用于微生物細胞和微生物油的巴氏消毒方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了用于微生物細胞和微生物油的巴氏消毒方法。本發(fā)明公開了一種改良的巴氏消毒方案，用以對微生物細胞進行巴氏消毒。所述方案具有三個階段，即第一加熱階段，第二平臺階段，其間細胞被保持于(最高且)恒定的溫度，以及第三冷卻階段。加熱和冷卻階段都是迅速的，加熱階段中，細胞的溫度在不超過30分鐘內(nèi)經(jīng)歷從40℃至80℃。加熱速率為至少0.5℃/分鐘，冷卻期間為至少-0.5℃/分鐘。平臺最高溫度為70℃至85℃。通過將巴氏消毒方案繪制成時間(t，分鐘)對溫度(T，℃)的曲線圖，能獲得一個面積小于13,000℃·分鐘的梯形。這不僅僅使得能量輸入更少(而且成本因此而降低)，而且還能得到過氧化值(POV)低于1.5且茴香胺值(AnV)低于1.0的質量更好(和更少被氧化)的油。
【專利說明】用于微生物細胞和微生物油的巴氏消毒方法
[0001] 本申請是基于申請日為2003年6月20日， 優(yōu)先權日:為2002年6月19日，申請?zhí)?為201010141637. 4,發(fā)明名稱為："用于微生物細胞和微生物油的巴氏消毒方法"的專利申 請的分案申請。

【技術領域】
[0002] 本發(fā)明涉及一種對微生物細胞進行巴氏消毒的方法，包括在不超過30分鐘之內(nèi) 將細胞從40°C加熱到70°C。該巴氏消毒過程中，加熱速率可以為至少0.5°C/分鐘。所述 巴氏消毒方法可以包含三個階段，即加熱階段、平臺（其間細胞被保持于恒定的溫度）以 及冷卻階段。如果用繪圖方式來描述該巴氏消毒方案，則其在時間（分鐘）對溫度（°C) 曲線圖下的面積小于13, 000°C ·分鐘。巴氏消毒后，可以從細胞中提取出多不飽和脂肪酸 (polyunsaturated fatty acid, PUFA)，例如花生四烯酸，或者提取出微生物油。所述的油 可能具有低過氧化值（peroxide value，P0V)和/或低茴香胺值（anisidine value，AnV)。

【背景技術】
[0003] 多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid)，或PUFA，可以在自然界中發(fā) 現(xiàn)。各種各樣不同的PUFA由不同的單細胞生物（藻類、真菌等）產(chǎn)生。一種特別重要 的PUFA是花生四烯酸（arachidonic acid, ARA)，它是若干種長鏈多不飽和脂肪酸（Long Chain Poly-Unsaturated FattyAcid，LC-PUFA)之一?；瘜W上，花生四烯酸是順式-5,8, 11，14-二十碳四烯酸（20:4)，屬于^：-?耶六的（11-6)族。
[0004] 花生四烯酸是多種具有生物活性的化合物的主要前體，這些化合物合稱為類二十 燒酸（eicosanoid)，其中包含多種前列腺素（prostaglandin)、凝血卩惡燒（thromboxane)和 白細胞三烯（leukotriene)?；ㄉ南┧徇€是人類母乳脂類成分（lipid fraction)的組分 之一，并被認為對嬰兒的理想神經(jīng)發(fā)育來說是必要的。花生四烯酸具有各種各樣的不同應 用，包括用于嬰兒配方食品（infant formula)、食品和動物飼料。
[0005] W0-A-97/37032 (Gist-Brocades)中提到了由經(jīng)過巴氏消毒的生物物質 (biomass)來制備含有PUFA的微生物油。但是，其卻并未揭示迅速地加熱至巴氏消毒發(fā)生 的溫度或冷卻自巴氏消毒發(fā)生的溫度。此外，對巴氏消毒過程中所使用的能量總數(shù)也未有 說明。
[0006] W0-A-00/15045和W0-A-01/67886中都提到了在食物制備中使用Mucorales真菌。 上述文獻中的第一篇提到，在將細胞加入到食品中之前需要進行減少RNA的操作，并暗示 使用加熱的步驟。單獨的巴氏消毒或熱激都是可行的。第二篇文獻暗示，通過將真菌細胞 置于發(fā)酵容器內(nèi)，并使其得以"成熟（ripen) "，可以避免用加熱步驟來減少RNA的含量。
[0007] 國際專利申請PCT/EP01/08902中提到了制備油類混合物的方法，該方法通過混 合一種粗制的含ω 6PUFA的油和一種粗制的含ω 3PUFA的油，制成油類混合物，然后再對該 粗制的油類混合物進行提純。
