專利名稱：：通過淀粉和木聚糖的降解酶的表達(dá)開發(fā)能進(jìn)行淀粉和木聚糖的醇發(fā)酵的耐熱酵母多形漢...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本申請涉及通過發(fā)酵進(jìn)行纖維素乙醇生產(chǎn)的領(lǐng)域，具體地涉及淀粉和木聚糖碳源的發(fā)酵，更具體地涉及用于通過淀粉和木聚糖發(fā)酵進(jìn)行乙醇生產(chǎn)的重組多形漢遜酵母(H.polymorpha)菌株，并且還更具體地涉及分泌重組的α淀粉酶和葡糖淀粉酶、和/或木糖水解酶和木糖苷酶以通過在含淀粉和木聚糖的培養(yǎng)基上進(jìn)行發(fā)酵實(shí)現(xiàn)乙醇生產(chǎn)的多形漢遜酵母菌株。前言由可再生原料如植物生物質(zhì)進(jìn)行燃料乙醇生產(chǎn)具有重要的經(jīng)濟(jì)學(xué)和生態(tài)學(xué)意義。植物木質(zhì)纖維素具有作為目前生物乙醇生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用的蔗糖和基于淀粉的多糖的替代性原料的潛力。木質(zhì)纖維素和其他植物來源的多糖代表了一種可通過二氧化碳的生物轉(zhuǎn)化進(jìn)行再生產(chǎn)的可再生的持續(xù)性能量來源。由植物生產(chǎn)的生物燃料勝過化石燃料的許多受追捧的環(huán)境益處之一是溫室氣體的顯著減少W，24]。目前世界上生產(chǎn)的絕大多數(shù)的乙醇來源于淀粉或蔗糖。許多農(nóng)作物中富含淀粉和糖類，但是當(dāng)乙醇作為一種液體交通運(yùn)輸燃料而擴(kuò)大生產(chǎn)時(shí)，需要不與食物和動(dòng)物飼料的使用直接競爭的原料。這些原料包括來自農(nóng)業(yè)和林業(yè)上的木質(zhì)纖維素副產(chǎn)品殘余物[14]。木質(zhì)纖維素是來源于木材和農(nóng)業(yè)殘余物的植物物質(zhì)的通用術(shù)語。其主要包含木質(zhì)素和纖維素以及大量的半纖維素，具有較少量的結(jié)構(gòu)蛋白和有機(jī)溶劑可萃取的物質(zhì)[14]。半纖維素是由作為骨架的木聚糖組成并且存在于植物細(xì)胞壁中的一種取代的多糖[11]。木質(zhì)纖維素和淀粉加工成乙醇包括四個(gè)主要的單元操作預(yù)處理，水解，發(fā)酵和產(chǎn)物分離/純化。淀粉的生物轉(zhuǎn)化包括酶水解和所得的葡萄糖發(fā)酵成乙醇，伴隨動(dòng)物飼料副產(chǎn)品的產(chǎn)生。由于木質(zhì)纖維素具有較復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，并且在不同植物(谷類植物、軟木材、硬木材等)和同一植物(莖、殼、稈、穗軸、秸稈、葉、核等)中的組成具有很大不同，因此木質(zhì)纖維素的水解較為困難[14]。木糖是在具有C5L-阿拉伯糖和其他C6糖類如葡萄糖、甘露糖、半乳糖作為主要己糖的半纖維素成分水解得到的主要的戊糖[11]。由于木質(zhì)纖維素的工藝涉及許多步驟，且需要高能量投入，因此，木質(zhì)纖維素作為原料的商業(yè)生機(jī)需要開發(fā)更直接且廉價(jià)的技術(shù)。糖類聚合物的直接微生物轉(zhuǎn)化(DMF，直接微生物發(fā)酵)是一種可使由木質(zhì)纖維素生產(chǎn)生物乙醇的經(jīng)濟(jì)效益提高的選擇。開發(fā)這項(xiàng)技術(shù)的關(guān)鍵先決條件之一是獲得能夠在高溫下直接使淀粉和木聚糖發(fā)酵成乙醇的微生物[15]。