專(zhuān)利名稱(chēng)：用于工程化細(xì)胞的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)大體上涉及細(xì)胞的遺傳操作和/或重編程。特別地，提供了組合物和方法， 它們能夠操作任意細(xì)胞(例如干細(xì)胞)，包括胚胎干細(xì)胞、胎兒干細(xì)胞或祖干細(xì)胞，或者能夠重編程體細(xì)胞至分化程度較低的狀態(tài)，朝著更加多能性胚胎干細(xì)胞樣狀態(tài)。由此產(chǎn)生的干細(xì)胞或干細(xì)胞樣細(xì)胞可用于研究、醫(yī)學(xué)和其它相關(guān)領(lǐng)域。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)相關(guān)的組合物和方法。在一些方面，本發(fā)明提供了用于細(xì)胞工程化的核酸分子和方法。在具體的方面，本發(fā)明部分地提供了具有下列組分中的一項(xiàng)或多項(xiàng)(例如1、2、3 或4項(xiàng))的核酸分子(例如，分離的核酸分子):(a) OriP位點(diǎn)，(b)編碼EBNAl的DNA區(qū)段； (c) 一個(gè)或多個(gè)(例如1、2、3、4、5、6、7、8等)重組位點(diǎn)(例如一個(gè)或多個(gè)att位點(diǎn))；和/ 或(d)至少一個(gè)可選擇標(biāo)志物(例如，至少一個(gè)陽(yáng)性或陰性可選擇標(biāo)志物，包括至少一個(gè)陽(yáng)性可選擇標(biāo)志物和至少一個(gè)陰性可選擇標(biāo)志物)。雖然在多數(shù)情況下，本發(fā)明涉及EBV病毒的EBNAl蛋白，但本發(fā)明也包括源自其它游離病毒例如腺相關(guān)病毒(AAV)、SV40、BS0LV、HIV-I等的任意其它等同的游離體維持蛋白，并且編碼這些游離體蛋白的基因和/或它們的OriP元件也可用于產(chǎn)生本發(fā)明的載體。本發(fā)明還包括具有至少兩項(xiàng)上述組分的兩種或更多種核酸分子(例如，本文中的兩種載體的混合物，其中一種載體具有OriP位點(diǎn)，另一種載體編碼EBNAl ；或者細(xì)胞系，其包含具有OriP位點(diǎn)的載體，其中細(xì)胞染色體編碼EBNA1)。這樣的兩種或更多種核酸分子可以存在于同一組合物中，或彼此分離(例如在不同的載體中，或者在試劑盒的容器中)。本發(fā)明涉及分離的核酸分子，其包含(a) OriP位點(diǎn)和編碼EBNAl的DNA區(qū)段；(b) 一個(gè)或多個(gè)att重組位點(diǎn)；和(c)編碼至少一個(gè)可選擇標(biāo)志物的DNA區(qū)段。在一個(gè)方面， EBNAl的表達(dá)可以是組成型的或可誘導(dǎo)的。本發(fā)明還涉及包含一個(gè)或多個(gè)表達(dá)盒的分離的核酸分子，其中每個(gè)表達(dá)盒與用于表達(dá)的啟動(dòng)子可操作地連接，并且可以使用一個(gè)或多個(gè)att重組位點(diǎn)中的至少一個(gè)將每個(gè)表達(dá)盒導(dǎo)入所述核酸分子中。在本發(fā)明的所有方面中，表達(dá)盒可以編碼組織特異性基因、干細(xì)胞標(biāo)志物基因或發(fā)育基因。在本發(fā)明的所有方面中，干細(xì)胞標(biāo)志物基因選自0ct4、Sox2、c-Myc和Klf4 ； 0ct3/4、Nanog、SSEAl和 TRA1-80。在本發(fā)明的所有方面中，驅(qū)動(dòng)表達(dá)盒的啟動(dòng)子選自下列的類(lèi)型細(xì)胞特異性啟動(dòng)子、組織特性啟動(dòng)子、干細(xì)胞標(biāo)志物啟動(dòng)子、發(fā)育基因啟動(dòng)子等。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，啟動(dòng)子可以是哺乳動(dòng)物來(lái)源的天然啟動(dòng)子或工程化的啟動(dòng)子，或細(xì)胞特異性啟動(dòng)子或發(fā)育階段特異性啟動(dòng)子。在本發(fā)明的所有方面中，干細(xì)胞標(biāo)志物啟動(dòng)子選自下列啟動(dòng)子0ct4、SOX2、C-MyC 和Klf4 ；0ct3/4、Nanog、SSEAl和TRA1-80。在一個(gè)實(shí)施方式中，發(fā)育階段可以是生殖細(xì)胞、 胚胎、祖細(xì)胞、胎兒、新生兒或干細(xì)胞階段。在具體的實(shí)施方式中，哺乳動(dòng)物是人。在本發(fā)明的所有方面中，可選擇標(biāo)志物可以是熒光蛋白，賦予抗生素抗性的蛋白， 或酶。在進(jìn)一步的方面，可選擇標(biāo)志物是熒光蛋白。在本發(fā)明的所有方面中，熒光蛋白可以選自綠色熒光蛋白(GFP)及其修飾的突變體、紅色熒光蛋白(RFP)及其修飾的突變體等。在具體的實(shí)施方式中，熒光蛋白是GFP。在具體的實(shí)施方式中，細(xì)胞是干細(xì)胞。在本發(fā)明的所有方面中，可選擇標(biāo)志物可以是賦予抗生素抗性的蛋白。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，抗生素可以選自四環(huán)素、新霉素、滅瘟素、潮霉素、氨比西林和嘌呤霉素。