[0008] 涉及加熱生物物質或微生物細胞的方法是已知的。從W0-A-97/37032也可以獲 知，在被提取出以油的形式存在的PUFA之前，微生物細胞可以被進行巴氏消毒。然而，本 申請人:已發(fā)現(xiàn)，一種新的巴氏消毒方法能夠提高從經(jīng)過巴氏消毒的細胞中提取到的油的質 量。具體而言，得到的油可能氧化更少或更少地被氧化，而且可能具有低過氧化值（POV)和 /或低茴香胺值（AnV)。此外，本 申請人:還發(fā)現(xiàn)，上述新的巴氏消毒方法更為高效，因為其只 需要更少的能量。故而該方法是有益的，因為其不僅提高了油的質量，而且因其需要的能量 更少從而可以降低成本。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明就此提供了一種對微生物細胞進行的改良的巴氏消毒方法。除需要更少的 能量之外，本發(fā)明的巴氏消毒方法還能得到更高質量的產(chǎn)品。
[0010] 因此，本發(fā)明的第一方面涉及一種對微生物細胞進行巴氏消毒的方法，該方法包 含：在不超過30分鐘之內(nèi)，（于一種溫度，包含）從40°C至（60°C或）70°C加熱細胞；或以 至少0. 5°C /分鐘的速率加熱細胞。該方面因此提供了在巴氏消毒期間對微生物細胞的迅 速的加熱，這樣的高加熱速率在本領域還未有披露過。雖然本領域給出過巴氏消毒的溫度， 但卻沒有對下列內(nèi)容有過正面的評價或討論，包括：加熱速率、或者該參數(shù)可能是重要的以 及相對迅速的速率能帶來益處。事實上，高加熱速率是與直覺相反的，因為它們可能被認為 會導致氧化，或者會降解從細胞中提取出來的PUFA或油。
[0011] 本發(fā)明的第二方面涉及一種對微生物細胞進行巴氏消毒的方法，該方法包含一種 包括（至少）三個階段的巴氏消毒方案。它們是：一個（第一）加熱階段、一個（第二）平 臺階段（其間，微生物細胞被保持于期望溫度，或細胞被維持在恒定和/或最高的溫度上） 以及一個（第三）冷卻階段。本發(fā)明的此方面被稱為三階段巴氏消毒方案。如果將該方案 繪制于時間對溫度的曲線圖上，將能得到一個梯形。
[0012] 本發(fā)明的第三方面涉及一種對微生物細胞進行巴氏消毒的方法，該方法包含：使 用一種巴氏消毒方案，使得在時間（分鐘）對溫度（°C)曲線圖下的面積小于13, 000°C·分 鐘。時間對溫度曲線圖下的面積給出了在巴氏消毒過程中加熱細胞所消耗的能量值?，F(xiàn)已 發(fā)現(xiàn)迅速加熱和/或迅速冷卻（分別對應于第二方面中的第一和第三階段）能提供益處， 例如一種更高質量的油。此外，較之本領域中描述過的巴氏消毒方法，上述的巴氏消毒方法 需要的能量也會減少。上述第三方面因此關系到所述巴氏消毒方法所需要的能量輸入。
[0013] 本發(fā)明的第四方面涉及一種對微生物細胞進行巴氏消毒的方法，該方法包含： (加熱細胞并且）將細胞在一個提高的溫度（T，°C )下維持一段時間（t，分鐘），例如在 平臺階段；其中乘積tT(即時間和溫度參數(shù)相乘，例如在該平臺階段）為140°C ·分鐘至 100, 800°C ·分鐘。如人們所認識到的，該第四方面與第二方面相似，因為它也含有平臺階 段。此時細胞被保持于恒定的或是最高的溫度。乘積tT因此可以代表此平臺階段在時間 對溫度曲線圖下的面積。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 圖1是三種巴氏消毒方案的溫度（°C)對時間（分鐘）的曲線圖（A和C屬于本發(fā) 明，B用作對照）；
[0015] 圖2是在三種不同溫度平臺（40°C、70°C和85°C )進行的巴氏消毒的溫度（°C )對 時間（分鐘）曲線圖；
[0016] 圖3和4是AnV(及圖3的P0V)對時間（小時）的曲線圖。
[0017] 圖5是具有兩種不同（持續(xù)/平臺）時間（8秒和300秒）的巴氏消毒的P0V(meq/ kg)和AnV對溫度（°C )的曲線圖；
[0018] 圖6和7是在五種不同溫度（60°〇、801：、1001：、1201：和140°〇下進行的兩種不 同（持續(xù)/平臺）時間（圖6為8秒，圖7為5分鐘）的溫度（°C)對時間（秒）的曲線 圖。

【具體實施方式】
[0019] 第一方面-訊諫加熱
