEQIDNO:6)，模板為從Schizochytriumsp細(xì)胞分離的基因組DNA。應(yīng)用下述反應(yīng)條件94°C4分鐘；(94°C1分鐘，54。C45秒，72。C2分鐘)X30;72。C7分鐘。此片段被克隆入質(zhì)粒pCR2.1-T0P0來構(gòu)成質(zhì)粒p7TUB(SEQIDNO:7)。質(zhì)粒p7TUB用Ncol消化，所得包含Schizochytriuma-微管蛋白啟動子區(qū)的463_bp片段通過瓊脂糖凝膠純化來分離。質(zhì)粒pSV40/Zeo(InvitrogenCorp.，Carlsbad,CA)包含來自印度斯坦鏈異壁菌的ble基因，該基因側(cè)翼有SV40啟動子和終止子，該質(zhì)粒也用Ncol消化來產(chǎn)生3201-bp和314_bp片段。所述3201-bp片段經(jīng)瓊脂糖凝膠純化并連接到來自p7TUB的463-bp的Ncol片段，產(chǎn)生pTUBZEO-ll(SEQIDNO:8)，如圖1所示。之后，質(zhì)粒pTUBZEO-11用Sphl消化，所得的包含ble基因，且側(cè)翼有Schizochytriuma-微管蛋白啟動子和SV40終止子的1122_bp片段經(jīng)瓊脂糖凝膠純化，連接到已用Sphl消化而線性化的質(zhì)粒pUC19(Messing,J.1983.Meth.Eiizyniol.101:20)。所得質(zhì)粒被命名為pTUBZE011-2(SEQIDNO:9)并如圖2和4所示。質(zhì)粒pTUBZE011-2也稱pM0N50000。SEQIDNO:9中，Schizochytriuma-微管蛋白啟動子被包含在核苷酸441-894中；ble基因編碼區(qū)被包含在核苷酸核苷酸895-1269中；而SV40終止子被包含在核苷酸核苷酸1270-1524中。實(shí)施例2此實(shí)施例描述了重組質(zhì)粒pM0N50200，pM0N50201，pM0N50202，和pM0N50203的產(chǎn)生。以下述方式分離Schizochytriumsp.的天然乙酰乳酸合酶_編碼基因(als)。從SchizochytriumcDNA文庫分離cDNA克隆(LIB81-028-Ql-El-D9)并作為大規(guī)模Schizochytriumsp.cDNA測序項(xiàng)目的一部分進(jìn)行部分測序(SEQIDNO:11)。該核苷酸序列通過BLASTX同源性確定編碼乙酰乳酸合酶(Gish，W.andD.States.1993.Nat.Genet.3:266-272);例如，從堿基154到378推斷出的氨基酸序列與來自栗酒裂殖酵母(GenBankAccessionNo.P36620)的ALS的氨基酸313到387有68%相同。然后獲得此克隆化cDNA的全長序列，它證明該cDNA克隆不包含完整的als編碼區(qū)。為獲得全長als基因，Schizochytrium基因組入文庫按照標(biāo)準(zhǔn)流程(見例如Sambrook等，MolecularClone:ALaboratoryManual.ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)用372_bp地高辛配基(DIG)-標(biāo)記的DNA探針(指ALS2探針)來探察。所述ALS2探針用包括DIG_ll_UTP(BoehringerMannheimBiochemicalsGmbH，Germany)的核苷酸混合物經(jīng)PCR來產(chǎn)生，其中所用正向引物為PGR38(SEQIDNO:12)和反向引物為PGR39(SEQIDNO:13)，它們都基于cDNA克隆LIB81-028-Ql-El-D9的序列。分離出用ALS2探針鑒定的基因組克隆之一，ALS-4A，進(jìn)一步用DIG-標(biāo)記的ALS2探針通過DNA印跡雜交試驗(yàn)來鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)來自Ahdl-消化的ALS-4AADNA的4.9_kbp片段可與ALS2探針雜交。將此片段通過瓊脂糖凝膠純化分離，用T4DNA聚合酶處理來產(chǎn)生平端，然后連接到Smal-消化的pBluescriptllKS+(StratageneCorp.，LaJolla，CA)構(gòu)成質(zhì)粒pM0N50200(如圖3_A所示)。pM0N50200的序列被命名為SEQIDN0:14。Schizochytriumals基因編碼的乙酰乳酸合酶的序列被命名為SEQIDNO:15。質(zhì)粒pM0N50201，pM0N50202和pM0N50203(如圖3_B，3_C，和3-D分別所示)用通過定點(diǎn)誘變從質(zhì)粒pM0N50200產(chǎn)生，從而編碼的乙酰乳酸合酶不再被某些化合物，包括sulfometuronmethyl(S匪)抑制。這些質(zhì)粒被如下構(gòu)建。用所述"Transformer^〃定點(diǎn)誘變試劑盒(ClontechLaboratories,Inc.，PaloAlto，CA)根據(jù)產(chǎn)生者的說明書將下述突變引入質(zhì)粒pM0N50200。在所有三種構(gòu)建體中使用寡核苷酸選擇引物匿19(SEQIDNO:16);此引物導(dǎo)致pM0N50200多克隆位點(diǎn)中唯一的EcoRV位點(diǎn)被轉(zhuǎn)變?yōu)锳atII位點(diǎn)。用引物匿14(SEQIDNO:17)將編碼的ALS酶的氨基酸殘基595從色氨酸改變?yōu)槔i氨酸，而同時(shí)將Acll位點(diǎn)引入該基因序列；所得質(zhì)粒被稱為pM0N50201(SEQIDNO:18)。類似的，用引物DM15(SEQIDN0:20)將所編碼的ALS酶中的氨基酸殘基192從脯氨酸改變?yōu)楣劝滨０凡sgl位點(diǎn)引入als基因，得到質(zhì)粒pM0N50202(SEQIDNO:21)。為構(gòu)建質(zhì)粒pM0N50203(SEQIDNO:23)，一并使用匿14和匿15引物，編碼得到包含上述兩種氨基酸殘基置換的ALS酶。質(zhì)粒pM0N50201，pM0N50202，和pM0N50203編碼的乙酰乳酸合酶突變體的序列被分別命名為SEQIDNO:19，SEQIDNO:22，和SEQIDNO:24。實(shí)施例3此實(shí)施例描述了用實(shí)施例1和2所述的重組分子對Schizochytriumsp.進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。此實(shí)施例所用的菌株是Schizochytriumsp.N230D，美國典型培養(yǎng)物保藏中心菌株20888(ATCC，Manassas,VA)的衍生物。