目前DMF所涉及的水解酶的最佳溫度約為50°C，而目前由木質(zhì)纖維素糖類和淀粉糖類進(jìn)行生物乙醇生產(chǎn)所用的絕大部分微生物為嗜溫生物，其最佳生長和發(fā)酵溫度在到40°C之間[6]。本實(shí)驗(yàn)室的最近研究顯示耐熱的甲基營養(yǎng)型酵母多形漢遜酵母能夠在高溫(37-480C)下使D-木糖和D-葡萄糖發(fā)酵為乙醇。因?yàn)槎嘈螡h遜酵母生長和發(fā)酵的最佳溫度較高，所以它是用于DMF技術(shù)的深入開發(fā)的一個(gè)優(yōu)秀候選者[3，26]。由于多形漢遜酵母不能利用淀粉和木聚糖作為碳源和能量來源，所以異源木聚糖降解酶基因和淀粉降解酶基因在這種酵母中的克隆和過表達(dá)是必需的。β_1，4木聚糖是存在于植物細(xì)胞壁的幾乎所有部分中的異質(zhì)性多糖。β_1，4-連接的木糖單體形成主鏈，主鏈上連接有一些取代基[30]。木聚糖主鏈的水解由β_1，4木聚糖內(nèi)切酶(1，4-β-D-木聚糖的木聚糖水解酶，EC3.2.1.8)和β-D-木糖苷酶(1，4-β-D木聚糖的木糖水解酶，EC3.2.1.37)催化。β-木聚糖內(nèi)切酶作用于木聚糖和木寡糖，主要產(chǎn)生木寡糖的混合物。β-D-木糖苷酶將木寡糖水解為D-木糖[19]。真菌木霉屬(Trichoderma)和曲霉屬(Aspergillus)分泌大量有效的木聚糖降解酶。里氏木霉(Trichodermareesei)是已知具有纖維素水解活性和木聚糖水解活性的一種絲狀嗜溫性真菌[3]。由這種真菌分泌的兩種主要可誘導(dǎo)型木聚糖內(nèi)切酶為Xynl和Xyn2。Xyn2占木聚糖上培養(yǎng)的里氏木霉的總木聚糖水解活性的50%以上。曲霉屬的成員也是纖維素水解酶和木聚糖水解酶的有效生產(chǎn)者。編碼804個(gè)氨基酸的β-木糖苷酶的黑曲霉(A.niger)的xlnD基因在酵母中被成功表達(dá)[19]。淀粉由兩種高分子量成分組成直鏈淀粉和支鏈淀粉。直鏈淀粉為較少的組分00-30%)，是由α-1，4-連接的葡萄糖殘基和一些α_1，6支化點(diǎn)形成的一種直鏈多糖；而支鏈淀粉代表淀粉中的較多的成分(70-80%)，且高度分支[4]。淀粉由兩種分泌的淀粉酶降解α-淀粉酶和葡糖淀粉酶[25]。α-淀粉酶(1，4_α-D-葡聚糖的葡聚糖水解酶，EC3.2.1.1)催化淀粉和相似底物的α-1，4-葡萄糖苷鍵的淀粉內(nèi)部裂解，釋放麥芽糖、寡糖和極限糊精。葡糖淀粉酶(l，4-a-D-葡聚糖葡萄糖水解酶，EC3.2.1.3)水解葡萄寡糖(glucooligosaccharide)和麥芽糖為D-葡萄糖。酵母西方許旺酵母(khwanniomycesoccidentalis)生產(chǎn)分解淀粉的酶類，并使淀粉高效地發(fā)酵成乙醇[34]。由這種酵母分泌的α-淀粉酶是由SWA2基因編碼。GAMl基因編碼分泌性葡糖淀粉酶。一些從谷物顆粒如玉米的加工中得到的農(nóng)業(yè)木質(zhì)纖維素殘余物(如玉米纖維殼)含有大量的淀粉。因此建立能夠?qū)⒌矸酆湍举|(zhì)纖維素直接積極轉(zhuǎn)化成乙醇的微生物菌株具有重大的經(jīng)濟(jì)意義。概述本文描述的是能夠直接使淀粉和木聚糖進(jìn)行乙醇發(fā)酵的分解淀粉和木聚糖的多形漢遜酵母菌株。我們在此描述了通過將基因西方許旺酵母SWA2和GAM1，里氏木霉ΧΥΝ2和黑曲霉xlnD成功插入該酵母的染色體中并表達(dá)它們而構(gòu)建菌株。同時(shí)，過表達(dá)丙酮酸脫羧酶(PDC)的菌株經(jīng)過基因工程改造而具有這些基因中的一個(gè)或多個(gè)。在每種情況中菌株都能夠單獨(dú)在含可溶性淀粉或可溶性木聚糖的培養(yǎng)基上生長，并且能夠以不同水平使可溶性淀粉或可溶性木聚糖發(fā)酵為乙醇。