[0020] 在該方面，細胞被加熱，從而其溫度在不超過30分鐘（例如不超過15分鐘）內(nèi)經(jīng) 歷或是從40°C至70°C (或60°C )。從40°C至70°C所經(jīng)歷的時間優(yōu)選不超過40至50分 鐘?；蛘呋虼送猓鲜黾毎灾辽侃?5°C/分鐘的速率被加熱。當然，微生物細胞可以始于 (或被加熱于）低于40°C的溫度。例如，這些細胞可以處于室溫或環(huán)境溫度。這些細胞可 以處于發(fā)酵溫度，例如30°C ±5°C。所以，當加熱（巴氏消毒）開始時，細胞可以處于20°C 至40°C，例如23°C至27°C (或者25°C或29°C至32°C或37°C)。在某些情況下，微生物細 胞可以是經(jīng)過冷卻的，例如在發(fā)酵結束之后。所以當加熱開始時，這些細胞的（初始）溫度 可以是5°C至10°C，例如7°C至9°C。
[0021] 微生物細胞可以被加熱至其溫度升高到（60°C或）70°C以上。因此，該溫度可以并 非巴氏消毒期間微生物細胞的最終溫度。事實上，細胞可以被加熱到（60°C或）70°C以上的 溫度。溫度可能升高直至達到70°C至90°C、110°C或130°C，例如75°C至87°C，最適為78°C 至84°C。巴氏消毒期間的最高溫度因此可以在上述范圍內(nèi)，但對于某些實施方式，其也可以 達到100°C、120°C或140°C。優(yōu)選地，細胞被保持或被維持于該（最高）溫度。
[0022] 因此可以認識到，對細胞的加熱可以在低于40°C的溫度下進行或從40°C開 始，達到70°C或更高。40°C至70°C的范圍可以提供更寬廣的加熱/溫度范圍的"快照 (snapshot)"，其時間（及由此的速率）可以被確定（并由此被計算）。
[0023] 可以計算出，上述的加熱（30分鐘內(nèi)從40°C至70°C )速率為1°C /分鐘。但是如 果有必要的話，速率還可以較此稍低，第一方面中的迅速加熱意味著加熱速率超過0. 5°C / 分鐘。該速率優(yōu)選為至少0. 6°C /分鐘、1. 0°C /分鐘或者甚至1. 5°C /分鐘。但是，特別快 速的加熱速率是可以考慮的，它取決于設備和被加熱的微生物細胞的體積或質量。因此本 發(fā)明中也有超過2. 0°C /分鐘或甚至2. 5°C /分鐘的加熱速率。
[0024] 可以使用專門的設備來獲得特別高的加熱速率。其可以在一段短時間內(nèi)達到高 溫，同時，這樣做能將之后被分離出來的PUFA或微生物油的氧化或破壞降至最低。因此，加 熱可以在最高溫度高達140°C、150°C或者甚至160°C下進行。優(yōu)選地，加熱可以達到100°C 至180°C之間的溫度范圍，例如120°C至160°C，優(yōu)選從130°C至150°C。采用特別迅速的加 熱儀，可以特別快地獲得上述的溫度，例如在少于一分鐘的時間（30秒）以內(nèi)。達到上述的 溫度可以僅在20、30、40或50秒內(nèi)，也可以需要150、175、200、225或250秒。然而，上述的 溫度可以在短如2、4、6、8或10秒內(nèi)達到，例如采用灌流加熱儀（infusion heater)，或是相 對較小的樣品。因此，高達每分鐘50°C、100°C、150°C或者甚至200°C的加熱速率都是可以 獲得的。稍低一些的加熱速率，每分鐘從5°C或10°C至50°C或60°C因此也是可能的，例如 每分鐘從15°C至45°C。
[0025] 已發(fā)現(xiàn)，迅速的巴氏消毒過程中的迅速加熱不僅更加高效及需能更少，而且它看 上去還是獲得更高質量的微生物油（一旦從經(jīng)過巴氏消毒后的細胞中被提取出來）的原因 中的至少一個因素。
[0026] 第二方面--三階段巴氐消毒方案
[0027] 第一階段可以是加熱階段。它實際上相當于本發(fā)明第一方面中所描述過的迅速加 熱，因此，第一方面中的所有特征和特性在經(jīng)過必要的修正后都可以應用于第二方面的第 一（加熱）階段。
[0028] 第二階段是細胞處于（溫度）平臺之時。由此細胞可以在特定的期望溫度下（正 負1°C或2°C、5°C或甚至10°C )被保持一段期望長度的時間。上述細胞由此可被維持于恒 定的溫度。該平臺階段的溫度（或溫度范圍）優(yōu)選為上述巴氏消毒方案中所達到的最高溫 度。該平臺階段的溫度（和/或巴氏消毒期間的最高溫度）優(yōu)選為至少70°C。它可以低于 90°C或100°C，適于從70°C至85°C，例如從70°C至77°C。此夕卜，它可以從80°C至160°C，例 如從 KKTC至 140°C。