為進(jìn)行液體培養(yǎng)，細(xì)胞在M50-3培養(yǎng)基中在30°C以200-300rpm振搖無菌生長。M50-3培養(yǎng)基包含下列組分NaCl，12.5g;MgS04_7H20，2.5g;KCl，O.5g;CaCl2，0.05g;葡萄糖，30g;谷氨酸鈉，3g;KH2P04，0.4g;酵母提取物，lg;NaHC03，0.4g;Na2EDTA，30mg;FeCl3_6H20，1.2mg;H萬，34.2mg;ZnS04_7H20，0.67mg;CoCl2_6H20，0.13mg;NaMo04-2H20，25iig;CuS04_5H20，10iig;NiS04_6H20，0.26mg;鹽酸硫胺素，100iig;生物素，0.5i!g;氰鈷胺素，0.5i!g，和去離子水(加至l升)；終pH調(diào)整到7.0。在固體培養(yǎng)基上生長時(shí)，細(xì)胞在30°C的M50-3培養(yǎng)基或M1E-3培養(yǎng)基中生長，所述培養(yǎng)基中加入1.5%(w/v)瓊脂進(jìn)行固化。MlE-3培養(yǎng)基包含下列組分葡萄糖，4g;(NH山S04，0.75g;Na2S04，5g;MgS04-7H20，2g;KH2P04，0.5g;KCl，O.5g;CaCl2_2H20，0.lg;MOPS緩沖液，20.9g;FeS04-4H20，0.3mg;MnCl2_4H20，0.lmg;ZnS04_7H20，80iig;CoCl2_6H20，2iig;NaMo04-2H20，liig;CuS04-5H20，60iig;NiS04-6H20，80iig;鹽酸硫胺素，320iig;CA-泛酸鹽，320yg;氰鈷胺素，8iig，和去離子水(加至l升)；終pH調(diào)整到7.0。Schizochytriumsp.對ZeocinTt^PS匪的敏感性如下確定在固化的M1E-3培養(yǎng)基中包括各種濃度的這些抑制劑，將細(xì)胞鋪板，鋪板密度類似于它們在篩選重組細(xì)胞的步驟中出現(xiàn)的密度。Schizochytrium細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化通過用Bio-RadBiolisticPDS-1000/氦粒子傳送系統(tǒng)(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)通過粒子轟擊(Sanford，J.C.，F(xiàn).D.Smith,和J.A.Russell.1993.Meth.Enzymol.217:483509)來完成。Schizochytriumsp.N230D細(xì)胞在液體M50-3培養(yǎng)基中生長直到680nm(0D68。)的光密度為0.4-0.8(光路長度10mm)。對應(yīng)于OD,l.0的等分細(xì)胞被短暫離心，去除上清液，沉淀的細(xì)胞重懸在100iU無菌水中。所述重懸細(xì)胞然后在含有經(jīng)瓊脂固化的培養(yǎng)基(例如，M50-3或M1E-3培養(yǎng)基)的Petri皿上涂布4-6cm的環(huán)。并放置30-60分鐘，從而過度的水可被吸收進(jìn)入固體培養(yǎng)基；這稱為是耙平板。1.5mg等分的金微載體(0.6ii標(biāo)稱直徑，來自BioRadLaboratories,Inc.，Hercules,CA)用2.5iig轉(zhuǎn)化質(zhì)粒DNA(即質(zhì)粒pTUBZE011-2，pM0N50201，pM0N50202，或pM0N50203)按產(chǎn)生者的說明書(BiolisticPDS-1000/氦粒子傳送系統(tǒng)說明書手冊；Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)包被。所述細(xì)胞用DNA包被的金微載體用下列條件轟擊1100psi爆發(fā)圓盤(burstdisk)，室真空25"Hg，微載體發(fā)射裝配(assembly)置于頂層架而靶平板置于中層架，爆發(fā)圓盤到停止屏(sto卯ingscreen)的距離1.5-2cm而且停止屏到靶的距離約7cm。轟擊后，使細(xì)胞在3(TC重新覆蓋到靶平板4-6小時(shí)。然后細(xì)胞用1.5ml無菌水從靶平板漂洗下來，集中在微離心(microfuge)管中，短暫離心，重懸在400iil無菌水中。100ill重懸液被涂布在四個(gè)包含150-200iig/mlZeocinTM(InvitrogenCorp.，Carlbad，CA)或25yg/mLS匪的M1E-3平板上。用含Zeocin的平板選擇經(jīng)質(zhì)粒pTUBZE011-2轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，用含S匪的平板選擇經(jīng)質(zhì)粒pM0N50201，pM0N50202，或pM0N50203轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。然后在3(TC孵育平板7-10天。然后將耐受選擇性介質(zhì)的菌落敷貼至包含同種選擇試劑的新鮮M1E-3平板上，以便確認(rèn)抗性。此方法通常導(dǎo)致每輪轟擊生成100-1000個(gè)Zeocin-抗性株或S匪-抗性株。實(shí)施例4下列實(shí)施例闡述了經(jīng)轉(zhuǎn)化的Schizochytrium細(xì)胞的PCR分析。用PCR確認(rèn)質(zhì)粒序列在耐受選擇試劑Zeocin或S匪的假定轉(zhuǎn)化菌株中的存在。是用一次性liU塑料接種環(huán)從敷貼到瓊脂平板(如實(shí)施例3所述)上的抗性菌落取出小量細(xì)胞(l-2mm3)上樣，獲得來自假定的轉(zhuǎn)化子和非-重組SchizochytriumN230D細(xì)胞的模板DNA。然后將所述細(xì)胞重懸在微離心管中15-20ill的1%TritonX-IOO，置于沸水浴中10分鐘，然后在14，OOOxg離心5分鐘。用部分提取物(1-31)制備模板DNA，以便用25y1TaqDNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)。為檢測pTUBZE011_2序列在SchizochytriumDNA中存在，使用引物DM20(SEQIDNO:25)禾PDM21(SEQIDNO:26);這些引物與質(zhì)粒pTUBZEOll-2中的ble基因退火并擴(kuò)增出346-bp的DNA片段。溫度變化如下94°C4分鐘；(94°C45秒，52°C45秒，72。C2分鐘)X30;72。C7分鐘。