同時(shí)過表達(dá)PDC的菌株給出比僅過表達(dá)SWA2和GAMl基因的菌株更高的乙醇滴度。圖1.質(zhì)粒pGAMl(6.63kb)、pGAMlSWA2(9.lkb)、pORl(10.8kb)和pORll(101Λ)的線性圖譜?；疑虮硎镜氖呛琇EU2基因的釀酒酵母(S.cerevisiae)基因組片段，綠色框表示的是HpGAP啟動(dòng)子，HpAOX終止子橙色框，藍(lán)色框表示的是GAMl基因的ORF，SWA2基因的0RF:紅色框，氨基糖苷3-磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(APH)黑色框。限制性位點(diǎn):H,HindIII；RV,EcoRV；K,KpnI；RI,EcoRI；Si,SalI；Bi,BamHI；Bg,BglII；Sc,SacI；P,PstI；Sm,SmaI。圖2.質(zhì)粒pK08-GAPpr(7.6kb)、pK08-GAPpr_SWA2(9.Ikb)和pK08_GAPpr_XYN2(8.27kb)的線性圖譜?；疑虮硎镜氖呛琇EU2基因的釀酒酵母基因組片段，黃色框表示的是HpGAP啟動(dòng)子，HpAOX終止子藍(lán)色框，SWA2基因的ORF紅色框，TrXYN2基因的ORF橙色框。限制性位點(diǎn):H,HindIII；Nd,NdeI；K,KpnI；RI,EcoRI；Si,SalI；Bi,BamHI；Bg,BglII；Sc,SacI；P,PstI；Nt,NotI。圖3.質(zhì)粒pXYN2(4.24kb)、pXYN2xlnD(7.6lkb)和p0R2(9.57kb)的線性圖譜?；疑颍琇EU2基因的釀酒酵母基因組片段；綠色框，HpGAP啟動(dòng)子；橙色框，HpAOX終止子；藍(lán)色框，含黑曲霉xlnD基因ORF的片段；紅色框，含里氏木霉XYN2基因的ORF的片段。限制性位點(diǎn)H，HindIII;RV，EcoRV;K，KpnI；RI,EcoRI；Si,SalI；B,BamHI；Bg,BglII；Sc,SacI；P,PstI；Sm,SmaI；Xb,XbaI；Sp,SphI。圖4.含2%可溶性淀粉作為唯一碳源的YNB基本培養(yǎng)基中多形漢遜酵母重組體2Eth-leul-l/p0Rl#14，(A)和#7(B)在不同培養(yǎng)基pH下的乙醇生產(chǎn)量1_ρΗ未校正；2-pH6；3-pH5.5；48°C，135rpm。圖5.含3%或9%樺木木聚糖的YNB基本培養(yǎng)基中多形漢遜酵母重組菌株4952Eth-leul-l/p0R2在不同pH的培養(yǎng)基(A)和通氣條件(B)下的乙醇生產(chǎn)量。48°C。圖6.通過PCR對多形漢遜酵母轉(zhuǎn)化體的基因組DNA中HpGAP啟動(dòng)子下的GAM1，SWA2，XYN2和xlnD基因進(jìn)行證實(shí)。泳道##2，3利用K43，Ko51引物對分析通過用質(zhì)粒p0R2轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)化體，以顯示人工構(gòu)建體與HpGAP啟動(dòng)子和HpAOX終止子融合的里氏木霉XYN20RF。泳道##4，5利用K43，Ko47引物對分析由質(zhì)粒p0R2獲得的轉(zhuǎn)化體，以顯示構(gòu)建體與HpGAP啟動(dòng)子融合的黑曲霉xlnD。泳道##6，7利用K43，Ko49弓丨物對分析由質(zhì)粒pORl和pORll獲得的轉(zhuǎn)化體，以顯示構(gòu)建體與HpGAPl啟動(dòng)子融合的西方許旺酵母的GAM1。