在具體的實(shí)施方式中，抗生素是潮霉素。在第二個(gè)方面，本發(fā)明涉及第一分離的核酸分子，其包含(a)全部或部分的病毒基因組；(b)0riP位點(diǎn)；(c) 一個(gè)或多個(gè)att重組位點(diǎn)；(d)任選地，編碼EBNAl的DNA區(qū)段；和(e)至少一個(gè)可選擇標(biāo)志物。在第三個(gè)方面，分離的核酸分子還包含(e)WPRE和/或 VSV-G元件。在一些方面，編碼EBNAl的DNA區(qū)段在同一核酸分子上。在其它方面，編碼EBNAl的DNA區(qū)段在第二分離的核酸分子上，并進(jìn)一步包含(a) 全部或部分的病毒基因組；(b)0riP位點(diǎn)；(c) 一個(gè)或多個(gè)att重組位點(diǎn)；和(d)至少一個(gè)可選擇標(biāo)志物。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及分離的核酸分子，其包含(a)全部或部分的病毒基因組； (b) 一個(gè)或多個(gè)由啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)盒；(c)至少一個(gè)可選擇標(biāo)志物；和(d)任選地，編碼 WPRE和/或VSV-G元件的DNA區(qū)段。在一個(gè)實(shí)施方式中，病毒基因組來(lái)自昆蟲(chóng)病毒、腺病毒、慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，病毒基因組來(lái)自昆蟲(chóng)病毒。在具體的實(shí)施方式中，昆蟲(chóng)病毒是桿狀病毒。本發(fā)明的一個(gè)方面涉及以本文定義的一種或多種核酸分子轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，每個(gè)核酸分子攜帶至少一個(gè)用于重編程所述細(xì)胞的表達(dá)盒。在進(jìn)一步的方面，細(xì)胞是干細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞是成年體細(xì)胞。本發(fā)明涉及如上文描述的載體的多種用途。在一個(gè)方面，載體用于重編程細(xì)胞分化。在所有的方面，細(xì)胞是干細(xì)胞，如胚胎干細(xì)胞、新生兒干細(xì)胞、胎兒干細(xì)胞、幼年干細(xì)胞或成年干細(xì)胞；或原代細(xì)胞，如胎兒原代細(xì)胞、幼年原代細(xì)胞或成年原代細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，對(duì)于可誘導(dǎo)的病毒載體，可誘導(dǎo)的調(diào)控是通過(guò)操縱子。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，操縱子是Tet操縱子。本發(fā)明涉及以下細(xì)胞系pEPEG-BG01V和pEPOG-BGOlV細(xì)胞系。本發(fā)明涉及用于重編程細(xì)胞的方法，包括將本發(fā)明的質(zhì)粒和/或病毒載體導(dǎo)入細(xì)胞；在合適的培養(yǎng)條件下在所述細(xì)胞中表達(dá)所編碼的一種或多種多肽；鑒定所述細(xì)胞是否被重編程。本發(fā)明還涉及針對(duì)0ct4啟動(dòng)子的雙鏈RNA序列。本發(fā)明還涉及用于重編程細(xì)胞的方法，包括將一個(gè)或多個(gè)小RNA分子導(dǎo)入細(xì)胞或在細(xì)胞中表達(dá)一個(gè)或多個(gè)小RNA分子；鑒定所述細(xì)胞是否被重編程，其中所述小RNA分子與干細(xì)胞標(biāo)志物基因的啟動(dòng)子區(qū)相互作用。在一些方面，本發(fā)明涉及用于重編程細(xì)胞的方法，包括將本發(fā)明的質(zhì)粒和/或病毒載體和/或針對(duì)干細(xì)胞標(biāo)志物或細(xì)胞特異性標(biāo)志物的雙鏈RNA序列導(dǎo)入細(xì)胞。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生經(jīng)重編程的干細(xì)胞群體的方法，包括將本發(fā)明的載體組合物導(dǎo)入細(xì)胞；在合適的培養(yǎng)條件下在干細(xì)胞中表達(dá)所編碼的一種或多種多肽；鑒定所述干細(xì)胞是否被重編程；在培養(yǎng)物中繁殖并維持經(jīng)重編程的干細(xì)胞。本發(fā)明還涉及用于重編程細(xì)胞至更加干細(xì)胞樣的去分化狀態(tài)的方法，或指引細(xì)胞朝向特定細(xì)胞譜系的方法，或重編程細(xì)胞例如患病的細(xì)胞、癌細(xì)胞等的方法，或重編程細(xì)胞至誘導(dǎo)的多能細(xì)胞(iPSC)的方法。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明中產(chǎn)生的病毒載體的病毒顆粒。