專利名稱：發(fā)酵含木素纖維素材料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基于含木素纖維素材料的發(fā)酵方法。
背景技術(shù)：
由于化石燃料有限的儲(chǔ)量和對(duì)溫室氣體排放的擔(dān)憂，人們?cè)絹?lái)越多地關(guān)注使用可 再生能源。包含含木素纖維素材料的植物材料可由發(fā)酵生物(包括細(xì)菌、酵母和真菌)轉(zhuǎn)化 為可發(fā)酵的糖，并用作能源用于工業(yè)目的。例如，含木素纖維素材料可由酶轉(zhuǎn)化為糖，且所 得的糖可用作原料供工業(yè)微生物產(chǎn)生產(chǎn)物，如塑料和乙醇。由含木素纖維素材料的發(fā)酵生成發(fā)酵產(chǎn)物(如乙醇)在本領(lǐng)域中是已知的，并且 通常包括含木素纖維素材料的預(yù)處理、水解和發(fā)酵。含木素纖維素材料的預(yù)處理導(dǎo)致例如，乙酸、酚類和呋喃由含木素纖維素材料釋 放，所述材料在水解和發(fā)酵期間可以不可逆地結(jié)合加入的酶。這些化合物也可對(duì)于發(fā)酵生 物體的代謝是有毒的，并且抑制發(fā)酵生物體的性能。為了克服對(duì)酵母的這種抑制，實(shí)踐中將 水解物稀釋，并在低干固體濃度的條件下發(fā)酵，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)所述抑制化合物濃度的相應(yīng) 的稀釋。通過(guò)增加pH可減少特別是乙酸和其它弱酸對(duì)酵母的毒性也是眾所周知的。然而， 為了控制腐敗(spoilage)細(xì)菌的污染，對(duì)經(jīng)水解的含木素纖維素材料的發(fā)酵通常在酸性 PH(低于5. 5)進(jìn)行。因此，經(jīng)水解的含木素纖維素材料的發(fā)酵通常在低pH和低干固體濃度 進(jìn)行。需要從含木素纖維素材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的改進(jìn)的方法。發(fā)明概述本發(fā)明人現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，可在較高pH發(fā)酵經(jīng)水解的含木素纖維素材料的醪液(mash)， 并同時(shí)控制腐敗細(xì)菌的污染。這是通過(guò)在發(fā)酵過(guò)程中使用非常高的干固體濃度來(lái)實(shí)現(xiàn)的。 不拘于理論，相信雖然弱酸(如乙酸)對(duì)發(fā)酵生物的毒性在高PH時(shí)減少?gòu)亩试S發(fā)酵生物 的增殖，但是腐敗細(xì)菌的生長(zhǎng)受高濃度的其它抑制化合物控制。因此，本發(fā)明在第一個(gè)方面涉及從含木素纖維素材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，包括 下述步驟(a) (i)預(yù)處理含木素纖維素材料的材料，(a) ( )水解經(jīng)預(yù)處理的含木素纖維 素材料，(b)使用發(fā)酵生物發(fā)酵在步驟(a)中獲得的水解物，和(c)任選地，回收所述發(fā)酵 產(chǎn)物，其中，在步驟(b)中的發(fā)酵過(guò)程中，pH為5. 5-9.0，而高的干固體濃度為至少20%。在第二個(gè)方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，所述方法包括(a)提供經(jīng)預(yù)處 理的含木素纖維素材料的水解物，(b)將所述水解物與發(fā)酵生物相接觸以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物，和 (c)任選地，回收所述發(fā)酵產(chǎn)物，其中，在步驟(b)中的發(fā)酵過(guò)程中，pH為5. 5-9.0，而高的 干固體濃度為至少20%。在上述方面中，所述發(fā)酵生物優(yōu)選酵母，而發(fā)酵產(chǎn)物優(yōu)選乙醇。上述方面步驟的具體細(xì)節(jié)如下所述(例如，在“預(yù)處理”、“水解”和“發(fā)酵”部分 中)。
具體實(shí)施例方式★儲(chǔ)震胃遍本文使用的術(shù)語(yǔ)“含木素纖維素材料”指主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成的 材料。該術(shù)語(yǔ)與“木素纖維素材料”同義。這種材料經(jīng)常稱為“生物質(zhì)”。本發(fā)明包括任何含木素纖維素材料。含木素纖維素材料可以是包含木質(zhì)纖維 素的任何材料。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，含木素纖維素材料包含至少30wt. %，優(yōu)選至少 50wt. %，更優(yōu)選至少70wt. %，甚至更優(yōu)選至少90wt. %的木質(zhì)纖維素。應(yīng)理解的是，含木 素纖維素材料還可以包含其它組分，如蛋白質(zhì)材料、淀粉、糖，如可發(fā)酵的糖和/或不可發(fā) 酵的糖。通常在例如植物的莖、葉、殼、皮和穗軸或樹(shù)的葉、枝和木材中發(fā)現(xiàn)含木素纖維素 材料。含木素纖維素材料還可以是，但不限于，草本材料、農(nóng)業(yè)殘余物、林業(yè)殘余物、城市固 體廢物、廢紙，和紙漿和造紙廠殘余物。在本文應(yīng)理解的是，含木素纖維素材料可以是植物 細(xì)胞壁材料的形式，其在混合的基體中包含木質(zhì)素、纖維素和半纖維素。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，含木素纖維素材料包括玉米秸稈、玉米纖維、稻草、松木、 木屑/刨花(wood chip)、楊木、甘蔗渣、紙和紙漿(pulp)處理廢物中的一種或多種。