為檢測pM0N50201，pM0N50202，或pM0N50203序列在SchizochytriumDNA中存在，使用引物BLAl(SEQIDNO:27)禾PBLA2(SEQIDNO:28);這些引物發(fā)現(xiàn)與載體骨架中的bla(氨芐青霉素-抗性)基因退火并擴(kuò)增出1229-bp的DNA片段。溫度變化如下94°C4分鐘；(94°C45秒，55。C45秒，72。C2分鐘)X30;72。C7分33鐘。PCR產(chǎn)物通過標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖凝膠電泳，之后用溴化乙錠染色分析。這些分析的結(jié)果確認(rèn)，絕大部分在這些條件下選擇的菌株為真正包含質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化子。當(dāng)使用來自沒有被轉(zhuǎn)化質(zhì)粒轟擊的對照SchizochytriumspN230D細(xì)胞的模板DNA時(shí)，沒有產(chǎn)生正確大小的PCR產(chǎn)物。實(shí)施例5下列實(shí)施例描述了經(jīng)轉(zhuǎn)化的Schizochytrium細(xì)胞的DNA印跡分析。用從親代SchizochytriumN230D細(xì)胞和多個(gè)假定的轉(zhuǎn)化子分離的DNA進(jìn)行DNA雜交印跡，來確認(rèn)轉(zhuǎn)化載體DNA序列在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的存在。DNA印跡法用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知技術(shù)(見例如Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual.ColdSpringHarborLaboratoryPress.1989)來進(jìn)行。DNA用〃QIAamp〃DNA純化試劑盒(QiagenInc.，Valencia,CA)分離，用各種限制性酶消化，通過瓊脂糖凝膠(0.8%_1.2%w/v)電泳分離，然后通過堿性毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。經(jīng)pTUBZE011-2轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中的載體DNA用〃Genius"DIG-為基礎(chǔ)的系統(tǒng)(BoehringerMannheimBiochemicalsGmbH，Germany)禾口包括DIG-ll-UTP的核苷酸混合物來進(jìn)行檢測，用346-bpDIG-標(biāo)記的ble基因片段作雜交探針，該探針是通過用引物DM20(SEQIDNO:25)禾PDM21(SEQIDNO:26)進(jìn)行PCR來產(chǎn)生。膜的預(yù)雜交在68。C在Genius試劑盒提供的雜交緩沖液中進(jìn)行1小時(shí)。雜交在6『C，在包含94t:熱變性5分鐘的ble基因探針的雜交緩沖液中進(jìn)行18小時(shí)。然后用50ml2XSSC/0.1%SDS洗膜5分鐘兩次并在50ml0.1XSSC/0.1%SDS中洗膜15分鐘兩次。按照Genius試劑盒說明書對雜交DNA進(jìn)行化學(xué)發(fā)光法檢測。來自未經(jīng)-轉(zhuǎn)化的SchizochytriumN230D細(xì)胞的DNA不與ble基因探針雜交。相反，來自轉(zhuǎn)化細(xì)胞的DNA與如下探針雜交Mil:來自轉(zhuǎn)化的Schizochytrium細(xì)胞的DNA經(jīng)Sphl-消化后包含與ble基因探針雜交的約1100-bpDNA片段；此片段也見于Sphl-消化的pTUBZE011-2DNA，它表示完整的ble基因表達(dá)盒(包括微管蛋白基因啟動子和SV40終止子)。Sl2l:對被試的每個(gè)轉(zhuǎn)化子，DNA經(jīng)Xhol消化產(chǎn)生大于15-20kbp的雜交片段。Xhol不在pTUBZE011-2內(nèi)切割，因而這些結(jié)果證明pTUBZE011-2不作為轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的染色體外元件存在，而是整合入Schizochytrium染色體。Ncol或HindIII:這些酶都在pTUBZEOll-2中發(fā)生一次切割。用這些酶中的任一種消化轉(zhuǎn)化子DNA通常導(dǎo)致顯著性雜交片段，此片段與線性化pTUBZE011-2載體(即約3.8kbp)共遷移。這提示所述載體可以以串聯(lián)重復(fù)形式整合入染色體。實(shí)施例6此實(shí)施例闡述了Schizochytrium中的同源重組。下述試驗(yàn)是為闡述同源重組可出現(xiàn)在Schizochytrium中，內(nèi)源天然DNA序列與引入細(xì)胞的重組DNA分子中的同源DNA序列之間。此種同源重組對于產(chǎn)生具有所需性質(zhì)的重組菌株很有益。例如，同源重組可用于通過定點(diǎn)插入外源遺傳序列而滅活內(nèi)源基因。另外，同源重組可用于將內(nèi)源基因或其部分置換為此類基因的變更形式，從而使該重組細(xì)胞表現(xiàn)新的性質(zhì)。實(shí)驗(yàn)表明，同源重組出現(xiàn)在用pM0N50202轉(zhuǎn)化的Schizochytrium細(xì)胞，所述質(zhì)34粒在Schizochytriumals基因中包含突變。此突變在als編碼區(qū)的bp位置571引入Bsgl位點(diǎn)。在als編碼區(qū)bp位置1324有天然Bsgl位點(diǎn)。因而可用，經(jīng)Bsgl-消化的SchizochytriumDNA的DNA印跡法辨別天然als基因與重組突變體als基因。為進(jìn)行這些試驗(yàn)，經(jīng)PCR制備als-特異的雜交探針，其中用到包括DIG-ll-UTP(BoehringerMannheimBiochemicalsGmbH,Germany)的核苷酸混合物，正向引物PGR28(SEQIDN0:32)，反向引物PGR30(SEQIDNO:33)，以小量pM0N50200作為模板。所得323_bpDIG-標(biāo)記的雜交探針被稱為ALSl。來自非-重組SchizochytriumN230D細(xì)胞的DNA用Bsgl和Ahdl分別消化，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳，轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，然后用ALSl探針探測，步驟基本與實(shí)施例5所述步驟相同。