具體而言，本發(fā)明涉及包含 SEQ ID NO 3,SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO 10, SEQ ID NO =IUSEQ ID NO: 12,SEQ ID NO :49中定義的核酸的病毒顆粒。本發(fā)明還涉及包含SEQ ID NO 2和8中定義的核酸以及包含可以重編程的基因的病毒顆粒。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明中產(chǎn)生的病毒載體的試劑盒。具體而言，本發(fā)明涉及包含SEQ ID NO 3,SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :9、SEQ IDNO :10、SEQ ID NO =IUSEQ ID NO :12, SEQ ID NO :49中定義的核酸的試劑盒。本發(fā)明還涉及包含SEQ ID NO :2和8中定義的核酸以及包含可以重編程的基因的試劑盒。在一些方面，本發(fā)明涉及通過(guò)下列步驟產(chǎn)生誘導(dǎo)的多能細(xì)胞(iPSC)的方法(i) 將本發(fā)明的核酸分子(質(zhì)粒載體、病毒載體)單獨(dú)或聯(lián)合導(dǎo)入細(xì)胞；(ii)在合適的培養(yǎng)條件下在所述細(xì)胞中表達(dá)所編碼的一種或多種多肽；(iii)鑒定所述細(xì)胞是否被重編程。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及通過(guò)如上定義的方法產(chǎn)生的誘導(dǎo)的多能細(xì)胞(iPSC)。在具體的方面，本發(fā)明涉及分離的核酸分子，其包含(a)OriP位點(diǎn)；(b)在組成型啟動(dòng)子控制下的編碼EBNAl基因的DNA區(qū)段；(c) 一個(gè)或多個(gè)att重組位點(diǎn)；和(d)編碼至少一個(gè)可選擇標(biāo)志物的DNA區(qū)段。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明涉及分離的核酸分子，其包含(a)OriP位點(diǎn)； (b)在可誘導(dǎo)啟動(dòng)子控制下的編碼EBNAl基因的DNA區(qū)段；(c) 一個(gè)或多個(gè)att重組位點(diǎn)； 和(d)編碼至少一個(gè)可選擇標(biāo)志物的DNA區(qū)段。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明涉及分離的核酸分子，其包含(a)全部或部分的桿狀病毒基因組；(b) OriP位點(diǎn)；(c) 一個(gè)或多個(gè)att重組位點(diǎn)；(d)在組成型啟動(dòng)子控制
9下的編碼EBNAl基因的DNA區(qū)段；和(e)至少一個(gè)可選擇標(biāo)志物；(f)任選地，WPRE和/或 VSV-G元件。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明涉及分離的核酸分子，其包含(a)全部或部分的桿狀病毒基因組；(b) OriP位點(diǎn)；(c) 一個(gè)或多個(gè)att重組位點(diǎn)；(d)在可誘導(dǎo)啟動(dòng)子控制下的編碼EBNAl基因的DNA區(qū)段；和(e)至少一個(gè)可選擇標(biāo)志物；(f)任選地，WPRE和/或 VSV-G元件。
具體實(shí)施例方式A.定義在以下的描述中，大量應(yīng)用了細(xì)胞生物學(xué)(例如干細(xì)胞生物學(xué))和重組核酸技術(shù)中使用的多個(gè)術(shù)語(yǔ)。除非另有定義，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常的理解相同的含義。本領(lǐng)域技術(shù)人員還將認(rèn)識(shí)到很多類(lèi)似于或等同于本文描述的方法和材料，這些可用于實(shí)施本發(fā)明。事實(shí)上，本發(fā)明不以任何方式受限于所描述的方法和材料。為了清楚和更一致地理解本發(fā)明的說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求，包括這些術(shù)語(yǔ)的范圍，給出以下下列術(shù)語(yǔ)的定義。干細(xì)胞(SC)如本文使用的術(shù)語(yǔ)“干細(xì)胞”可以是能夠發(fā)育成多種特化的細(xì)胞和組織的未特化的、“自我更新”的細(xì)胞。自我更新可以意味著細(xì)胞在合適的培養(yǎng)條件下具有無(wú)限期分裂的能力(即，它們不衰老，或者可以分裂超過(guò)20次群體加倍，而非更新細(xì)胞通常會(huì)衰老和分裂不超過(guò)20次群體加倍)，同時(shí)在特定的培養(yǎng)條件下產(chǎn)生特化的細(xì)胞。自我更新可以受到特定的分子網(wǎng)絡(luò)的嚴(yán)密控制。“胚胎干細(xì)胞”(ESC)是存在于早期胚胎中的未分化的細(xì)胞，通常衍生于一組被稱(chēng)作內(nèi)細(xì)胞群的細(xì)胞，內(nèi)細(xì)胞群是胚泡的一部分。胚胎干細(xì)胞是自我更新的，并且能夠形成存在于體內(nèi)的所有的特化細(xì)胞類(lèi)型(它們是多能的)。