[0029] 平臺階段或是細胞被保持于期望或最高溫度的時間的長度，可以從5秒至90分 鐘，例如從1或10分鐘至80分鐘，例如從20分鐘至70分鐘。該時間最適于從40或50分 鐘至60或70分鐘，例如從45分鐘至65分鐘，從55分鐘至63分鐘是有益的。特別短的時 間，例如從8秒至5分鐘，也是可能的。
[0030] 第三階段是冷卻階段。優(yōu)選地，細胞被冷卻至與前面所提到的加熱（或第一階段） 伊始時的溫度范圍相同或在其范圍之內(nèi)的溫度。微生物細胞優(yōu)選被線性地冷卻和/或加熱 (適當?shù)?，第一?或第三階段），那即是說，當被繪制在時間對溫度的曲線圖上時，冷卻或 加熱曲線（近似地）為直線。上述細胞可以自然冷卻，或者其可以被主動冷卻，例如使用熱 交換器（heat exchanger)和/或冷卻物質，例如為了（降低）到環(huán)境溫度或室溫，或者更 低。
[0031] 冷卻速率優(yōu)選為至少0. 4°C /分鐘、0. 6°C /分鐘、1. 0°C /分鐘或1. 5°C /分鐘。 這些數(shù)值代表了細胞被自然冷卻時可獲得的冷卻速率。但是，更迅速的冷卻速率也是有可 能的，尤其是采用了主動冷卻時。因此，至少為2. 0°C /分鐘、2. 5°C /分鐘、3. 0°C /分鐘或 者甚至3. 5°C /分鐘的冷卻速率也是可以得到的。但是，更高的冷卻速率，例如高于每分鐘 5°C也是可能的，例如，每分鐘7°C或10°C至50°C或60°C，優(yōu)選為每分鐘15°C至45°C。
[0032] 優(yōu)選的加熱和/或冷卻速率優(yōu)選保持在至少10°C、20°C或30°C以上，雖然在一些 實施方式中，可以獲得超過至少40°C或50°C的范圍的速率。
[0033] 可以認識到，具有迅速加熱階段和迅速冷卻階段的巴氏消毒，其中用到的能量可 以被降低。這不僅僅導致了成本的節(jié)約，而且還不會對（最終的）微生物油的質量產(chǎn)生負 面影響，事實上，它看起來還對油有著有益的效果。
[0034] 第三方面--時間對淵度曲線圖下的面積（能量輸入）
[0035] 從第二方面可以明顯獲知，如果將本發(fā)明的巴氏消毒方案繪制在一幅時間對溫度 的曲線圖上，將會得到一個梯形。第一（加熱）和第三（冷卻）階段的形狀可能均為三角 形，而中間或第二（平臺）階段（第四方面的主題）（通常）是矩形。時間對溫度曲線圖下 的面積代表輸入到系統(tǒng)中的能量值。通過將巴氏消毒方案分為三部分，就可以計算出曲線 圖的面積，從而計算出能量輸入。
[0036] 在第三方面，時間（分鐘）對溫度（°C)的曲線圖下的面積小于13, 000°C·分鐘。 但是，遠小于此的數(shù)量也已經(jīng)被獲得，小于ll，〇〇〇°C ·分鐘、10,000°C ·分鐘、9,000°C ·分 鐘、8, 000°C ·分鐘或者甚至1，000°C ·分鐘的數(shù)值也是可能的。在本發(fā)明的優(yōu)選方面，這些 數(shù)值可以不超過7, 000°C ·分鐘、6, 000°C ·分鐘或800°C ·分鐘。在所述的曲線圖中，時間 被繪制在X軸（或水平軸或橫坐標）上，0分鐘代表原點。溫度由此將被繪制在y軸（或垂 直軸或縱坐標）上，〇 -c代表原點。
[0037] 微生物細胞一旦被加熱至它們巴氏消毒的溫度，然后即可冷卻（或被冷卻）。這些 細胞通常被冷卻至室溫或環(huán)境溫度，或至少低于30°C的溫度。因此不但有細胞從30°C被加 熱至60°C的時間，也還有細胞從60°C冷卻至30°C的時間。這兩個時間可以被加合起來提供 組合的30°C -60°C -30°C的加熱和冷卻時間。該組合時間優(yōu)選為少于150分鐘，例如是少 于120分鐘或100分鐘。但是，對更小的樣品，還能獲得更快得多的時間，上述組合（30°C到 60°C再回到30°C )時間可以少于70、50或者甚至30分鐘。
[0038] 第四方面--有平臺階段的巴氐消毒方案
[0039] 本方案可以是一種依據(jù)第二方面的方案，其中有（例如，第一）加熱階段和（例 如，第三）冷卻階段、夾在中間的（例如，第二或中間或居中的）平臺階段。但是，這并不是 必需的，其它的巴氏消毒方案也能被設想出來。第四方面涉及上述平臺階段的優(yōu)選特征。第 二（和其它）方面中的所有特征和特性在經(jīng)過必要的修正后也適用于此第四方面。