其它含木素纖維素材料的實(shí)例包括硬木，如楊木和樺木，軟木，谷類草桿(cereal straw)，如麥稈(wheat straw)，柳枝稷(switchgrass)，城市固體廢物，工業(yè)有機(jī)廢物，辦公 用紙，或它們的混合物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，木素纖維素材料是玉米秸稈或玉米纖維，優(yōu)選通過(guò)蒸汽 爆炸(steam explosion)預(yù)處理，優(yōu)選經(jīng)酶法水解，并在約6的pH和約30%的干固體濃度 用酵母發(fā)酵產(chǎn)生乙醇。所述乙醇優(yōu)選回收用作燃料乙醇。預(yù)處理木素纖維素的結(jié)構(gòu)對(duì)酶法水解而言不是直接可及的。因此，必須預(yù)處理含木素纖 維素材料(例如，通過(guò)在充分的壓力和溫度條件下酸水解)以打破木質(zhì)素的密封并破壞纖 維素的晶體結(jié)構(gòu)。這導(dǎo)致半纖維素和纖維素級(jí)分的溶解(solubilization)。然后可將纖維 素和半纖維素用酶水解，例如，通過(guò)纖維素酶酶(纖維素分解酶)，以將糖聚合物轉(zhuǎn)化為可 發(fā)酵的糖，其使用發(fā)酵生物(例如，酵母)，可發(fā)酵為期望的發(fā)酵產(chǎn)物(如乙醇)。任選地， 所述發(fā)酵產(chǎn)物可(例如，通過(guò)蒸餾)回收。當(dāng)預(yù)處理含木素纖維素材料時(shí)，產(chǎn)生了可能抑制酶和/或可能對(duì)發(fā)酵生物有毒性 的降解產(chǎn)物。這些降解產(chǎn)物嚴(yán)重地減少了水解和發(fā)酵兩者的速率。預(yù)處理含木素纖維素材料的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的。本發(fā)明涵蓋的方法的實(shí) 例描述于下面“預(yù)處理”部分。經(jīng)預(yù)處理的木素纖維素降解產(chǎn)物包括木質(zhì)素降解產(chǎn)物、纖維素降解產(chǎn)物和半纖維 素降解產(chǎn)物。經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)素降解產(chǎn)物本質(zhì)上可為酚。半纖維素降解產(chǎn)物包括來(lái)自糖(如己糖和/或戊糖)的呋喃，所述糖包括木 糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖和阿拉伯糖。半纖維素的實(shí)例包括木聚糖、半乳葡甘露聚糖 (galactoglucomannan)、阿拉伯半乳聚糖(arabinogalactan)、阿拉伯葡糖醛酸木聚糖 (arabinoglucuronoxylan)、葡糖醛酸木聚糖(glucuronoxylan)，及其衍生物和組合。
抑制化合物(即，經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素降解產(chǎn)物)的實(shí)例，包括4-0H苯甲醇， 4-0H苯甲醛，4-0H苯甲酸，三甲基苯甲醛，2-糠酸，香豆酸，阿魏酸，酚，愈創(chuàng)木酚，藜蘆醚， 連苯三酚(pyrogallollol)，連苯三酚單甲酯，香草醇，香草醛，異香草醛，香草酸，異香草 酸，高香草酸(homovanillic acid)，藜蘆醇，藜蘆醛，藜蘆酸，2_0_甲基五倍子酸，丁香醇， 丁香醛，丁香酸，三甲基五倍子酸，高兒茶酚，乙基香草醛，木焦油醇，對(duì)甲基苯甲醚，茴香 醛，茴香酸，糠醛，羥甲基糠醛，5-羥甲基糠醛，甲酸，乙酸，乙酰丙酸，桂皮酸，松柏醛，異丁 子香酚，對(duì)苯二酚，丁子香酚或它們的組合。其它抑制化合物可見(jiàn)于，例如Luo等，2002， Biomass and Bioenergy 22 125-138?？梢砸匀魏魏线m的方式預(yù)處理含木素纖維素材料。預(yù)處理可以在水解和/發(fā)酵前 和/或期間進(jìn)行。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在發(fā)酵前和/或期間，將經(jīng)預(yù)處理的材料水解，優(yōu) 選酶水解。預(yù)處理的目的是分離和/或釋放纖維素，半纖維素和/或木質(zhì)素，并且這種方式 可以改善水解速率(rate of hydrolysis)。預(yù)處理方法如濕氧化和堿預(yù)處理靶向(target) 木質(zhì)素，而稀酸和自水解靶向半纖維素。蒸汽爆炸(steam explosion)是靶向纖維素的預(yù) 處理的實(shí)例。根據(jù)本發(fā)明，步驟(a)中的預(yù)處理可以是使用本領(lǐng)域公知技術(shù)的常規(guī)預(yù)處理步 驟。合適的預(yù)處理的實(shí)例在下文描述。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，預(yù)處理在含水漿料中發(fā)生。預(yù)處理期間，含木素纖維素材料可以以10_80wt. %，優(yōu)選20_70wt. %，特別是 30-60wt. %，如約50wt. %的干固體濃度存在?；瘜W(xué)、機(jī)械和/或牛物預(yù)處理根據(jù)本發(fā)明，含木素纖維素材料在水解和/或發(fā)酵前可以進(jìn)行化學(xué)、機(jī)械和/或生 物預(yù)處理。機(jī)械預(yù)處理(經(jīng)常稱作物理處理)可以單獨(dú)使用或者與隨后或同時(shí)進(jìn)行的水解 (特別是酶水解)組合使用。優(yōu)選地，在水解和/或發(fā)酵前進(jìn)行化學(xué)、機(jī)械和/或生物預(yù)處理?；蛘撸瘜W(xué)、機(jī)械 和/或生物預(yù)處理可以與水解同時(shí)進(jìn)行，如與加入一種或多種纖維素酶(纖維素分解酶) 或下述其它酶活性同時(shí)進(jìn)行，以釋放例如可發(fā)酵糖，如葡萄糖和/或麥芽糖。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，可洗滌經(jīng)預(yù)處理的含木素纖維素材料。