泳道##8，9利用K43，Ko50引物對分析由質(zhì)粒pORl和pORll獲得的轉(zhuǎn)化體，以顯示構(gòu)建體與HpGAPl啟動(dòng)子和HpAOX終止子融合的西方許旺酵母SWA2的0RF。泳道##1，10=DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物。圖7.表達(dá)由HpGAPl啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的西方許旺酵母SWA2基因和GAMl基因的多形漢遜酵母重組體形成的透明斑(halo)。由于SWA2基因和GAMl基因的天然啟動(dòng)子的抑制，對照西方許旺酵母菌株在補(bǔ)充了葡萄糖的培養(yǎng)基上未產(chǎn)生斑(B)。第二個(gè)對照中的2Eth_leul-l菌株不能在以淀粉作為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長(A)。圖8.含2%可溶性淀粉的YNB基本培養(yǎng)基中多形漢遜酵母重組菌株2Eth_leul_l/P0R1##7和14，的乙醇生產(chǎn)量，48°C，i:35rpm。圖9.重組菌株#7，lM4952EttTleul-l/p0Rl)，l，，2，，4，，2g(4952EttTleul-l/pORll)和受體菌株4952Kh_leul-l的培養(yǎng)基的SDS-PAGE分析。用8%的分離膠進(jìn)行電泳，通過考馬斯染色和銀染顯示出蛋白條帶。A，葡糖淀粉酶的顯示；B，α-淀粉酶的顯示；α-淀粉酶的彌散條帶可能是糖基化的程度不同所造成。L，蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物。圖10.多形漢遜酵母重組體##7，14G952Ettrieul-l/p0Rl)和多拷貝整合體##1，，2，，3，，4，和2g(4952Etneul-l/p0Rll)形成的透明斑。圖11.斑點(diǎn)印跡Southern雜交的結(jié)果顯示了多形漢遜酵母轉(zhuǎn)化體中編碼淀粉降解酶的基因的拷貝數(shù)。利用HpGAP啟動(dòng)子作為探針。菌株l-wt(l拷貝標(biāo)準(zhǔn))；2，3-##7，14(約3-4拷貝)；4，5，7-分別為##1，，2，，4，，(約6-8拷貝)；6_#3，(3拷貝)。圖12.含3-4個(gè)淀粉酶基因拷貝的重組酵母菌株##7，14,60952Eth_leul-l/pORl)和含6-8個(gè)基因拷貝的##1，，2，，4，^P2g(4952EttTleul-l/p0Rll)的培養(yǎng)基中的α-淀粉酶(A)和葡糖淀粉酶(B)的比活性。圖13.多形漢遜酵母重組體2Eth_leul-l/p0Rl的乙醇生產(chǎn)量(#1菌株##7和14的平均乙醇生產(chǎn)量)和2Etrieul-l/p0Rll(#2菌株##1，，2，，4，，2g的平均乙醇生產(chǎn)量)的乙醇生產(chǎn)量。菌株在含3%可溶性淀粉的YNB基本培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，pH5.5,48135rpm。圖14.含3%可溶性淀粉的基本培養(yǎng)基中，過表達(dá)淀粉分解酶基因和PDCl基因的多形漢遜酵母菌株的乙醇生產(chǎn)量；48°C，135rpm。4，，轉(zhuǎn)化體4952Kh_leul-l/p0Rll(受體菌株，對照)；6p，10，12，轉(zhuǎn)化體4，/ploxZeoloxPDClHp。圖15.由多形漢遜酵母重組體#6p(4，/ploxZeoloxPDClHp)及其衍生物整合體##1，2，2-1，3，4，5，7，9，10(6p/p0Rl)形成的透明斑。圖16.