[0040] 上述細胞被維持或保持于特定的期望溫度（正負1°C、2°C、5°C或者甚至10°C )，在 一種溫度（T/C )下持續(xù)一段時間（t，分鐘）。這兩個參數(shù)可以被乘起來，從而給出乘積tT。 它適于從140°c ·分鐘或280°C ·分鐘至50, 000°C ·分鐘或100, 800°C ·分鐘。該乘積優(yōu)選 從500°C ·分鐘、1，000°C ·分鐘、2, 000°C ·分鐘或3, 000°C ·分鐘或甚至6, 000°C ·分鐘至 10, 000°C ·分鐘、18, 000°C ·分鐘或25, 000°C ·分鐘。該乘積tT最適為2, 000°C ·分鐘至 6, 000°C ·分鐘，例如3, 000°C ·分鐘至5, 000°C ·分鐘，最適從4, 000°C ·分鐘至4, 500°C ·分 鐘。在一些實施方式中，該乘積tT為從13°C ·分鐘至900°C ·分鐘，例如從100°C ·分鐘 或200°C ·分鐘至700°C ·分鐘或800°C ·分鐘，優(yōu)選從300°C ·分鐘或400°C ·分鐘至 600°C ·分鐘或700°C ·分鐘。
[0041] 因此，通過與第三方面中相似的方式，可以認識到，該乘積tT代表了當細胞被保 持于升高的溫度時的時間對溫度曲線圖下的面積。因此，該倍增因數(shù)tT實際上正是平臺 (但非加熱或冷卻）階段曲線圖下的面積。
[0042] PUFA 的提取
[0043] 本發(fā)明的第五方面涉及一種從微生物細胞中獲取PUFA的方法，該方法包含：如前 所述，根據(jù)本發(fā)明的第一、第二、第三或第四方面中之任一，對細胞進行巴氏消毒，再從經(jīng)過 巴氏消毒的細胞中提取和/或分離出PUFA。
[0044] 本發(fā)明的第六方面涉及微生物油，其可以包含至少40%的花生四烯酸（ARA)和/ 或具有含量為至少90%的甘油三酯。所述的油可以具有低于2. 5、1. 5、0. 8、0. 6或者甚至 0. 5的P0V和/或低于1. 0的AnV。所述的油可以通過第五方面的方法來制備。
[0045] 多不飽和脂肪酸（PUFA)和微牛物油
[0046] 所述的PUFA可以是一種PUFA，也可以是兩種或更多種不同的PUFA。該PUFA或每 種PUFA可以是n-3或n-6族的。優(yōu)選為C18、C20或C22的PUFA。它可以是具有至少18個 碳原子和/或至少3或4個雙鍵的PUFA。該PUFA可以以一種游離脂肪酸、一種鹽的形式， 作為一種脂肪酸酯（例如甲酯或乙酯），作為一種磷脂和/或以甘油單、雙或三酯的形式被 提供。
[0047] 適合的（n-3 和 n-6) PUFA 包括：
[0048] 二十二碳六稀酸（docosahexaenoic acid，DHA，22:6 Ω 3)，適合來自藻類或真菌， 例如（甲藻）Crypthecodinium 或（真菌）Thraustochytrium ;
[0049] γ -亞麻酸（γ-linolenic acid, GLA，18:3 Ω 6);
[0050] α -亞麻酸（a-linolenic acid，ALA，18:3 Ω 3);
[0051] 共軛亞油酸（conjugated linoleic acid,十八碳二烯酸 (octadecadienoicacid), CLA)；
[0052] 雙高-γ -亞麻酸（dihomo-γ-linolenic acid，DGLA，20:3 Ω 6);
[0053] 花生四烯酸（ARA，20:4Q6);和
[0054] 二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA，20:5 Ω 3)。
[0055] 優(yōu)選的PUFA包括花生四烯酸（ARA)、二十二碳六烯酸（DHA)、二十碳五烯酸（ΕΡΑ) 和/或Υ -亞麻酸（GLA)。具體而言,優(yōu)選為ARA。