然而，洗滌不是必 須的，且在優(yōu)選的實(shí)施方案中可以去除?；瘜W(xué)預(yù)處理術(shù)語(yǔ)“化學(xué)預(yù)處理”指促進(jìn)纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素的分離和/或釋放的任 何化學(xué)預(yù)處理。合適的化學(xué)預(yù)處理的實(shí)例包括用例如稀酸、石灰、堿、有機(jī)溶劑、氨、二氧化 硫、二氧化碳處理。此外，濕氧化和控制PH的水熱解(hydrothermolysis)也被認(rèn)為是化學(xué) 預(yù)處理。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，化學(xué)預(yù)處理是酸處理，更優(yōu)選地，連續(xù)的稀酸和/或弱酸 (mild acid)處理，如，用硫酸，或者另一種有機(jī)酸，如乙酸、檸檬酸、酒石酸、琥珀酸、鹽酸或 它們的混合物處理。也可以使用其它酸。弱酸處理指處理PH在1-5，優(yōu)選1-3的范圍內(nèi)。 在具體的實(shí)施方案中，酸濃度為0. 1至2. Owt. %的酸，優(yōu)選硫酸。酸可以接觸含木素纖維素 材料，并且混合物可以在160-220°C，如165-195°C的溫度保持?jǐn)?shù)分鐘至數(shù)秒鐘的時(shí)間，例 如1-60分鐘，如2-30分鐘或3-12分鐘?？梢约尤霃?qiáng)酸，如硫酸，用于去除半纖維素。這增 強(qiáng)了纖維素的可消化性。
也涵蓋其它技術(shù)。已經(jīng)顯示，纖維素溶劑處理可將約90%的纖維素轉(zhuǎn)化成葡萄 糖。也已經(jīng)顯示，當(dāng)木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)破壞時(shí)能極大地增強(qiáng)酶水解。堿性H2O2、臭氧、有機(jī)溶 劑(organosolv)(使用含水醇中的 Lewis 酸、FeCl3、(Al)2SO4)、甘油、二p惡烷(dioxane)、苯 酚或乙二醇屬于已知可破壞纖維素結(jié)構(gòu)并促進(jìn)水解的溶劑(Mosier等，2005，Bioresource Technology 96 :673-686)。本發(fā)明也涵蓋用堿，例如NaOH、Na2CO3和/或氨等進(jìn)行的堿性化學(xué)預(yù)處理。使 用氨的預(yù)處理方法在例如 WO 2006/110891、WO 2006/110899、W02006/110900 和 WO 2006/110901(通過(guò)提述并入本文)中描述。濕氧化技術(shù)包括使用氧化劑，如基于亞硫酸(sulphite)的氧化劑等。溶劑預(yù)處 理的實(shí)例包括用DMSO (二甲基亞砜)等處理。化學(xué)預(yù)處理通常進(jìn)行1至60分鐘，如從5至 30分鐘，但是依賴于待預(yù)處理的材料，化學(xué)預(yù)處理可以進(jìn)行更短或更長(zhǎng)的時(shí)間。合適的預(yù)處理方法的其它實(shí)例由Schell等，2003，Appl. Biochem and Biotechn. Vol. 105-108 :69-85，和 Mosier 等，2005，Bioresource Technology 96 :673_686，和美國(guó)公 開(kāi)2002/0164730描述，所述文獻(xiàn)通過(guò)提述全部并入本文。機(jī)械預(yù)處理術(shù)語(yǔ)“機(jī)械預(yù)處理”指可以促進(jìn)纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素從含木素纖維素 材料分離和/或釋放的任何機(jī)械(或物理)處理。例如，機(jī)械預(yù)處理包括各種類型的磨制 (milling)、輻射(irradiation)、汽蒸/蒸汽爆炸，和水熱解。機(jī)械預(yù)處理包括粉碎(機(jī)械減小尺度)。粉碎包括干磨、濕磨和振動(dòng)球磨。機(jī)械 預(yù)處理可涉及高壓和/或高溫(蒸汽爆炸)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，高壓指300至 600psi，優(yōu)選400至500psi，如約450psi范圍內(nèi)的壓力。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，高溫 指在約100至300°C，優(yōu)選約140至235°C范圍內(nèi)的溫度。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，機(jī)械預(yù) 處理是分批工藝的蒸汽槍(steam gun)水解器系統(tǒng)，其使用如上所定義的高壓和高溫。為 此可使用 Sunds Hydrolyzer (可由 Sunds Defibrator AB(Sweden)得至Ij )。組合的化學(xué)和機(jī)械預(yù)處理在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，化學(xué)和機(jī)械預(yù)處理均進(jìn)行。例如，預(yù)處理步驟可以涉及稀 酸或弱酸處理和高溫和/或高壓處理?；瘜W(xué)和機(jī)械預(yù)處理可以根據(jù)需要順序或同時(shí)進(jìn)行。因此，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，對(duì)含木素纖維素材料進(jìn)行化學(xué)和機(jī)械預(yù)處理，以促 進(jìn)纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素的分離和/或釋放。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，預(yù)處理作為稀酸和/或弱酸蒸汽爆炸步驟進(jìn)行。