ESC包括人類(lèi)來(lái)源的ESC(hESC)和非人類(lèi)或動(dòng)物來(lái)源的ESC。ESC在合適的條件下通?？梢员环敝扯话l(fā)生分化，這是由于它們的自我更新性質(zhì)?！芭咛ド臣?xì)胞”是多能干細(xì)胞，通常源自早期生殖細(xì)胞(那些將成為精子和卵子的細(xì)胞)。胚胎生殖細(xì)胞(EG細(xì)胞)被認(rèn)為具有類(lèi)似于胚胎干細(xì)胞的性質(zhì)。如本文使用的“多潛能(multipotent) ”或“多能(pluripotent) ”干細(xì)胞具有發(fā)育成身體的一種以上的細(xì)胞類(lèi)型的能力。然而，多能細(xì)胞一般不能形成所謂的“胚外”組織， 例如羊膜、絨毛膜和胎盤(pán)的其它成分。多能性可以這樣證明提供證據(jù)證明即使在延長(zhǎng)的培養(yǎng)后，仍然具有穩(wěn)定的發(fā)育潛力并能夠從單一細(xì)胞的子代形成所有三個(gè)胚層的衍生物；并且證明在注射進(jìn)入免疫抑制小鼠后具有產(chǎn)生畸胎瘤的能力。多能性可以受到特定的分子網(wǎng)絡(luò)的嚴(yán)密控制?！叭芨杉?xì)胞”具有產(chǎn)生構(gòu)成身體的所有細(xì)胞類(lèi)型以及構(gòu)成胚外組織例如胎盤(pán)的所有細(xì)胞類(lèi)型的能力?！白婕?xì)胞”可以是能夠分化的干細(xì)胞的早期后代，其具有分化成特定細(xì)胞類(lèi)型的能力。祖細(xì)胞的分化程度比干細(xì)胞高。有時(shí)候可以發(fā)現(xiàn)術(shù)語(yǔ)“干細(xì)胞”和“祖細(xì)胞”在文獻(xiàn)中等同使用?！俺赡旮杉?xì)胞”可以獲自多種來(lái)源，其中有成體的血液、骨髓、腦、胰腺、皮膚和脂肪。成年干細(xì)胞能夠自我更新并分化以產(chǎn)生特化細(xì)胞類(lèi)型的有限貯庫(kù)，所述特化細(xì)胞類(lèi)型通常是該成年干細(xì)胞所起源的組織類(lèi)型。在一些情況下，在一些生長(zhǎng)條件下，某些成年干細(xì)胞能夠產(chǎn)生與其它組織相關(guān)的細(xì)胞類(lèi)型(多潛能)?！绑w干細(xì)胞”是非胚胎干細(xì)胞，其不是源自生殖細(xì)胞(卵細(xì)胞或精子細(xì)胞)。這些體干細(xì)胞可以是胎兒的、新生兒的、幼年的或成年來(lái)源。定向分化操作干細(xì)胞培養(yǎng)條件以誘導(dǎo)分化為特定細(xì)胞類(lèi)型，在該過(guò)程中，未分化的胚胎細(xì)胞獲得特化細(xì)胞例如心臟、肝臟或肌細(xì)胞的特征?！翱伤苄浴眮?lái)自一種類(lèi)型的分化組織的干細(xì)胞產(chǎn)生另一種組織的分化的細(xì)胞類(lèi)型的能力。在本發(fā)明的一些方面表達(dá)的想要的基因是“重編程基因或可以重編程的基因”。如本文使用的詞語(yǔ)“重編程基因或可以重編程的基因”可以是發(fā)育基因或發(fā)育基因的靶核酸區(qū)段，或“干細(xì)胞標(biāo)志物基因”，當(dāng)在給定細(xì)胞中表達(dá)它們時(shí)，由于一個(gè)或多個(gè)可以重編程的基因產(chǎn)物的表達(dá)而將所給定細(xì)胞的表型改變?yōu)椴煌谋硇?。可以為了任何原因進(jìn)行重編程，例如，在一些情況下是為了達(dá)到分化程度較低的狀態(tài)，或分化程度更高的狀態(tài)，或?yàn)榱硕ㄏ蚍只＜?，可以進(jìn)行重編程以改變細(xì)胞的分化能力。例如，本發(fā)明的方法可以從分化程度較高的階段實(shí)現(xiàn)更加干細(xì)胞樣的狀態(tài)；或者從癌癥狀態(tài)實(shí)現(xiàn)更加非癌癥的狀態(tài)，或者從患病細(xì)胞實(shí)現(xiàn)無(wú)疾病狀態(tài)等。如上文所討論，“重編程基因或可以重編程的基因”還可以指 “干細(xì)胞標(biāo)志物基因”，例如0ct4(也稱(chēng)作0ct-3或0ct3/4)、Sox2、c-Myc和Klf4 ；0ct3/4、 Nanog, SSEAl (階段特異性胚胎抗原)、TRA1-80等基因，其可用于重編程細(xì)胞。“發(fā)育基因”或“干細(xì)胞標(biāo)志物”給定基因的表達(dá)或其啟動(dòng)子的活性可能僅限于發(fā)育的特定階段、細(xì)胞譜系或細(xì)胞類(lèi)型、分化狀態(tài)。此類(lèi)基因的啟動(dòng)子可以共同被稱(chēng)作發(fā)育啟動(dòng)子。通常與這些啟動(dòng)子相關(guān)的基因是發(fā)育調(diào)節(jié)的基因。在本發(fā)明中討論了多個(gè)干細(xì)胞特異性發(fā)育基因。干細(xì)胞標(biāo)志物包括但不限于例如0ct4(也稱(chēng)作Oct-3或0ct3/4)、 Sox2、c-Myc 和 Klf4 ；0ct3/4、Nanog、SSEAl (階段特異性胚胎抗原)、TRA1-80 等基因。