所述ALSl探針標(biāo)記Bsgl-消化的DNA的1.76_kbp片段和Ahdl-消化的DNA的4.9_kbp片段。來自各種經(jīng)pM0N50202轉(zhuǎn)化的重組菌株的DNA經(jīng)Bsgl-和Ahdl-消化后進(jìn)行DNA印跡，然后也用ALSl探針探測。一些例中，未出現(xiàn)1.76-kbp的Bsgl片段，而0.75-kbp的片段被標(biāo)記，它對應(yīng)于pM0N50202中的753-bp的Bsgl片段。但是，在這些重組菌株中，4.9-kbp的Ahdl片段被標(biāo)記，表明重組子的突變體als基因已通過雙-交換同源重組與天然als基因發(fā)生了重組。還觀察到單-交換同源重組出現(xiàn)在用pM0N50202轉(zhuǎn)化的重組菌株中。在這些例中，1.76-kbp和0.75-kbp的Bsgl片段在來自重組菌株的DNA的DNA印跡中都被標(biāo)記，但4.9-kbpAhdl片段被較大的標(biāo)記片段代替，這證明完整的pM0N50202載體已插入天然als基因，其形式有單拷貝也有串聯(lián)重復(fù)。在Schizochytrium中發(fā)生同源重組的另一證據(jù)是，引入包含截短的als基因突變體的重組DNA分子，使該截短的基因編碼的不完整ALS酶無功能。此截短的基因如下制備用Clal和HindIII消化pM0N50202，產(chǎn)生2.8-kbp片段，從而一并去除als編碼序列的最后388bp連同als終止子區(qū)。將此2.8_kbp片段連接入已用Clal和HindIII消化的pBluescriptllKS+(StratageneCorp.，LaJolla，CA)，產(chǎn)生質(zhì)粒pAR2。如果通過天然als基因和pAR2的截短型als基因突變體之間發(fā)生同源重組，而使有功能的als基因突變體在轉(zhuǎn)化菌株中被挽救，僅可預(yù)計(jì)質(zhì)粒pAR2在經(jīng)轉(zhuǎn)化的Schizochytrium細(xì)胞中賦予對S匪的抗性。將該構(gòu)建體通過粒子轟擊引入SchizochytriumN230D細(xì)胞，如實(shí)施例3所述分離S匪-抗性菌株。來自轉(zhuǎn)化子的DNA經(jīng)Bsgl-消化后按本實(shí)施例中前文所述進(jìn)行DNA印跡分析，結(jié)果證明在這些菌株發(fā)生同源重組；即，1.76-kbpBsgl片段與所述ALS1探針在非重組細(xì)胞中雜交，但在pAR2轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中卻是0.75-kbp的雜交片段。實(shí)施例7此實(shí)施例描述了應(yīng)用轉(zhuǎn)化載體pTUBZE011-2或pM0N50202來經(jīng)共轉(zhuǎn)化產(chǎn)生包含不與選擇性標(biāo)記物基因連接的附加的外源DNA分子的菌株。共轉(zhuǎn)化可通過同時(shí)引入pTUBZE011-2和附加的包含所述任一種基因的質(zhì)粒來完成。如實(shí)施例3所述，使2.5iig每種質(zhì)粒與金粒子共沉淀。在用質(zhì)粒-包被的金粒子轟擊靶細(xì)胞后，在包含Zeocin的瓊脂平板上如實(shí)施例1所述選出重組菌株。第二種非選擇性質(zhì)粒的存在然后通過PCR分析或DNA印跡雜交確認(rèn)。通常可獲得很高的共轉(zhuǎn)化頻率(例如，50-90%)。例如，將包含Caenorhabdituselegansfat-1基因的質(zhì)粒pTR202(Spychalla等.，1997.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94，1142-1147)與Schizochytrium微管蛋白基因啟動子和終止子連接，按照本實(shí)施例提供的方法引入，PCR表明約68X的所得ZeocinTM抗性菌株包含fat-1基因(見表1)。當(dāng)引入pM0N50202與附加的質(zhì)粒之后，在包含S匪的固體培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞時(shí)可觀察到類似結(jié)果。此共轉(zhuǎn)化方法可用于引入任何所需的外源DNA。表1.用選擇性標(biāo)記物質(zhì)粒pTubZeo11_2和包含各種fad基因的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化的有效性。用PCR篩選Ze0CinK抗性轉(zhuǎn)化子的fadDNA序列。<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>這些實(shí)施例敘述的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)代表了遺傳操縱Schizochytrium的能力的顯著性進(jìn)步，這種菌種是已知用于發(fā)酵產(chǎn)生脂質(zhì)_為基礎(chǔ)的化合物的最有產(chǎn)生力的生物。兩種獨(dú)立的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的出現(xiàn)，以及較高的共轉(zhuǎn)化有效性可在工程菌株中堆積多種性質(zhì)。而且，同源重組在此藻類的明顯存在可開發(fā)基因剔除方法，以便鑒定未知基因的功能并去除產(chǎn)生菌株中的不需要的性質(zhì)。本發(fā)明人現(xiàn)用這些系統(tǒng)改變Schizochytrium的脂肪酸代謝，并在探索利用此物種和相關(guān)微藻(例如，破囊壺菌)產(chǎn)生類胡蘿卜素，固醇，和其它脂類化合物的可能性。盡管本發(fā)明的各種實(shí)施方案已被詳述，但對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，針對那些實(shí)施方案進(jìn)行修飾和改編是顯而易見的。然而可清楚理解的是，所述修飾和改編如下面權(quán)利要求書所提出的那樣，都是在本發(fā)明的范圍內(nèi)。序列表〈110〉馬泰克生物科學(xué)公司(MartekBiosciences〈120〉轉(zhuǎn)化破囊壺菌目微生物的產(chǎn)物和方法〈130>2997-23-PCT〈150>60/284，116〈151>2001-04-16〈160>35〈170>PatentInversion3.1〈210>1〈211>551〈212>DNA〈213>Schizochytriumsp.