在另一 個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，預(yù)處理作為氨纖維爆炸步驟(或AFEX預(yù)處理步驟)進(jìn)行。生物預(yù)處理如同本發(fā)明所使用的，術(shù)語(yǔ)“生物預(yù)處理”指可促進(jìn)纖維素、半纖維素和/或木質(zhì) 素從含木質(zhì)纖維素材料分離和/或釋放的任何生物預(yù)處理。生物預(yù)處理技術(shù)可涉及應(yīng)用 溶解木質(zhì)素的微生物(參見(jiàn)，例如，Hsu, 1996, Pretreatment of biomass,于 Handbook on Bioethanol !Production and Utilization, Wyman 編，Taylor & Francis, Washington, DC,179-212 ；Ghosh 禾口 Singh,1993, Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbial conversion of lignocellulosic biomass, Adv.Appl. Microbiol. 39 :295-333 ；McMillan,1994, Pretreating lignocellulosic biomass :areview,于 Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production, Himmel, Baker 禾口 Overend 編，ACS Symposium Series 566, American Chemical Society, Washington, DC, 第 15 章；Gong, Cao, Du 禾口 Tsao, 1999, Ethanol production from renewable resources, 于Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper編，Springer-Verlag Berlin Heidelberg,Germany,65 :207-241 ；Olsson 禾口 Hahn-Hagerdal,1996,Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production, Enz. Microb. Tech.18 312-331 ；及Vallander禾口Eriksson, 1990,Production of ethanol from lignocellulosic materials :State of the art, Adv. Biochem. Eng. /Biotechnol. 42 :63-95)。水解在發(fā)酵前和/或與發(fā)酵同時(shí)，可以將經(jīng)預(yù)處理的含木質(zhì)纖維素材料水解，以分解 (break down)纖維素和半纖維素。水解期間的干燥固體含量可在5_50wt. %，優(yōu)選10_40wt. %，優(yōu)選20_30wt. %的 范圍內(nèi)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，水解可以作為補(bǔ)料分批方法進(jìn)行，其中將經(jīng)預(yù)處理的含木 素纖維素材料(底物)向例如包含酶的水解溶液中逐漸補(bǔ)料。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，水解以酶法進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明，經(jīng)預(yù)處理的含木質(zhì)纖 維素材料可以通過(guò)一種或多種水解酶(根據(jù)酶命名法為EC 3類)水解，優(yōu)選選自下 組的一種或多種糖酶纖維素酶、半纖維素酶，淀粉酶如α-淀粉酶、蛋白酶、糖生成酶 (carbohydrate-generating enzyme)如葡糖淀粉酶、酯酶如脂肪酶。在水解和/或發(fā)酵期 間可存在α -淀粉酶、葡糖淀粉酶等，因?yàn)楹舅乩w維素材料可能包括一些淀粉。用于水解的酶能直接或間接將糖聚合物轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵的糖，后者能發(fā)酵成為期望 的發(fā)酵產(chǎn)物，如乙醇。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，糖酶具有纖維素酶的活性。合適的糖酶在下面的“酶”部 分中描述?？赏ㄟ^(guò)半纖維素酶和/或酸水解分解半纖維素聚合物，以釋放其五碳糖和六碳糖 組分。六碳糖(己糖)，如葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和甘露糖，通過(guò)合適的發(fā)酵生物體(包 括酵母)可容易地發(fā)酵成為，例如乙醇、丙酮、丁醇、甘油、檸檬酸、富馬酸等。優(yōu)選用于乙醇 發(fā)酵的是釀酒酵母菌種的酵母，優(yōu)選對(duì)高水平乙醇，即，高至例如約10、12或15vol. %乙醇 或者更多，如20vol. %乙醇有抗性的菌株。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用半纖維素酶，優(yōu)選木聚糖酶、酯酶、纖維二糖酶或其 組合水解經(jīng)過(guò)預(yù)處理的含木質(zhì)纖維素材料。水解也可以在半纖維素酶和/或纖維素酶，和任選的下文“酶”部分中提及的一種 或多種其它酶活性的組合存在的情況下進(jìn)行?？梢栽诳捎杀绢I(lǐng)域技術(shù)人員容易確定的條件下，在合適的含水環(huán)境中進(jìn)行酶處理。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在適于所述酶的條件(優(yōu)選最適條件)下進(jìn)行水解。合適的工藝時(shí)間、溫度和pH條件可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易地確定。優(yōu)選地，水 解在25-70°C，優(yōu)選40-60°C，特別是約50°C的溫度進(jìn)行。優(yōu)選地，該工藝在pH 3_8，優(yōu)選pH 4-6，特別是約pH 5的pH進(jìn)行。優(yōu)選地，水解進(jìn)行12-96小時(shí)，優(yōu)選16-72小時(shí)，更優(yōu)選小時(shí)。