[0056] 所述的PUFA可以通過經(jīng)本發(fā)明的方法進行了巴氏消毒的細胞來生產(chǎn)，例如微生 物細胞。其可以是細菌、藻類、真菌或酵母細胞。真菌是優(yōu)選的，優(yōu)選為Mucorales目的， 例如 Mortierella、Phycomyces、Blakeslea、Aspergillus、Thraustochytrium、Pythium 或 Entomophthora。ARA 的優(yōu)選來源為 Mortierella alpina、Blakeslea trispora、 Aspergillusterreus或Pythium insidiosum。藻類可以是甲藻（dinoflagellate)和/或包 括 Porphyridium、Nitschia 或 Crypthecodinium (例如 Crypthecodinium cohni i) 〇 酵母包 括 Pichia 或 Saccharomyces 屬的，例如 Pichia ciferrii 〇 細菌可以是 Propionibacterium 屬的。該微生物油（在室溫下）可以為液體。
[0057] 大多數(shù)的PUFA優(yōu)選為以甘油三酯的形式存在。因此，優(yōu)選為至少50%，例如至少 60%，或最優(yōu)為至少70%的PUFA都以甘油三酯的形式存在。但是，甘油三酯的數(shù)量還可以 更高，例如為油的至少85%，優(yōu)選為至少90%，最優(yōu)為至少95%或98%。這些甘油三酯中， 優(yōu)選至少40%，例如至少50%，而最優(yōu)為至少60%的PUFA，都處于甘油的α位（出現(xiàn)于甘 油三酯的主鏈（backbone)中）也就是所謂的1或3號位。處于β (2)位的上述PUFA優(yōu)選 為至少20%，例如至少30%，最優(yōu)為至少40%。
[0058] 上述微生物油可以包含至少10%、35%、40%或45%或更多期望的PUFA，例如花 生四烯酸。它可以有至少90%的甘油三酯含量。該微生物油具有的甘油三酯含量優(yōu)選為 從90 %至100%，例如至少96%，優(yōu)選為至少98%，更優(yōu)選為至少99%，而最優(yōu)的為超過 99.5%。典型地，這種油中二十碳五烯酸（EPA)的含量低于5 %，優(yōu)選為低于1 %，而更優(yōu) 選的是低于〇. 5%。該油中C2(l、C2(l:3、C22:(l和/或C24:(l多不飽和脂肪酸（PUFA)中任何一種 的含量可以少于5%，少于2%，少于1%。游離脂肪酸（free fattyacid，F(xiàn)FA)的含量可以 彡0. 4%，0. 2%或0. 1%。上述的油可以含有很少或沒有GLA和/或DGLA。
[0059] 該微生物油可以是粗制的油。它可以通過使用溶劑從細胞中萃取出來，例如超臨 界態(tài)二氧化碳、己烷或異丙醇。
[0060] 巴氐消毒討稈
[0061] 巴氏消毒通常發(fā)生于發(fā)酵完成之后。在一種優(yōu)選實施方式中，巴氏消毒將終止發(fā) 酵，因為巴氏消毒期間的熱度會殺死細胞。巴氏消毒因此可以對發(fā)酵培養(yǎng)液（或液體（水 性）培養(yǎng)基中的細胞）進行，雖然其也能夠對從培養(yǎng)液中獲得的微生物生物物質（biomass) 進行。在前一種情況中，巴氏消毒可以發(fā)生于微生物細胞仍處于發(fā)酵罐中時。巴氏消毒優(yōu) 選于微生物細胞受到更多的處理之前進行，例如微?；ū热缤ㄟ^擠壓）粉碎，或者捏煉 (kneading)〇
[0062] 優(yōu)選地，巴氏消毒方案足以抑制或失活一種或多種能使PUFA或微生物油降解或 者對其產(chǎn)生不良影響的酶，例如脂肪酶。
[0063] 一旦發(fā)酵被終止，就可以過濾發(fā)酵培養(yǎng)液，或者進行其它處理以去除其中的水或 水性液體。水分被移除之后，可以獲得一種生物物質"壓濾渣（cake)"。如果巴氏消毒還未 開展，就可以對這些去水的細胞（或生物物質壓濾渣）進行巴氏消毒。
[0064] PUFA的提取方法
[0065] 然后PUFA(或通常包含該PUFA的微生物油）就可以從所述（經(jīng)過巴氏消毒）的微 生物細胞中提取得到。其優(yōu)選從含有細胞的（比如，干燥的）微粒（例如，擠壓出的產(chǎn)物） 中提取。這種提取可以使用溶劑來進行。優(yōu)選使用無極性溶劑，例如Ci_ 8，優(yōu)選為c2_6的鏈 烷，舉例來說是己烷。也可以使用二氧化碳（液態(tài)形式的，比如處于超臨界狀態(tài)的）。
[0066] 優(yōu)選地，溶劑被允許從干燥微粒中濾出。在W0-A-97/37032中描述了合適的微生 物微?；蛿D壓技術以及其后的對含有PUFA的微生物油的提取。