在47°C，限制性通氣條件下，含3%可溶性淀粉的基本培養(yǎng)基中，過表達(dá)淀粉降解酶和Pdclp的多形漢遜酵母菌株的乙醇生產(chǎn)量。4，，轉(zhuǎn)化體4952Kh_leul-l/p0Rll；6p，轉(zhuǎn)化體4，/ploxZeoloxPDClHp；3，4，5，轉(zhuǎn)化體6p/p0Rl。圖17.表達(dá)木聚糖內(nèi)切酶基因和β-木糖苷酶基因的多形漢遜酵母重組體在以木聚糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基上的生長。Α，表達(dá)木聚糖內(nèi)切酶基因和木糖苷酶基因的重組菌株(菌株##6Χ和8Χ)在以木聚糖作為唯一碳源的固體培養(yǎng)基上的生長。B，在含3%來自樺木的木聚糖(Bi)或2%木糖(B》的液體基本培養(yǎng)基中表達(dá)木聚糖內(nèi)切酶基因和β-木糖苷酶基因的菌株在生長期間的生物質(zhì)累積，48°C，240rpm。6X，8X，轉(zhuǎn)化體4952EttTleul-l/p0R2。圖18.表達(dá)黑曲霉xlnD基因和里氏木霉XYN2基因的多形漢遜酵母重組體所形成的黃斑㈧或透明斑⑶。圖19.多形漢遜酵母在重組菌株4952Kh7p0I^##6X和8X的培養(yǎng)基中的木聚糖內(nèi)切酶㈧和β-木糖苷酶⑶的比活性。圖20.Α.含與SWA2基因(SEQ.IDNO1)和多形漢遜酵母AOX終止子(雙下劃線)可操作地連接的多形漢遜酵母GAP啟動(dòng)子(單下劃線)的重組構(gòu)建體序列。B.來自西方許旺酵母的由SWA2基因編碼的α-淀粉酶的氨基酸序列(SEQ.IDΝ02)。圖21.Α.含與GAMl基因(SEQ.IDNO3)和多形漢遜酵母AOX終止子(雙下劃線)可操作地連接的多形漢遜酵母GAP啟動(dòng)子(單下劃線)的重組構(gòu)建體序列。B.來自西方許旺酵母的由GAMl基因編碼的葡糖淀粉酶(SEQ.IDNO4)的氨基酸序列。圖22.A.含與黑曲霉的xlnD基因(SEQ.IDNO5)可操作地連接的多形漢遜酵母GAP啟動(dòng)子(單下劃線)的重組構(gòu)建體序列，該xlnD基因包括內(nèi)源性終止子序列(SEQ.IDNO9，雙下劃線)。B.由xlnD基因編碼的β-木糖苷酶的氨基酸序列(SEQ.IDNO6)。圖23.Α.含與里氏木霉的Xyn2基因(SEQ.IDNO7)可操作地連接的多形漢遜酵母GAP啟動(dòng)子(單下劃線)的重組構(gòu)建體序列，該Xyn2基因包含內(nèi)源性終止子序列(SEQ.IDNO10，雙下劃線)。B.由Xyn2基因編碼的β-木聚糖內(nèi)切酶的氨基酸序列(SEQ.IDNO8)。方法、菌株和結(jié)果的詳述菌株和培養(yǎng)基利用異丙基蘋果酸脫氫酶缺陷的且不能在乙醇中生長的多形漢遜酵母菌株4952Eth-leul-l[14]作為受體，以分離淀粉降解重組體和木聚糖降解重組體。該菌株是NCYC495Ieul-I的衍生物[8]。在37°C或48°C使酵母菌株和轉(zhuǎn)化體在YPD(0.5%酵母提取物，蛋白胨，2%葡萄糖)培養(yǎng)基或基本培養(yǎng)基(無氨基酸的0.67%YNB，2%葡萄糖，3%可溶性淀粉(SigmaS2630-500G)或3%來自樺木的木聚糖(FlukaX0502-100G))上生長。對于4952Kh_leul-l菌株，培養(yǎng)基中再加入亮氨酸G0mg/L)。在YPD上選擇酵母轉(zhuǎn)化體時(shí)，加入0.2mg/L的G418(遺傳霉素)或150ug/ml的博萊霉素(zeocine)。利用大腸桿菌(E.coli)DH5a菌株[(D80dlacZΔΜ15，recAl,endAl,gyrA96,thi-1,hsdR17(rρ+κ)，supE44,relAl,deoR,Δ(lac-ZYA-argF)U169]作為宿主進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增。