〈221>misc_feature〈222〉(520)(520)〈223>n=a，c，g，ort〈220〉〈221>misc_feature〈222〉(541).(541)〈223>n=a，c，g，ort〈400>1gtcgtgcctaacaacacgccgttctaccccgccttcttcgcgccccttcgcgtccaagca60tccttcaagtttatctctct3gttC朋CttC33g朋g朋C3C33g3tgCg120tgaggtcatctccatccacatcggccaggccggtgttcaggtcggtaacgcctgctggga180gctctactgcctcgagcatggcatccagccggacggccagatgccctcggacaagaccat240tggcggcggcgatgatgccttcaacaccttcttctccgagactggcgccggcaagcacgt300gccccgcgccgtgctcgtcgatctcgagcccaccgtctgtgacgaggtccgcaccggcac360cteccgcgctctttaccaccCCg3gC3g3tcatcaccggc33gg3gg3Cgctgcc朋c朋420ctecgctcgtggccactacaccatcggcaaggagatcgtcgacctcgtcctcgaccgcat■ccgcaagctcgccgacaactgcactggtcttcagggcttnctctgcttcaacgccgtcgg540nggtggteccg551〈210>2〈211>27〈212>DNA〈213>Schizochytriumsp.〈400>2gcgccagtctcggagaagaaggtgttg27〈210>3〈211>27〈212>DNA〈213>Schizochytriumsp.〈400>3agctcccagcaggcgttaccgacctga27〈210>4〈211>725〈212>DNA〈213>Schizochytriumsp.〈400>4gagacgtgcttcgcaagaccgctgtgctcgcgccgcacgctctgtgtgttacatteattt60ttttgtegatgaagtttctctettctctcgaaattctgtegaatgttetegtctcttcac120tcccgtgattggagaggattcttgcttgttccctcccgcccgggtegcgcttggagcaac180gcttgagcgcgcgctcga朋gcggacggcgc皿cgagccgtttcacgccgcgctgtccaa240gtcccatttttctccttaccccatggccgttgcatgccaatttteggccccccactgacc300gaggtctgtcgateatccacttttccattgatcttccaggtttcgtteactcatgccact360gagc朋朋cttcggtctttccteac皿皿gctctcctcac皿3gcatggcgcggc皿cgg420acgtgtcctcatectccactgCC3C3C皿ggtcgate皿cteagctcctc3C3皿tegag■gag朋ttccactgacaactg3tc3cractggagcggcgcg540gcggttgggcgcgg郷tcgcaagcgactcgccgagc皿3cccg皿tcag600ccttcagacggtcgtgccte3C皿C3CgCCgttcteccccgccttcttcgcgccccttcg660cgtccaagcatccttcaagtttetctctctagttcaacttC皿g皿g皿C皿C3CC3CC3720ac朋g725〈210>5〈211>24〈212>DNA〈213>Schizochytriumsp.〈400>5cacccatggtgttggtggtg〖ttgt24〈210>6〈211>24〈212>DNA〈213>Schizochytriumsp.〈400>63朋CtCg3g3cgtgcttcgc:33g324〈210>7〈211>4646〈212>DNA〈213>Schizochytriumsp.〈400>73朋CtCg3g3cgtgcttc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ctgcctgcgtgcgtgcgtgcgtgcgtgccttcgtgcg2160tgcctgccttcgtgcgtgcgtgcgtgagtgcggcgga卿gggatratgcgaggatc^t2220cacccgccgcacctcgacttttg皿g皿gccgcgatgcgatgcgatgcgatgcgatgcga2280cgcgateccgtgcgaggctecg皿gcgagtctggccggccgtcatecaacgcacgttttc2340g卿3gg3gggctggcgg3ggcgtgcatgccggcgaccattgcg皿cgcggcgtctcgtg2400gctggcgaaggtgcctggaggatct朋cgatcgctgctetgatgctetegctgtgctgat2460ccccggtccattccaccacgtctgtgcctgccgcctgacctgcgcttggctttccttcaa2520gttctcctccgccgggccttC3gg3CCg3g3Cg3g3CCtgcagctgcagctegactcgcg2580ctcgctcgcggaggattcgccggccgccgggccggacgggactcgcgaggtcacacggcc2640gccggcgatcgcgatggctgtgctgacgtectcgtgcgtggcagccgtecgtcagcgacg2700ccgcctccgtattgtggattcgttegttggttgttggttgatttgttgatteattttttt2760gttcgteggcttggttategcteategtttagtttatectggtgctcttcggtgctgatt2820tegctcgacttgggtccacaccactgcccctctectgtgaatggatc皿tgg3CgC3Cg32880cgggccgacgaaagtgcgcgccteagcaacggcggtcttc卿ggggacg2940cacgccctccgtcgcagtcagtccagaraggcag朋皿gcgtcttegggaccacgcacgc3000acgcacgcacgcacgcacgcccgcacgcacgctccctccctcgcgtgcctattttttteg3060gcttccttccgcacgggcctacctctcgctccctcgcctcgccgcaccaggcggragrag3120cgatecctgccggtgccgcctccgtcacgcgctcagccgcagctcagcccagccgcgagc3180tegggtttgttcgtcctgaattgtttgatttgatttgatttgatttgatccgatccgatc3240cgatctgatctgatttgctttgctttgctttgtctccctcccggcgcggaccaagcgtcc3300gtctgcgcgccgcagcttcccttcttctcccagccctccttctgctcccgcctctcgcgc3360朋gC3CgC3gcttcgccgccgcatccggtcggtcggtcggtcgatcgacccgcctgccgc3420tgctgctgtggccgggcttttctccatcggcgactctttcttctccatecgtcctectec3480gtacatecatactgccggcttcctcctcttccagcgcggcgacggcggraggctgcgacg3540tcgtcgccgccgcgggcgccgcgcgcgccgccgccgccgcccgcgtcgcagggcctcgtc3600gccgccgccgctccgctccgctccgaggccgcg卿gggccgcggcggcgcgatggatgg3660￡ltgg￡ltgg￡ltgg￡ltgg￡ltggatggattttgttgatcgatggcggcgcatgggcgg卿tg37203gCg￡lgg￡lCgagcgcgcgagcgcggcagccggattcgragggcctcgctcgcctcgcgcc3780cgctgccgcgcccgccttgcgagcctgcgccgcg賜cgagcgagcg賜cgagcggggctt3840tctttgtctcgcgcgccgcttggcctcgtgtgtcttgtgcttgcgtegcgggcgccgcgg3900tggEl卿tggctcattcaatcgacccattcacgcacgcactccggcgcgc3g3g皿ggCC3960g郷ElggElgCccaaaagctctcgcgctcgcggtctcgggctcgagcggtc4020tCggElg卿gagtcttgcggcgaccaccggC3gC3gC3gC3gC3gC3gC3gcgctgtcga4080[2273]gracgagC3Cgagracgagcacgagcacgagcattcgagc^gaggacagacacggttgt4140cagcgcctegctcgctcgatacaga^gaggcgggttgggcgte皿皿皿^ggagcacg4200caagccgccagccagccagctagctegccagcctgcctgccaaa424權(quán)利要求分離的核酸分子，包含選自下列的核酸序列a.編碼下述蛋白的核酸序列，該蛋白具有選自SEQIDNO15，SEQIDNO19，SEQIDNO22或SEQIDNO24的氨基酸序列，其中所述蛋白為乙酰乳酸合酶；b.編碼下述蛋白的核酸序列，該蛋白具有與氨基酸序列(a)至少約75％相同的氨基酸序列，其中所述蛋白為乙酰乳酸合酶；和，c.與核酸序列(a)或(b)完全互補(bǔ)的核酸序列。2.權(quán)利要求l的分離的核酸分子，其中所述核酸序列編碼具有與氨基酸序列(a)至少約85%相同的氨基酸序列的蛋白，并且其中所述蛋白為乙酰乳酸合酶。3.權(quán)利要求l的分離的核酸分子，其中所述核酸序列編碼具有與氨基酸序列(a)至少約95%相同的氨基酸序列的蛋白，并且其中所述蛋白為乙酰乳酸合酶。4.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中所述核酸序列編碼具有與SEQIDNO:15不同的氨基酸序列的蛋白，該不同是由于在選自116G，117A，192P，200A，251K，358M，383D，592V，595W或599F的氨基酸位置發(fā)生氨基酸缺失，插入或取代。5.權(quán)利要求l的分離的核酸分子，其中所述核酸序列編碼一種蛋白，該蛋白具有選自SEQIDNO:15，SEQIDNO:19，SEQIDNO:22或SEQIDNO:24的氨基酸序列，并且其中所述蛋白為乙酰乳酸合酶。6.權(quán)利要求l的分離的核酸分子，其中所述核酸序列選自SEQIDN0:14的核苷酸1260-3314，SEQIDNO:18的核苷酸1260-3314，SEQIDNO:21的核苷酸1260-3314或SEQIDNO:23的核苷酸1260-3314。7.權(quán)利要求l的分離的核酸分子，其中蛋白(a)或(b)的表達(dá)賦予用所述核酸分子轉(zhuǎn)化的破囊壺菌目微生物對選自如下的化合物降低的敏感性磺酰脲化合物，咪唑啉酮類抑制劑，或嘧啶基羥苯甲酸鹽。8.權(quán)利要求7的分離的核酸分子，其中所述核酸序列編碼具有選自SEQIDNO:19，SEQIDNO:22或SEQIDNO:24的氨基酸序列的蛋白。9.權(quán)利要求7的分離的核酸分子，其中所述核酸序列選自SEQIDN0:14的核苷酸1260-3314，SEQIDNO:18的核苷酸1260-3314，SEQIDNO:21的核苷酸1260-3314或SEQIDNO:23的核苷酸1260-3314。10.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中所述核酸序列編碼Schizochytrium乙酰乳酸合酶。11.權(quán)利要求IO的分離的核酸分子，其中所述Schizochytrium乙酰乳酸合酶的表達(dá)賦予用所述核酸分子轉(zhuǎn)化的破囊壺菌目微生物對選自如下的化合物降低的敏感性磺酰脲化合物，咪唑啉酮類抑制劑，或嘧啶基羥苯甲酸鹽。12.重組核酸分子，包含與轉(zhuǎn)錄控制序列可操作性連接的權(quán)利要求l的分離的核酸分子。13.用權(quán)利要求12所述重組核酸分子轉(zhuǎn)化的破囊壺菌目的重組微生物。14.用于轉(zhuǎn)化破囊壺菌目微生物的重組載體，包含編碼乙酰乳酸合酶的核酸序列，該乙酰乳酸合酶賦予破囊壺菌目微生物對選自如下的化合物降低的敏感性磺酰脲化合物，咪唑啉酮類抑制劑，或嘧啶基羥苯甲酸鹽，其中所述乙酰乳酸合酶具有選自如下的氨基酸序列a.選自SEQIDNO:19，SEQIDNO:22或SEQIDNO:24的氨基酸序列；和，b.與氨基酸序列(a)至少約75%相同的氨基酸序列；其中所述編碼乙酰乳酸合酶的核酸序列與轉(zhuǎn)錄控制序列可操作性連接。15.權(quán)利要求14的重組載體，其中所述重組載體是表達(dá)載體。16.權(quán)利要求14的重組載體，其中所述重組載體靶向載體。17.權(quán)利要求14的重組載體，其中所述核酸序列編碼具有與氨基酸序列(a)至少約85%相同的氨基酸序列的乙酰乳酸合酶。