獨(dú)特的表達(dá)標(biāo)志物也被用于表征多種干細(xì)胞群體，例如，對(duì)于造血干細(xì)胞而言是⑶34、⑶133、 ABCG2、Sca-I等；對(duì)于間充質(zhì)/間質(zhì)干細(xì)胞而言是STR0-1等；對(duì)于神經(jīng)干細(xì)胞而言是巢蛋白、PSA-NCAM、p75、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白R(shí)(NTR)等。分化的胚層也具有獨(dú)特的標(biāo)志物對(duì)神經(jīng)元而言是bill微管蛋白、巢蛋白；對(duì)中胚層而言是SMA、平滑肌肌動(dòng)蛋白；對(duì)內(nèi)胚層而言是α胎兒蛋白。“誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞”(iPSC)可以是部分或完全分化的細(xì)胞可以通過(guò)迫使表達(dá)對(duì)于維持其“干細(xì)胞性”具有重要意義的基因或因子而將其重編程為更加胚胎干細(xì)胞樣的狀態(tài)，例如ESC。當(dāng)在允許增殖而不分化的體外條件下培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞數(shù)月至數(shù)年時(shí)，可以產(chǎn)生 “胚胎干細(xì)胞系”；即，它們不衰老，或者可以分裂超過(guò)20次群體加倍，而非更新細(xì)胞通常會(huì)衰老和分裂不超過(guò)20次群體加倍。可以通過(guò)將推定的干細(xì)胞注射進(jìn)入具有功能異常的免疫系統(tǒng)的小鼠來(lái)建立“畸胎瘤”。由于注射的細(xì)胞不能被小鼠的免疫系統(tǒng)破壞，所以這些細(xì)胞生存下來(lái)并形成被稱(chēng)作畸胎瘤的多層良性腫瘤。雖然腫瘤通常不是想要的結(jié)果，但是在該測(cè)試中，畸胎瘤用于確立任何干細(xì)胞產(chǎn)生體內(nèi)的所有細(xì)胞類(lèi)型的能力。這可能是由于畸胎瘤包含源自三個(gè)胚層中的每
11一個(gè)胚層的細(xì)胞。“原代細(xì)胞”可以是獲自任意給定組織的細(xì)胞(例如，皮膚產(chǎn)生角化細(xì)胞或黑素細(xì)胞原代培養(yǎng)物)，其可以在合適的細(xì)胞培養(yǎng)物中在體外繁殖有限數(shù)目的世代(即，它們迅速衰老)，因?yàn)樵?xì)胞未經(jīng)過(guò)修飾(或永生化)以進(jìn)行無(wú)限細(xì)胞增殖。由于原代細(xì)胞不是永生的，所以相對(duì)于獲自例如永生細(xì)胞系的數(shù)據(jù)而言，獲自原代細(xì)胞的基因組和/或細(xì)胞功能數(shù)據(jù)一般被認(rèn)為是更接近于體內(nèi)情況。如本文使用的“啟動(dòng)子”可以是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，或者可以是一般位于基因的5’區(qū)或接近于起始密碼子的核酸，或編碼非翻譯RNA的核酸。通常在啟動(dòng)子處或接近啟動(dòng)子處起始鄰近的核酸區(qū)段的轉(zhuǎn)錄。另外，啟動(dòng)子可以是組成型或可調(diào)節(jié)的(例如可誘導(dǎo)的和/或可抑制的)?！翱烧T導(dǎo)啟動(dòng)子”可以是這樣的啟動(dòng)子基因的表達(dá)受到被稱(chēng)作“誘導(dǎo)劑”或“誘導(dǎo)試劑”的外來(lái)刺激劑的控制?？烧T導(dǎo)元件是與啟動(dòng)子聯(lián)合作用并結(jié)合阻抑子(例如大腸桿菌中的Tet阻抑系統(tǒng))或誘導(dǎo)子(例如酵母中的gall/GAL4誘導(dǎo)子系統(tǒng))的DNA序列元件。 可誘導(dǎo)啟動(dòng)子或其表達(dá)系統(tǒng)的實(shí)例包括四環(huán)素或乳糖操縱子、熱擊蛋白(hsp70)操縱子、 金屬可誘導(dǎo)啟動(dòng)子、類(lèi)固醇激素可誘導(dǎo)啟動(dòng)子等?？烧T導(dǎo)啟動(dòng)子可以被稱(chēng)作是可調(diào)節(jié)的?！敖M成型啟動(dòng)子”可以是這樣的啟動(dòng)子在該啟動(dòng)子控制下的基因表達(dá)一般是開(kāi)啟的，或者在不存在任何外部刺激的條件下表達(dá)，并且可以不受阻抑劑的抑制。一般而言，為了本發(fā)明的目的，使用強(qiáng)啟動(dòng)子例如病毒啟動(dòng)子以實(shí)現(xiàn)基因的高效表達(dá)。組成型啟動(dòng)子的效率可以是不同的，并且可以受到例如代謝條件的影響?！翱梢种啤眴?dòng)子的轉(zhuǎn)錄速率響應(yīng)于阻抑劑而降低。抑制啟動(dòng)子的“阻抑劑”可以是小分子或蛋白質(zhì)?？梢韵蚣?xì)胞中添加阻抑劑或者可以例如通過(guò)“操縱子”共表達(dá)阻抑齊U。 可用于本發(fā)明的此類(lèi)操縱子的實(shí)例包括Tet阻抑子系統(tǒng)。此處，可以事實(shí)上“關(guān)閉”轉(zhuǎn)錄直至啟動(dòng)子抑制被解除或啟動(dòng)子被誘導(dǎo)，在該時(shí)點(diǎn)轉(zhuǎn)錄可以是“開(kāi)啟的”?？梢种频膯?dòng)子可以被稱(chēng)作是可調(diào)節(jié)的?！