發(fā)酵根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)至少一種能將可發(fā)酵糖如葡萄糖、木糖、甘露糖和半乳糖直接或 間接發(fā)酵成為期望發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵生物體，來(lái)發(fā)酵經(jīng)預(yù)處理(和水解)的含木素纖維素材 料。發(fā)酵中的pH在5. 5到9. 0，優(yōu)選在5. 7到8. 0，更優(yōu)選5. 8到7. 0，且最優(yōu)選在至少 PH5. 9到6. 5的范圍，如約pH 6。pH可以使用任何合適的化合物調(diào)整。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方 案中，使用NaOH調(diào)整pH。發(fā)酵過(guò)程中的干固體濃度在約20 %到高至約35 %的范圍，如至少20 %、至少 21%、至少22%、至少23%、至少25%、至少、至少27%、至少、至少四％，和高至 約30%、高至31%、高至32%、高至33%或甚至高至；34%。發(fā)酵優(yōu)選進(jìn)行8至96小時(shí)，優(yōu)選12至72小時(shí)，更優(yōu)選從M至48小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)酵在20至40°C，優(yōu)選沈至:34°C，特別是約32°C的溫度進(jìn) 行。在一個(gè)實(shí)施方案中，PH為pH 5. 5至9. 0，優(yōu)選從約pH 6至6. 5。根據(jù)本發(fā)明，步驟(a)中的水解和步驟(b)中的發(fā)酵可同時(shí)(SSF方法)或順次 (SHF方法)，或作為混合水解和發(fā)酵(HHF)進(jìn)行。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，水解和發(fā)酵作為同時(shí)水解和發(fā)酵步驟進(jìn)行(SSF)。通常這 意味著組合的/同時(shí)水解和發(fā)酵在對(duì)所述發(fā)酵生物合適(優(yōu)選為最佳)的條件(例如，溫 度和/或pH)下進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，沒(méi)有水解的單獨(dú)保持階段，意味著水解酶和發(fā)酵生物體一 起加入。當(dāng)發(fā)酵(例如，使用酵母屬酵母的乙醇發(fā)酵)與水解同時(shí)進(jìn)行時(shí)，溫度優(yōu)選為 260C -35°C，更優(yōu)選30°C _34°C，如約32°C。根據(jù)本發(fā)明可以使用包含在不同溫度的至少兩 個(gè)保持階段的溫度程序。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，水解和發(fā)酵作為混合水解和發(fā)酵(HHF)進(jìn)行。HHF—般 以單獨(dú)的部分水解步驟起始，并以同時(shí)水解和發(fā)酵步驟結(jié)束。所述單獨(dú)的部分水解步驟是 酶法纖維素糖化步驟，一般在對(duì)所述水解酶合適(優(yōu)選為最佳)的條件(例如，在較高的溫 度)下進(jìn)行。后續(xù)的同時(shí)水解和發(fā)酵步驟通常在對(duì)所述發(fā)酵生物合適的條件(通常在比所 述單獨(dú)水解步驟更低的溫度)下進(jìn)行。最后，水解和發(fā)酵步驟還可以以分開(kāi)的水解和發(fā)酵 來(lái)進(jìn)行，其中在發(fā)酵起始之前完成所述水解。這常常稱作“SHF”。Ml^發(fā)酵后，可以從發(fā)酵培養(yǎng)基/培養(yǎng)液(broth)分離發(fā)酵產(chǎn)物?？梢哉麴s培養(yǎng)基/ 培養(yǎng)液以提取發(fā)酵產(chǎn)物，或者可以通過(guò)微濾或膜過(guò)濾技術(shù)從發(fā)酵培養(yǎng)基/培養(yǎng)液提取發(fā)酵 產(chǎn)物?；蛘呖梢酝ㄟ^(guò)氣提(stripping)回收發(fā)酵產(chǎn)物?；厥辗椒ㄊ潜绢I(lǐng)域中公知的。發(fā)酵產(chǎn)物本發(fā)明的方法可以用于產(chǎn)生任何發(fā)酵產(chǎn)物。特別期望的發(fā)酵產(chǎn)物包括醇(例如， 乙醇、甲醇、丁醇)；有機(jī)酸(例如，檸檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡萄糖酸)；酮(例如，丙 酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；氣體(例如，H2和CO2)；抗生素(例如，青霉素和四環(huán)素)； 酶；維生素(例如，核黃素、B12、β-胡蘿卜素)；和激素。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，發(fā)酵產(chǎn)物是醇，特別是乙醇。根據(jù)本發(fā)明獲得的發(fā)酵產(chǎn) 物，如乙醇，可以優(yōu)選為燃料醇/乙醇。然而，在乙醇的情況中，其還可以用作飲料乙醇。