[0067] 上述溶劑可以令我們獲得含有PUFA的粗制油。這種油在此狀態(tài)即可被使用，無 需更多處理，或者它也可以再經(jīng)過一步或數(shù)步精煉。然而，粗制的油通常含有溶劑，例如用 來萃取該油的溶劑（例如己烷，或醇，例如異丙醇），或其還未經(jīng)歷下述精煉步驟中的一種 (或優(yōu)選為全部）。PCT/EP01/08902號國際專利申請（該文件的內(nèi)容和本文中所述及的其 它所有文件的內(nèi)容通過引用的方式包括于本文中）中描述了合適的精煉方案。例如，可以 對這種油進行一步或數(shù)步的精煉，包括：酸處理或脫膠（degumming)、堿處理或去除游離脂 肪酸、脫色或去除色素、過濾、冬化（winterisation)(或冷卻,例如為了去除飽和的甘油三 酯）、脫臭（或對游離脂肪酸的去除）和/或上光（polishing)(或對油不溶性物質的去 除）。上述所有精煉步驟在PCT/EP01/08902中都有更為詳細的描述，在經(jīng)過必要的修正后 都可以被應用于本申請所描述的步驟中。
[0068] 由此得到的油特別適合于營養(yǎng)上的用途，其可以被添加到（人類）食物或（動物） 飼料中。例子包括奶、嬰兒配方食品、健康飲品、面包和動物飼料。
[0069] 微牛物細朐
[0070] 本發(fā)明中使用的微生物細胞（或微生物）可以是上文所述的任何一種，尤其是在 關于PUFA和微生物油的一節(jié)中的那些。它們可以包含或能被用于生產(chǎn)PUFA或微生物油， 所述的PUFA油可以適當?shù)靥崛』蚍蛛x自上述的細胞中。這些細胞可以是絲狀的形式，例如 真菌或細菌，或者可以是酵母、藻類和細菌等單個的細胞。這些細胞可以包含酵母、真菌、 細菌或藻類等微生物。優(yōu)選的真菌是Mucorales目的，例如該真菌可以是Mortierella、 Phycomyces、Blakeslea 或 Aspergillus 屬的。優(yōu)選的真菌是 Mortierella alpina、 Blakeslea trispora 或 Aspergillus terreus 種的。
[0071] 至于考慮到酵母，優(yōu)選是Pichia(例如是Pichia ciferrii種的）或 Saccharomyces 屬的。
[0072] 細菌可以是 Propionibacterium 屬的。
[0073] 如果該細胞來自藻類，優(yōu)選為甲藻（denoflagellate)和/或屬于 Crypthecodinium 屬的，優(yōu)選的藻為 Crypthecodinium cohnii 屬的。
[0074] 加熱
[0075] 直接或間接地加熱（上述細胞）都是可行的。所述的加熱，如果是直接的，則可 以是通過向發(fā)酵罐中傳送蒸汽。間接的方式可以是通過熱交換器使用一種介質，其既可以 通過發(fā)酵罐的壁，也可以有加熱線圈，或外部的熱交換器，例如板式熱交換器（plate heat exchanger)〇
[0076] 通常，巴氏消毒將發(fā)生于進行發(fā)酵的發(fā)酵容器中。但是，對一些微生物（例如細 菌）而言，通常優(yōu)選的是首先將細胞移出容器，然后再進行巴氏消毒。巴氏消毒可以發(fā)生于 對生物進行其它處理之前，例如干燥或微粒化。
[0077] 巴氏消毒通常將殺死大多數(shù)的微生物，如果不是全部的話。巴氏消毒后，至少 95 %、96 %或者甚至98 %的微生物都已被殺死，即它們已經(jīng)死亡。
[0078] 酸化
[0079] 在一些情況下，人們期望降低細菌在經(jīng)過巴氏消毒之后生長的風險。一種可能是 用合適的酸來酸化細胞。因此，為了防止微生物物種的生長（outgrowth),將細胞的pH調節(jié) 到從3至4的范圍是合乎期望的。但是根據(jù)所述的細胞，也還可以采用更寬的pH范圍，所 以pH可以調節(jié)為2至5,最優(yōu)是在大約3. 3至3. 7的范圍內(nèi)。
[0080] 對細胞的酸化可以發(fā)生于巴氏消毒之前。然而，其優(yōu)選卻進行于巴氏消毒之后。
[0081] 對pH的調節(jié)可以通過任何適當?shù)耐緩交蛉魏芜m當?shù)乃醽磉M行。優(yōu)選是使用磷酸 來獲得的，例如85%的或稀釋的55%或33%的磷酸。
[0082] 討氣化倌（P0V)