安倏v子”可以是核酸區(qū)段的功能單元，其包括操作元件(operator)、通常的啟動(dòng)子和一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)基因，在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中其作為一個(gè)單元被控制以產(chǎn)生信使RNA(mRNA)?！敖M織特異性啟動(dòng)子”以組織依賴(lài)性方式并根據(jù)發(fā)育階段來(lái)控制基因表達(dá)。通過(guò)組織特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)基因?qū)⒅饕獌H在需要該轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的組織中表達(dá)，使大多數(shù)動(dòng)物 /植物的其余組織不受轉(zhuǎn)基因表達(dá)的影響。組織特異性啟動(dòng)子可以被內(nèi)源性或外源性因子誘導(dǎo)，所以它們有時(shí)被分類(lèi)為可誘導(dǎo)啟動(dòng)子或可抑制啟動(dòng)子。雖然優(yōu)選使用來(lái)自同源物種或密切相關(guān)物種的啟動(dòng)子以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因在特定組織中的有效和可信賴(lài)的表達(dá)，但是在一些情況下也可以使用來(lái)自不相關(guān)物種的具有可信賴(lài)和有效表達(dá)的啟動(dòng)子。當(dāng)用于指稱(chēng)核酸分子或其它生物分子(例如蛋白質(zhì))時(shí)，“分離的”意思是相對(duì)于相同類(lèi)型的其它分子而言，該分子為高濃度。換言之，當(dāng)核酸分子占所存在的總核酸的至少50% (例如，50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上、97%以上或 99%以上)時(shí)(按總重量或存在的分子數(shù))，核酸分子(例如DNA分子)被稱(chēng)作是“分離的”。這也適用于其它生物分子?！昂怂釁^(qū)段”或“DNA區(qū)段”(在本文中視需要相互替換地使用)可以是核酸分子的全部或一個(gè)區(qū)域。在很多情況下，核酸區(qū)段可以含有、包含或編碼基因產(chǎn)物或基因、限制性
12位點(diǎn)、重組位點(diǎn)、復(fù)制起始點(diǎn)、調(diào)節(jié)序列、啟動(dòng)子序列、增強(qiáng)子序列、多聚腺苷化(poly Α)序列或任意其它調(diào)節(jié)或識(shí)別序列。“載體”是可復(fù)制的核酸分子，其可以在細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移。載體的實(shí)例包括但不限于 質(zhì)粒、噬菌體(例如λ噬菌體)、細(xì)菌人工染色體(BAC)、酵母人工染色體(YAC)或病毒載體，例如那些基于慢病毒、腺病毒、桿狀病毒等的病毒載體。載體可以被設(shè)計(jì)為可以將核酸區(qū)段導(dǎo)入其中。本發(fā)明的一個(gè)方面涉及“質(zhì)粒載體”，其是可復(fù)制的核酸分子，不包含病毒骨架序列，或者主要地不包含病毒序列的大的部分?！安《据d體”構(gòu)成本發(fā)明的一部分，其可用于將大量的遺傳物質(zhì)有效遞送進(jìn)入細(xì)胞。通過(guò)病毒或病毒載體進(jìn)行的基因遞送可以稱(chēng)作轉(zhuǎn)導(dǎo)，被感染的細(xì)胞被稱(chēng)作經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的。病毒載體的構(gòu)建通常包括除掉病毒基因組的部分，即，編碼或調(diào)節(jié)不想要的或可有可無(wú)的病毒功能的部分，例如，涉及在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行病毒復(fù)制或感染的部分。可以設(shè)計(jì)最簡(jiǎn)“病毒基因組DNA骨架”以有效遞送大量的遺傳物質(zhì)。此外，本發(fā)明的病毒載體通常包含合適的位點(diǎn)以克隆多個(gè)可以重編程的基因，例如，任意合適的重組克隆系統(tǒng)，例如 MultiSite Gateway 克隆系統(tǒng)、用于維持游離的EBNAl-OriP系統(tǒng)等。典型的病毒基因組(適于產(chǎn)生載體)可以是昆蟲(chóng)病毒基因組，雖然也可以使用其它病毒基因組(例如，腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒等)。本文使用的典型的昆蟲(chóng)病毒可以是桿狀病毒，雖然也可以使用其它非哺乳動(dòng)物病毒。本發(fā)明的方法可以使用桿狀病毒科的病毒(通常被稱(chēng)作桿狀病毒)以在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)異源基因。