發(fā)酵牛物體術(shù)語(yǔ)“發(fā)酵生物體”指適于產(chǎn)生期望的發(fā)酵產(chǎn)物的任何生物體，包括細(xì)菌和真菌 生物體。根據(jù)本發(fā)明的特別合適的發(fā)酵生物體能發(fā)酵，即，將糖如葡萄糖，直接或間接轉(zhuǎn)化 成期望的發(fā)酵產(chǎn)物。發(fā)酵生物體的實(shí)例包括真菌生物體，如酵母。優(yōu)選的酵母包括酵母 屬的菌株，特別是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)的菌株；畢赤酵母屬(Pichia)，特別是樹(shù)干畢赤酵母(Pichia stipitis)或巴斯德 畢赤酵母(Pichia pastoris)的菌株；假絲酵母屬(Candida)的菌株，特別是產(chǎn)朊假絲酵 母(Candida utilis)、阿糖發(fā)酵假絲酵母(Candida arabinofermentans)、迪丹斯假絲酵母 (Candida diddensii)或博伊丁假絲酵母(Candida boidinii)的菌株。其它涵蓋的酵母包 括漢遜酵母屬(Hansenula)，特別是多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)或異常漢遜酵 母(Hansenula anomala)的菌株；克魯維酵母屬(Kluyveromyces)，特別是馬克斯克魯維酵 母(Kluyveromyces marxianus)或脆壁克魯維酵母(Kluyveromyces fagilis)的菌株，禾口 裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces),特別是粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe) 的菌株。優(yōu)選的細(xì)菌發(fā)酵生物體包括埃希氏菌屬Escherichia)，特別是大腸桿 菌(Escherichia coli)的菌株，發(fā)酵單孢菌屬(Zymomonas)，特別是運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單 孢菌(Zymomonas mobilis)的菌株，發(fā)酵桿菌屬(Zymobacter)，特別是棕櫚發(fā)酵桿 菌(ZymcAactor palmae)的菌株，克雷伯氏菌屬(Klebsiella)，特別是產(chǎn)酸克雷伯 氏菌(Klebsiella oxytoca)的菌株，明串珠菌屬(Leuconostoc)，特別是腸膜明串 珠菌(Leuconostoc mesenteroides)的菌株，梭菌屬(Clostridium),特另Ij 是 丁酸梭 菌(Clostridium butyricum)的菌株，腸桿菌屬(Enterobacter),特另Il是產(chǎn)氣腸桿 菌(Enterobacter aerogenes)的菌株，禾口 熱厭氧桿菌屬(Thermoanaerobacter)的菌 株，特別是熱厭氧桿菌BGlLl (App 1. Micrbiol. Biotech. 77 :61-86)和乙醇熱厭氧桿菌 (Thermoanarobacter ethanolicus)。商業(yè)上可用的酵母包括，例如，RED STAR 或ETHANOL RED 酵母(可由i^ermentis/ Lesaffre, USA 獲得)、FALI (可由 Fleischmann，s Yeast, USA 獲得)、SUPERSTART 和 THERMOSACC 新鮮酵母(可由 Ethanol Technology, WI,USA 獲得)、BI0FERM AFT 和 XR(可 由 NABC-North American Bioproducts Corporation, GA, USA 獲得)、GERT STRAND(可由 Gert Strand AB, Sweden 獲得)和 FERMI0L(可由 DSM Specialties 獲得)。酶在本發(fā)明方法的語(yǔ)境中，即使未特別提及，應(yīng)理解酶(以及其它化合物)是以“有 效量”使用。纖維素分解酶在發(fā)酵、水解、SHF或HHF過(guò)程中，可存在一種或多種纖維素分解酶。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“纖維素分解酶”應(yīng)理解為包括纖維二糖水解酶(EC3. 2. 1. 91)， 例如，纖維二糖水解酶I和纖維二糖水解酶II，以及內(nèi)切葡聚糖(EC3. 2. 1. 4)和β -葡糖苷 酶(EC3. 2. 1. 21)。對(duì)上述酶進(jìn)一步的描述參見(jiàn)下面的相關(guān)部分。為了有效，對(duì)纖維素的消化可需要數(shù)種類型的酶合作發(fā)揮作用。通常需要至少三 類酶來(lái)將纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖內(nèi)切葡聚糖酶(EC 3.2. 1.4)，其隨機(jī)剪切纖維素鏈；纖維二糖水解酶(EC 3. 2. 1. 91)，其自纖維素鏈末端切割纖維二糖基單元，以及β -葡糖苷酶 (EC 3. 2. 1. 21)，其將纖維二糖和可溶性纖維糊精轉(zhuǎn)化為葡萄糖。在這三類涉及纖維素生物 降解的酶中，纖維二糖水解酶是降解天然微晶纖維素的關(guān)鍵酶。在本文中，術(shù)語(yǔ)“纖維二糖 水解酶I”定義為纖維素1，4-β -纖維二糖糖苷酶(亦稱為外切葡聚糖酶、外切纖維二糖水 解酶或1，4-β纖維二糖水解酶)活性，如酶分類EC 3.2. 1.91所定義，其通過(guò)從鏈的非還 原末端釋放纖維二糖來(lái)催化纖維素和纖維四糖中l(wèi)，4-i3-D-葡糖苷鍵的水解。對(duì)術(shù)語(yǔ)“纖 維二糖水解酶II活性”的定義是相同的，只是纖維二糖水解酶II自鏈的還原末端進(jìn)攻。所述纖維素分解酶可包含糖結(jié)合模塊(CBM)，其增強(qiáng)該酶與含木素纖維素纖維的 結(jié)合，并增加該酶催化活性部分的功效。