18.權(quán)利要求14的重組載體，其中所述核酸序列編碼具有與氨基酸序列(a)至少約95%相同的氨基酸序列的乙酰乳酸合酶。19.權(quán)利要求14的重組載體，其中所述核酸序列編碼具有與SEQIDN0:15不同的氨基酸序列的蛋白，該不同是由于在選自116G，117A，192P，200A，251K，358M，383D，592V，595W或599F的氨基酸位置發(fā)生氨基酸缺失，插入或取代。20.權(quán)利要求14的重組載體，其中所述乙酰乳酸合酶具有選自SEQIDNO:19，SEQIDNO:22或SEQIDNO:24的氨基酸序列。21.權(quán)利要求14的重組載體，其中所述核酸序列選自SEQIDN0:18的核苷酸1260-3314，SEQIDNO:21的核苷酸1260-3314，或SEQIDNO:23的核苷酸1260-3314。22.權(quán)利要求14的重組載體，其中所述轉(zhuǎn)錄控制序列選自破囊壺菌目a-微管蛋白啟動子，破囊壺菌目乙酰乳酸合酶啟動子，來自破囊壺菌目聚酮化合物合酶(PKS)系統(tǒng)的啟動子，或破囊壺菌目脂肪酸脫氫酶啟動子。23.權(quán)利要求14的重組載體，其中所述載體包含選自SEQIDN0:18，SEQIDNO:21或SEQIDNO:23的核酸序列。24.轉(zhuǎn)化破囊壺菌目微生物細(xì)胞的方法，所述方法包括a.向破囊壺菌目微生物細(xì)胞中引入包含編碼乙酰乳酸合酶的核酸序列的重組核酸分子，所述乙酰乳酸合酶賦予所述細(xì)胞對選自如下的化合物降低的敏感性磺酰脲化合物，咪唑啉酮類抑制劑，或嘧啶基羥苯甲酸鹽，其中所述乙酰乳酸合酶具有選自如下的氨基酸序列i.選自SEQIDNO:19，SEQIDNO:22或SEQIDNO:24的氨基酸序列；和，ii.與氨基酸序列(i)至少約75%相同的氨基酸序列；并且，b.選擇用所述重組核酸分子成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，方法是在包含至少一種抑制未轉(zhuǎn)化細(xì)胞的化合物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)(a)所述細(xì)胞，所述化合物選自磺酰脲化合物，咪唑啉酮類抑制劑，或嘧啶基羥苯甲酸鹽。25.權(quán)利要求24的方法，其中所述核酸序列編碼具有與氨基酸序列(i)至少約85%相同的氨基酸序列的乙酰乳酸合酶。26.權(quán)利要求24的方法，其中所述核酸序列編碼具有與氨基酸序列(i)至少約95%相同的氨基酸序列的乙酰乳酸合酶。27.權(quán)利要求24的方法，其中所述核酸序列編碼具有與SEQIDNO:15不同的氨基酸序列的蛋白，該不同是由于在選自116G，117A，192P，200A，251K，358M，383D，592V，595W或599F的氨基酸位置氨基酸發(fā)生缺失，插入或取代。28.權(quán)利要求24的方法，其中所述乙酰乳酸合酶具有選自SEQIDNO:19，SEQIDNO:22或SEQIDNO:24的氨基酸序列。29.權(quán)利要求24的方法，其中所述核酸序列選自SEQIDNO:18的核苷酸1260-3314，SEQIDNO:21的核苷酸1260-3314或SEQIDNO:23的核苷酸1260-3314。30.權(quán)利要求24的方法，其中所述核酸序列與轉(zhuǎn)錄控制序列可操作性連接，所述轉(zhuǎn)錄控制序列選自破囊壺菌目a-微管蛋白啟動子，破囊壺菌目乙酰乳酸合酶啟動子，來自破囊壺菌目聚酮化合物合酶(PKS)系統(tǒng)的啟動子，或破囊壺菌目脂肪酸脫氫酶啟動子。31.權(quán)利要求24的方法，其中所述重組核酸分子還包含編碼由所述細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白的核酸序列，其中編碼所述蛋白的所述核酸序列與轉(zhuǎn)錄控制序列可操作性連接。32.權(quán)利要求31的方法，其中所述蛋白與二十二碳六烯酸(DHA)，二十二碳五烯酸(DPA)，二十碳五烯酸(EPA)或二十碳四烯酸(ARA)的脂肪酸的合成相關(guān)。33.權(quán)利要求31的方法，其中所述蛋白選自脂肪酸合酶，脂肪酸脫氫酶，脂肪酸延伸酶，與聚酮化合物合酶復(fù)合體相關(guān)的蛋白，或與將脂肪酸摻入磷脂或摻入三甘油酯分子相關(guān)的蛋白。34.權(quán)利要求31的方法，其中所述蛋白為核酸序列SEQIDN0:29編碼的"_3脂肪酸脫氫酶。35.權(quán)利要求31的方法，其中所述蛋白為多烯脂肪酸異構(gòu)酶。36.權(quán)利要求31的方法，其中所述蛋白選自HMG-CoA合酶，HMG-CoA還原酶，角鯊烯合酶，八氫番茄紅素合酶，八氫番茄紅素脫氫酶，類胡蘿卜素環(huán)化酶，類胡蘿卜素羥化酶，類胡蘿卜素酮酶，維生素E或硫辛酸。37.權(quán)利要求24的方法，其中步驟(a)中的所述重組核酸分子還包含與所述微生物中的靶核酸序列雜交的核酸序列，從而包含所述靶核酸序列的基因通過與所述第二種核酸序列發(fā)生同源重組而被突變或滅活。38.權(quán)利要求37的方法，其中所述靶核酸序列編碼選自如下的蛋白脂肪酶，脂肪酸氧化酶，參與糖類合成的蛋白，參與類異戊二烯途徑的產(chǎn)物的合成的蛋白，參與細(xì)胞壁組分合成的蛋白，參與飽和脂肪酸合成途徑的蛋白，參與多不飽和脂肪酸合成途徑的蛋白，與聚酮化合物合酶復(fù)合體相關(guān)的蛋白，或與將脂肪酸摻入磷脂或三甘油酯分子相關(guān)的蛋白。39.權(quán)利要求24的方法，還包括向所述細(xì)胞引入至少一種附加的重組核酸分子的步驟，該重組核酸分子包含編碼需要表達(dá)的蛋白的核酸序列，所述核酸序列與轉(zhuǎn)錄控制序列可操作性連接。40.權(quán)利要求24的方法，還包闊向所述細(xì)胞引入至少一種附加的重組核酸分子的步驟，該重組核酸分子包含與所述微生物中的靶核酸序列雜交的第二種核酸序列，從而包含所述靶核酸序列的基因通過與所述第二種核酸序列發(fā)生同源重組而被突變或滅活。41.權(quán)利要求24的方法，還包括向所述細(xì)胞中引入包含編碼博來霉素-結(jié)合蛋白的核酸序列的重組核酸分子的步驟。42.權(quán)利要求41的方法，其中所述包含編碼博來霉素-結(jié)合蛋白的核酸序列的重組核酸分子還包含編碼被所述細(xì)胞表達(dá)的第二種蛋白的核酸序列，其中編碼所述第二種蛋白的所述核酸序列與轉(zhuǎn)錄控制序列可操作性連接。43.權(quán)利要求42的方法，其中所述轉(zhuǎn)錄控制序列選自破囊壺菌目a-微管蛋白啟動子，破囊壺菌目乙酰乳酸合酶啟動子，來自破囊壺菌目聚酮化合物合酶(PKS)系統(tǒng)的啟動子，或破囊壺菌目脂肪酸脫氫酶啟動子。