除了桿狀病毒科以外，其它僅在無(wú)脊椎動(dòng)物中天然復(fù)制的病毒(例如 MNPV、SNPV病毒以及美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，731，182的表1中列舉的其它病毒；該文獻(xiàn)通過(guò)引用方式全文并入本文)可用于本發(fā)明中的基因遞送。在本發(fā)明中開(kāi)發(fā)了新的基因遞送病毒載體，其不穩(wěn)定整合進(jìn)入細(xì)胞的基因組，而是(i)由于EBNAl基因的組成型表達(dá)而保持穩(wěn)定地游離；或(ii)由于EBNAl基因的可誘導(dǎo)表達(dá)，可以被誘導(dǎo)以使重編程基因在重編程期間持續(xù)表達(dá)，然后，一旦細(xì)胞被重編程，或者達(dá)到了想要的重編程水平，可以被關(guān)閉。這些基因遞送病毒載體可以在給定的時(shí)間將一個(gè)或多個(gè)重編程基因?qū)虢o定的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。病毒載體系統(tǒng)一般使用昆蟲(chóng)病毒作為基因遞送系統(tǒng)(例如，桿狀病毒)；在本發(fā)明中，使用了如表1中描述的BacMam Ver 1和BacMam Ver 2家族的載體。這些載體攜帶一個(gè)或多個(gè)基因，或一組重編程基因，進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞。 桿狀病毒的骨架用于產(chǎn)生BacMam病毒載體。表1中描述的BacMam Ver 2家族的載體即 [SEQ ID NO :8，9，10，11，12]另外還包含WPRE (土撥鼠肝炎轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件)和VSV-G表達(dá)盒(水皰性口炎病毒G蛋白)，其介導(dǎo)病毒進(jìn)入多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞。本發(fā)明的病毒載體定義于表1 (見(jiàn)實(shí)施例)。表達(dá)載體的一個(gè)主要目的是控制想要的基因在宿主細(xì)胞或生物體內(nèi)表達(dá)。通常需要控制表達(dá)以將靶DNA插入至特定啟動(dòng)子控制下的位點(diǎn)。一般而言，表達(dá)載體可以具有一個(gè)或多個(gè)下列特征啟動(dòng)子、啟動(dòng)子-增強(qiáng)子序列、至少一個(gè)可選擇標(biāo)志物、至少一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)、可誘導(dǎo)元件序列、可抑制元件序列、表位-標(biāo)簽序列等。重組克隆系統(tǒng)(例如，Gateway或MultiSite Gateway 等)可用于產(chǎn)生要在本發(fā)明中表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)基因的“表達(dá)盒”?！氨磉_(dá)盒”包含由啟動(dòng)子(例如天然啟動(dòng)子，或所選的任意其它需要的啟動(dòng)子，以實(shí)現(xiàn)一定水平的表達(dá)，或?qū)崿F(xiàn)合適的時(shí)間性表達(dá)，或?qū)崿F(xiàn)在想要的細(xì)胞或組織中的表達(dá)等)驅(qū)動(dòng)的待表達(dá)的想要的基因。給定的載體可以包含一個(gè)或多個(gè)(例如，2、3、4、5、7、10、12、15、20、30、50等)個(gè)基因，或基因的集合，或基因的一個(gè)或多個(gè)部分。本發(fā)明的載體可以利用編碼“可選擇標(biāo)志物”的基因。如本文使用的詞語(yǔ)“可選擇標(biāo)志物”可以是任意標(biāo)志物基因，在導(dǎo)入宿主細(xì)胞后，其允許進(jìn)行該細(xì)胞的分離，因?yàn)樵谠摷?xì)胞內(nèi)表達(dá)該標(biāo)志物而在其它細(xì)胞中不表達(dá)該標(biāo)志物。在一些實(shí)施方式中，所述標(biāo)志物基因整合進(jìn)入宿主基因組。在其它實(shí)施方式中，所述標(biāo)志物不整合進(jìn)入宿主基因組，而是保持在游離載體中?！翱蛇x擇標(biāo)志物”可以組成型表達(dá)、可誘導(dǎo)地表達(dá)，或者其表達(dá)由于抑制其表達(dá)的阻抑劑或蛋白的共表達(dá)而被阻抑。合適的可選擇標(biāo)志物包括但不限于抗生素抗性基因，例如四環(huán)素、新霉素、滅瘟素、潮霉素、氨比西林、嘌呤霉素等，和本領(lǐng)域已知的其它合適的抗生素?？蛇x擇標(biāo)志物還可以包括但不限于，熒光蛋白基因，包括但不限于，綠色熒光蛋白及其修飾的突變體、紅色熒光蛋白及其修飾的突變體等?？蛇x擇標(biāo)志物還可以包括但不限于，基因，例如氯霉素轉(zhuǎn)移酶基因(CAT)、次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因、二氫乳清酸酶基因、谷氨酰胺合成酶基因、 組氨酸D基因、氨甲酰磷酸合酶基因、二氫葉酸還原酶基因、多藥物抗性1基因、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶基因、黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因、腺苷脫氨基酶基因、胸苷激酶基因寸?！