CBM定義為在對(duì)糖有活性的酶中鄰接的氨基酸序 列，其帶有具糖結(jié)合活性的謹(jǐn)慎折疊(discreet fold)。關(guān)于CBM進(jìn)一步的信息參見(jiàn)CAZy 互聯(lián)網(wǎng)服務(wù)器(見(jiàn)上)或 iTomme 等(1995)于 Enzymatic Degradation of Insoluble Polysaccharides(Saddler 禾口 Penner 編)，Cellulose-binding domains -classification and properties, pp. 142-163, AmericanChemical Society, Washington。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述纖維素分解酶可為如美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?0/941251中定義 的纖維素分解制備物，該文件通過(guò)提述并入本文。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述纖維素分 解制備物包含具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽(GH61A)，優(yōu)選WO 2005/074656中公開(kāi)的 桔橙嗜熱霉(Thermoascus aurantiacus)GH61A(通過(guò)提述并入本文)。所述纖維素分解 制備物可進(jìn)一步包括β-葡糖苷酶，如源自腐質(zhì)霉屬(Humicola)、木霉屬(Trichoderma)、 曲霉屬(Aspergillus)和青霉屬(Penicillium)菌株的β -葡糖苷酶，包括美國(guó)申請(qǐng) 號(hào) US 11/781，151 或 PCT/US2007/074038 (Novozymes)中公開(kāi)的特異腐質(zhì)霉(Humicola ins0lens)CEL45A內(nèi)切葡聚糖酶核心/米曲霉(Aspergillus oryzae) β -葡糖苷酶融 合蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述纖維素分解制備物亦可包括CBH II，優(yōu)選土生梭孢霉 (Thielavia terrestris)纖維二糖水解酶II (CEL6A)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述纖維素 分解酶制備物也可包含纖維素酶制備物，優(yōu)選源自里氏木霉(Trichoderma reesei)的。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，纖維素分解活性可源自真菌來(lái)源，如木霉屬的菌株，優(yōu)選 里氏木霉菌株；或腐質(zhì)霉屬的菌株，如特異腐質(zhì)霉的菌株，或金孢子菌屬(Chrysosporium) 的菌株，優(yōu)選 Chrysosporium Iucknowense 的菌株。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述纖維素分解酶制備物包括WO 2005/074656中公開(kāi)的具 有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽(GH61A)；纖維二糖水解酶，如土生梭孢霉纖維二糖水解酶 II (CEL6A) ； β -葡糖苷酶(例如，美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?0/832，511中公開(kāi)的融合蛋白)，以及纖維素 分解酶，例如，源自里氏木霉的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述纖維素分解酶為商業(yè)上可得到的產(chǎn)品CEI. lUCLAST 1. 5L 或 CELLUZYME (可從 Novozymes A/S, Denmark 獲得)或 ACCELERASE 1000 (可從 Genencor Inc. , USA 獲得)。可添加纖維素分解酶用于水解經(jīng)預(yù)處理的含木素纖維素材料。所述纖維素分解酶 可以0. 1-100FPU每克干固體，優(yōu)選0. 5-50FPU每克干固體，特別為1-20FPU每克干固體范 圍內(nèi)的劑量添加。所述纖維素分解酶可以1-1000EGU每克干固體，優(yōu)選10-500EGU每克干固體，特別 是50到200EGU每克干固體的劑量添加。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，將至少Img纖維素分解酶每克干固體(DS)，優(yōu)選至少3mg纖 維素分解酶每克干固體，如5-10mg纖維素分解酶每克干固體用于水解。內(nèi)切葡聚糖酶(EG)內(nèi)切葡聚糖酶(E. C. No. 3. 2. 1. 4)催化下述物質(zhì)中1，4_β -D-糖苷鍵的內(nèi)水解纖 維素、纖維素衍生物(例如羧甲基纖維素和羥乙基纖維素)、地衣淀粉、在混合β-1，3-葡聚 糖如谷類β-D-葡聚糖或木葡聚糖中的β _1，4鍵，以及其它含有纖維素部分的植物材料。 其官方名稱為內(nèi)-l，4-i3-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶，但在本說(shuō)明書(shū)中使用其簡(jiǎn)稱內(nèi)切葡 聚糖酶。內(nèi)切葡聚糖酶活性可使用羧甲基纖維素(CMC)水解根據(jù)(ihose，1987，Pure and App 1. Chem. 59 :257-268 的方法確定。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，內(nèi)切葡聚糖酶可源自木霉屬的菌株，優(yōu)選里氏木霉的菌 株；腐質(zhì)霉屬的菌株，優(yōu)選特異腐質(zhì)霉的菌株；或金孢子菌屬的菌株，優(yōu)選Chrysosporium Iucknowense 的菌株。