44.權(quán)利要求41的方法，其中所述包含編碼博來霉素-結(jié)合蛋白的核酸序列的重組核酸分子還包含可與所述微生物中的靶核酸序列雜交的第二種核酸序列，從而包含所述靶核酸序列的基因通過與所述第二種核酸序列發(fā)生同源重組而被突變或滅活。45.權(quán)利要求41的方法，其中所述重組核酸分子包含核酸序列SEQIDN0:9。46.權(quán)利要求24的方法，其中所述微生物來自破囊壺菌屬，Labyrinthuloides屬，J即onochytrium屬，或Schizochytrium屬。47.權(quán)利要求24的方法，其中所述微生物來自選自如下的物種Schizochytriumsp.，Schizochytriumaggregatum，Schizochytriumlimaci皿m，Schizochytriumminutum，Thraustochytriumsp.，Thraustochytriumstriatum，Thraustochytriumaureum，Thraustochytriumroseum，或Japonochytriumsp.。48.權(quán)利要求24的方法，其中所述引入步驟用選自粒子轟擊，電穿孔，顯微注射，脂轉(zhuǎn)染，吸附，感染或原生質(zhì)體融合的方法完成。49.破囊壺菌目的重組微生物，用包含編碼乙酰乳酸合酶的核酸序列的重組核酸分子轉(zhuǎn)化，所述乙酰乳酸合酶賦予所述微生物對選自磺酰脲化合物，咪唑啉酮類抑制劑，或嘧啶基羥苯甲酸鹽的化合物降低的敏感性，其中所述乙酰乳酸合酶具有選自如下的氨基酸序列a.選自SEQIDNO:19，SEQIDNO:22或SEQIDNO:24的氨基酸序列；和，b.與氨基酸序列(a)至少約75%相同的氨基酸序列。50.權(quán)利要求49的重組微生物，其中所述核酸序列編碼具有與氨基酸序列(a)至少約85%相同的氨基酸序列的乙酰乳酸合酶。51.權(quán)利要求49的重組微生物，其中所述核酸序列編碼具有與氨基酸序列(a)至少約95%相同的氨基酸序列的乙酰乳酸合酶。52.權(quán)利要求49的重組微生物，其中所述乙酰乳酸合酶具有選自SEQIDN0:19，SEQIDNO:22或SEQIDNO:24的氨基酸序列。53.權(quán)利要求49的重組微生物，其中所述核酸序列選自SEQIDN0:18的核苷酸1260-3314，SEQIDNO:21的核苷酸1260-3314，或SEQIDNO:23的核苷酸1260-3314。54.權(quán)利要求49的重組微生物，其中所述重組核酸分子包含選自SEQIDN0:18，SEQIDNO:21或SEQIDNO:23的核酸序列。55.權(quán)利要求49的重組微生物，其中所述編碼乙酰乳酸合酶的核酸序列與在破囊壺菌目微生物中起作用的啟動子可操作性連接。56.權(quán)利要求49的重組微生物，其中所述編碼乙酰乳酸合酶的核酸序列與選自如下的轉(zhuǎn)錄控制序列可操作性連接破囊壺菌目a-微管蛋白啟動子，破囊壺菌目乙酰乳酸合酶啟動子，來自破囊壺菌目聚酮化合物合酶(PKS)系統(tǒng)的啟動子，或破囊壺菌目脂肪酸脫氫酶啟動子。57.權(quán)利要求49的重組微生物，其中所述重組核酸分子還包含編碼由所述微生物產(chǎn)生的第一種蛋白的核酸序列，其中編碼所述第一種蛋白的核酸序列與轉(zhuǎn)錄控制序列可操作地連接。58.權(quán)利要求49的重組微生物，其中所述重組細(xì)胞還用包含編碼博來霉素_結(jié)合蛋白的核酸序列的重組核酸分子轉(zhuǎn)化。59.權(quán)利要求58的重組微生物，其中所述重組核酸分子包含核酸序列SEQIDNO:9。60.權(quán)利要求58的重組微生物，其中所述包含編碼博來霉素_結(jié)合蛋白的核酸序列的重組核酸分子還包含編碼所述細(xì)胞產(chǎn)生的第二種蛋白的核酸序列，其中編碼所述第二種蛋白的所述核酸序列與轉(zhuǎn)錄控制序列可操作地連接。61.權(quán)利要求49的重組微生物，還包含至少一種附加的重組核酸分子，該分子包含編碼所述細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白的核酸序列。62.分離的核酸分子，包含選自如下的核酸序列a.SEQIDNO:9的核苷酸441-894;b.與SEQIDNO:9的核苷酸441-894全長有至少約95%相同的核酸序列，其中所述核酸序列具有至少基本的a-微管蛋白啟動子轉(zhuǎn)錄活性；禾口c.分離的多核苷酸，包含與所述多核苷酸(a)或(b)完全互補(bǔ)的核酸序列。63.權(quán)利要求62的分離的核酸分子，其中所述分離的核酸分子包含SEQIDNO:4的核酸序列或包含SEQIDNO:9的核苷酸441-894。64.用于轉(zhuǎn)化破囊壺菌目微生物的重組載體，包含可操作性連接到如下啟動子的編碼博來霉素結(jié)合蛋白的核酸序列破囊壺菌目a-微管蛋白啟動子，破囊壺菌目乙酰乳酸合酶啟動子，來自破囊壺菌目聚酮化合物合酶(PKS)系統(tǒng)的啟動子，或破囊壺菌目脂肪酸脫氫酶啟動子。65.權(quán)利要求64的重組載體，其中所述破囊壺菌目乙酰乳酸合酶啟動子包含SEQIDN0:14的核苷酸1-1259。66.權(quán)利要求64的重組載體，其中所述a-微管蛋白啟動子包含SEQIDNO:9的核苷酸441-894，或包含與SEQIDNO:9的核苷酸441-894全長有至少約95%相同的核酸序列，其中所述核酸序列具有至少基本的a-微管蛋白啟動子轉(zhuǎn)錄活性。67.權(quán)利要求64的重組載體，其中所述重組載體包含選自SEQIDNO:8或SEQIDNO:9的核酸序列。68.權(quán)利要求64的重組載體，其中所述來自破囊壺菌目聚酮化合物合酶(PKS)系統(tǒng)的啟動子包含SEQIDNO:34或其至少具有基本的PKS啟動子轉(zhuǎn)錄活性的片段。全文摘要本發(fā)明公開了均來自破囊壺菌目微生物的乙酰乳酸合酶，乙酰乳酸合酶調(diào)控區(qū)，α-微管蛋白啟動子，來自破囊壺菌目聚酮化合物合酶(PKS)系統(tǒng)的啟動子，和脂肪酸脫氫酶啟動子的核酸和氨基酸序列。本發(fā)明也公開了用于破囊壺菌目微生物轉(zhuǎn)化的重組載體，和轉(zhuǎn)化破囊壺菌目微生物的方法。所述本發(fā)明的重組核酸分子可被用于外源核酸在破囊壺菌目微生物的表達(dá)，和基因在破囊壺菌目微生物的去除，突變，或滅活。文檔編號C12N1/21GK101760469SQ200910141898公開日2010年6月30日申請日期2002年4月16日優(yōu)先權(quán)日2001年4月16日發(fā)明者T·戴夫·馬修斯,保羅·G·羅斯勒,湯姆·M·拉姆西爾,詹姆斯·G·梅茨申請人:馬泰克生物科學(xué)公司