[0083] 上述微生物油的P0V優(yōu)選為從4至8或12,尤其是對粗制的油而言。然而，該P0V 可以不超過3. 0,2. 5或2.0。但是，使用本發(fā)明的方法還可以獲得更低得多的P0V，這些值可 以低于1. 5或低于1. 0。低于0. 8或0. 6以及甚至低于0. 4的P0V也是能夠獲得的。（來 自于實施方式的）數(shù)值變動于1.3(或0.8)至0.4之間。（P0V的）單位通常是meq/kg。
[0084] 苘呑胺倌（AnV)
[0085] 該值表示對醛類含量的測量。上述微生物油的茴香胺值優(yōu)選為從5、6、7或10至 15、20或25,尤其是對粗制的油而言。AnV適于不超過20,例如不超過15。它可以不超過 10或者甚至不超過5。優(yōu)選地，P0V和/或AnV是就粗制的而非經(jīng)過精煉的油而言的。AnV 值（在優(yōu)選的實驗中）在15至5之間變化，可以是在12至7之間。
[0086] 耜制油與精煉油的對比
[0087] 下面展示了上述兩種油之間的一些區(qū)別。每種粗制的或精煉的油都可能具有下表 中恰當對應于粗制或精煉油的一種或多種特征。粗制的油通常含有抗氧化劑（例如生育 酚、抗壞血酸棕櫚酸）。
[0088]

【權利要求】
1. 一種對微生物細胞進行巴氏消毒的方法，所述方法包括：在不超過30分鐘內(nèi)在包括 從40°C至70°C的溫度加熱細胞，或以大于0. 5°C /分鐘的速率加熱細胞。
2. -種對微生物細胞進行巴氏消毒的方法，所述方法包含三個階段，即（第一）加熱階 段，（第二）平臺階段（其間細胞被維持于一個恒定的溫度）以及（第三）冷卻階段。
3. -種對微生物細胞進行巴氏消毒的方法，所述方法包含：使用一種巴氏消毒方案加 熱細胞，從而使時間（分鐘）對溫度（°C )曲線圖下的面積小于13,000°C ·分鐘。
4. 一種對微生物細胞進行巴氏消毒的方法，所述方法包含：加熱細胞，然后在平臺階 段將細胞在提高的溫度（T，°C )下維持一段時間（t，分鐘），其中的乘積tT為從140°C·分 鐘至100,800°C ·分鐘。
5. -種如權利要求2或4所述的方法，其中： (a) 所述平臺為最高溫度； (b) 所述巴氏消毒方案在時間（t)對溫度（T)曲線圖上的形狀為梯形； (c) 所述加熱和/或冷卻是線性的；和/或 ⑷所述細胞被加熱自低于40°C的溫度，和/或被加熱至高于70°C的溫度；和/或 (e)所述細胞含有或產(chǎn)生PUFA或（可以含有PUFA的）微生物油。
6. -種如前述任意一項權利要求所述的方法，其中微生物細胞在不超過15分鐘內(nèi)被 從40°C加熱至70°C，和/或以至少0. 6°C /分鐘或1. 0°C /分鐘的速率加熱細胞。
7. -種如前述任意一項權利要求所述的方法，其中： (a) 以至少2°C /分鐘的速率加熱所述的微生物細胞； (b) 所述巴氏消毒（或平臺）溫度從70°C至100°C，最適為從70°C至85°C ; (c) 所述細胞以至少-0. 6°C /分鐘或-1. 6°C /分鐘的速率被冷卻；和/或 (d) 所述時間（分鐘）對溫度（°C)曲線圖下的面積小于10,000°C·分鐘或8,000°C·分 鐘。
8. -種從微生物細胞中獲得PUFA或微生物油的方法，所述方法包含：按照前述任意一 項權利要求所述，對細胞進行巴氏消毒，再從經(jīng)過了巴氏消毒的細胞中提取或分離出PUFA 或微生物油。
9. 一種微生物油，含有至少90%的甘油三酯，其過氧化值（POV)低于1.5(或1.0)，和 /或其茴香胺值（AnV)低于15,可選地，低于12。
10. -種如權利要求9所述的油，其中： (a) 所述的PUFA包含C18、C20、C22 Ω -3或Ω -6的脂肪酸； (b) 所述的PUFA含量為至少40% ; (c) 所述的PUFA包含花生四烯酸（ARA)、二十碳五烯酸（EPA)和/或二十二碳六烯酸 (DHA);和 / 或 (d) 所述的油是粗制的或未經(jīng)過精煉的油。
【文檔編號】C11B1/00GK104138606SQ201410270196
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2003年6月20日 優(yōu)先權日:2002年6月19日
【發(fā)明者】艾伯特.沙普, 迪尼埃爾.韋爾科埃爾騰 申請人:帝斯曼知識產(chǎn)權資產(chǎn)管理有限公司