纖維二糖水解酶(CBH)術(shù)語(yǔ)“纖維二糖水解酶”意指1，4- β -D-葡聚糖纖維二糖水解酶(Ε. C. 3. 2. 1. 91)， 其在纖維素、纖維寡糖或任何含有β -1，4-連接的葡萄糖的聚合物中催化1，4-β -D-葡糖 苷鍵的水解，自鏈的還原或非還原末端釋放纖維二糖。纖維二糖水解酶的實(shí)例為上面提及的，包括來(lái)自里氏木霉、特異腐質(zhì)霉的CBH I和 CBH II ；來(lái)自土生梭孢霉的CBH II纖維二糖水解酶(CELL6A)。纖維二糖水解酶活性可根據(jù)由Lever等，1972，Anal. Biochem. 47 :273-279和由 van Tilbeurgh 等，1982，F(xiàn)EBS Letters 149 :152-156 ；van Tilbeurgh 禾口 Claeyssens， 1985,FEBS Letters 187 :283-288描述的方法來(lái)確定。所述Lever等的方法適用于評(píng)估玉 米秸桿中纖維素的水解，而van Tilbeurgh等的方法適用于對(duì)于熒光二糖衍生物確定纖維 二糖水解酶活性。g -葡糖苷酶一種或多種β-葡糖苷酶(有時(shí)稱為“纖維二糖酶”)可在水解、發(fā)酵、SHF或HHF 過(guò)程中存在。術(shù)語(yǔ)“β-葡糖苷酶”意指β-D-葡糖苷葡糖水解酶(E.C.3.2. 1.21)，其催化末 端非還原性β-D-葡萄糖殘基的水解，及β-D-葡萄糖的釋放。就本發(fā)明而言，葡糖苷 酶的活性根據(jù)由Venturi等，2002，J. Basic Microbiol. 42 :55-66描述的基本方法確定， 只是如本文所述使用不同的條件。一單位的葡糖苷酶活性定義為自4mM對(duì)-硝基苯 基-β-D-吡喃葡糖苷作為底物在IOOmM檸檬酸鈉，0.01 %TWEEN 20中在50°C，pH 5 每分鐘產(chǎn)生1. 0微摩爾的對(duì)-硝基苯酚。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述β-葡糖苷酶為真菌來(lái)源的，如木霉屬、曲霉屬或青 霉屬的菌株。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述β-葡糖苷酶源自里氏木霉，如由bgll基因 編碼的β-葡糖苷酶(參見(jiàn)EP 562003的

圖1)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述β -葡 糖苷酶源自米曲霉(根據(jù)WO 02/095014在米曲霉中重組產(chǎn)生)，煙曲霉(Aspergillus fumigatus)(根據(jù)WO 02/095014的實(shí)施例22在米曲霉中重組產(chǎn)生)，或黑曲霉(1981， J. Appl. 3157-163)。纖維素分解增強(qiáng)活件
術(shù)語(yǔ)“纖維素分解增強(qiáng)活性”在本文中定義為使具有纖維素分解活性的蛋白質(zhì)對(duì) 木素纖維素衍生材料的水解增強(qiáng)的生物活性。就本發(fā)明而言，通過(guò)測(cè)量與具有相等總蛋白 加載量但沒(méi)有纖維素分解增強(qiáng)活性(l-50mg纖維素分解蛋白/g PCS (經(jīng)預(yù)處理的玉米秸) 中的纖維素)的對(duì)照水解相比，在如下條件下由于纖維素分解蛋白對(duì)木素纖維素衍生材料 (例如經(jīng)預(yù)處理的含木素纖維素材料)的水解而發(fā)生的還原糖的增加或纖維二糖和葡萄糖 總量的增加來(lái)測(cè)定纖維素分解增強(qiáng)活性l_50mg總蛋白質(zhì)/g PCS中的纖維素，其中總蛋白 質(zhì)的組成為(comprised of) 80-99. 5% w/w纖維素分解蛋白/g PCS中的纖維素和0. 5-20% w/w纖維素分解增強(qiáng)活性蛋白，在50°C進(jìn)行1-7天。具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽通過(guò)降低達(dá)到相同程度水解所需的纖維素分解 酶量來(lái)增強(qiáng)具有纖維素分解活性的蛋白質(zhì)所催化的對(duì)木素纖維素來(lái)源材料的水解，所述纖 維素分解酶量的降低優(yōu)選至少0. 1倍、更優(yōu)選至少0. 2倍、更優(yōu)選至少0. 3倍、更優(yōu)選至少 0. 4倍、更優(yōu)選至少0. 5倍、更優(yōu)選至少1倍、更優(yōu)選至少3倍、更優(yōu)選至少4倍、更優(yōu)選至 少5倍、更優(yōu)選至少10倍、更優(yōu)選至少20倍、更優(yōu)選至少30倍、最優(yōu)選至少50倍、甚至最 優(yōu)選至少100倍。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，水解和/或發(fā)酵是在存在與具有增強(qiáng)活性的多肽組合 的纖維素分解酶的情況下進(jìn)行的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有增強(qiáng)活性的多肽是家族 GH61A多肽。WO 2005/074647披露了來(lái)自土生梭孢霉的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的分離的 多肽及其多核苷酸。WO 2005/074656披露了來(lái)自桔橙嗜熱霉(Thermoascus aurantiacus) 的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的分離的多肽及其多核苷酸。美國(guó)申請(qǐng)
發(fā)明者任海彧, 黃鴻志 申請(qǐng)人:中糧集團(tuán)有限公司, 諾維信公司