罢{(diào)節(jié)序列”包括如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知和使用的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、阻抑子、內(nèi)含子、多聚A序列、3’ UTR等?？梢员粚?dǎo)入宿主細(xì)胞的核酸分子包括但不限于這樣的核酸分子其包含(1)能夠重編程細(xì)胞的發(fā)育階段的一個(gè)基因或一組基因；( 能夠操控一個(gè)多個(gè)位于下游的基因的表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列(例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、阻抑子等)；C3)復(fù)制起始點(diǎn) (ORI) ； (4) 一個(gè)或多個(gè)可選擇標(biāo)志物，其包括抗生素抗性基因；( 一個(gè)或多個(gè)克隆進(jìn)入位點(diǎn)；(6) —個(gè)或多個(gè)限制性位點(diǎn)，以及其它的成分。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞可以是“干細(xì)胞”。如本文使用的詞語(yǔ)“重組位點(diǎn)”可以是核酸分子上的識(shí)別序列，其通過(guò)重組蛋白參與整合/重組反應(yīng)。重組位點(diǎn)是參與的核酸分子上的不連續(xù)的核酸部分或區(qū)段，其在整合或重組的最初階段被位點(diǎn)特異性重組蛋白識(shí)別和結(jié)合。例如，Cre重組酶的重組位點(diǎn)是 IoxP,其是34個(gè)堿基對(duì)的序列包含側(cè)接于8個(gè)堿基對(duì)的核心序列的兩個(gè)13個(gè)堿基對(duì)的反向重復(fù)序列(作為重組酶結(jié)合位點(diǎn))(見(jiàn)Sauer，B. ,Curr. Opin. Biotech. 5 :521-527(1994) 中的

圖1)。識(shí)別序列的其它實(shí)例包括如本文描述的attB、attP、attL和attR序列，及其突變體、片段、變體和衍生物，它們被重組蛋白Int識(shí)別并且被輔助蛋白整合宿主因子(IHF)、 FIS 和截除酶(Xis)識(shí)別(見(jiàn) Landy，Curr. Opin. Biotech. 3 :699-707 (1993))?？梢酝ㄟ^(guò)任意已知的方法將重組位點(diǎn)添加到分子中。例如，可以通過(guò)平末端連接、 使用完全或部分隨機(jī)引物進(jìn)行的PCR，或使用側(cè)接重組位點(diǎn)的限制性位點(diǎn)將核酸分子插入載體中而將重組位點(diǎn)添加到核酸分子中?？捎糜趯?shí)施本發(fā)明的重組位點(diǎn)的實(shí)例包括但不限于1οχΡ位點(diǎn)；IoxP位點(diǎn)的突變體、變體或衍生物，例如1οχΡ511(見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，851，808) ；frt位點(diǎn)；frt位點(diǎn)的突變體、 變體或衍生物；dif位點(diǎn)；dif位點(diǎn)的突變體、變體或衍生物；psi位點(diǎn)；psi位點(diǎn)的突變體、變體或衍生物；cer位點(diǎn)；和cer位點(diǎn)的突變體、變體或衍生物。如本文使用的詞語(yǔ)“重組克隆”可以是這樣的方法，例如在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，888，732 和6，143，557(其內(nèi)容通過(guò)引用方式全文并入本文)中描述的方法，其中核酸分子的區(qū)段或此類(lèi)分子的群體在體外或在體內(nèi)被交換、插入、替換、置換或修飾。重組克隆方法包括涉及使用Gateway 系統(tǒng)(InvitrogenCorp. ,Carlsbad,CA) 的方法?！癕ultiSite Gateway ”是重組克隆系統(tǒng)，其中將兩種以上的核酸分子組合以形成單一的核酸分子。在一個(gè)實(shí)例中，載體可以包含被稱(chēng)作Si、S2、S3和S4的4個(gè)重組位點(diǎn)，其中彼此任意兩個(gè)不會(huì)發(fā)生重新組合。一個(gè)核酸區(qū)段通過(guò)與位點(diǎn)Sl和S2重組而插入載體中，另一個(gè)核酸區(qū)段通過(guò)與位點(diǎn)S3和S4重組而插入載體中。因此，產(chǎn)生了新的重新組合的載體，其包含這兩個(gè)核酸區(qū)段?！癕ultiSite Gateway ”的實(shí)施方式描述于美國(guó)專(zhuān)利
發(fā)明者B·塔亞加拉簡(jiǎn), D·湯普森, E·威爾遜, G·施普雷, G·翰森, J·查斯納特, L·蔡斯, P·利尤, R·貝內(nèi)特, U·拉克施米帕瑟, V·阿尼斯特 申請(qǐng)人:生命技術(shù)公司