按以前所報(bào)道的那樣在37°C的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)該菌株[27]。轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞在含100mg/L氨芐青霉素的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。DNA技術(shù)應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)[27]。利用WizardsPlusSV小量制備DNA純化系統(tǒng)(WizardsPlusSVMiniprepsDNAPurificationSystem,Promega,Madison,WI,USA)從大腸桿菌中分離出質(zhì)粒DNA。利用Wizards基因組DNA純化試劑盒(WizardsGenomicDNAPurificationKit,Promega,Madison,WI,USA)分離多形漢遜酵母、西方許旺酵母、里氏木霉和黑曲霉的基因組DNA。按照制造商說明書，使用限制性核酸內(nèi)切酶，T4DNA連接酶和T4DNA聚合酶(Fermentas，Vilnius,Lithuania)。用0.8%的瓊脂糖凝膠(FisherScientific,FairLawn,NJ,USA)在IXTAE中分離DNA片段[27]。用DNA凝膠提取試劑盒(DNAGelExtractionKit，Millipore，Bedford，MA，USA)從凝膠中分離片段。TaqDNA聚合酶和高保真混合聚合酶(HighFidelityMixPolymerase，兩者均為Fermentas，Vilnius,Lithuania)分別用于分析性PCR和制備性PCR。在GeneAmpsPCRSystem9700循環(huán)變溫器(AppliedBiosystems,FosterCity,CA,USA)中進(jìn)行PCR。通過電穿孔轉(zhuǎn)化多形漢遜酵母按以前所述進(jìn)行[5]。攜帶西方許旺酵母的α-淀粉酶基因和葡糖淀粉酶基因的質(zhì)粒的構(gòu)津利用PCR將編碼葡糖淀粉酶的GAMl基因的開放閱讀框(ORF)和天然終止子(3.27kb)從西方許旺酵母菌株NRRLY-M70的基因組DNA中分離出來，所用引物為Ko48(CCCAAGCTTATGATTTTTCTGAAGCTG)和Ko49(GGAAGATCTTTCTTTACAAGACCAATG)。將HindIII和BglII的限制性位點(diǎn)加入到引物Κο48和Κο49中(下劃線所示為切割位點(diǎn))。PCR產(chǎn)物用限制性核酸內(nèi)切酶HindIII和BglII消化，然后置于被HindIII和BamHI消化后的甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的強(qiáng)組成型啟動(dòng)子(HpGAPpr)下。通過雙重連接的方式將構(gòu)建體HpGAPpr+GAMl插入到質(zhì)粒pUC57的BamHI位點(diǎn)。所得質(zhì)粒被命名為pGAMl，并且在如下構(gòu)建中用作載體(圖1)。利用PCR對編碼α-淀粉酶的SWA2基因的0RF(21Λ)進(jìn)行擴(kuò)增，所用引物為SWAl(TAGTCGCATATGAGATTTTCAACTGAAGG)，SWA2(CTATTGATTGCAGATGCCAGATCCC)，以西方許旺酵母NRRLY-247的基因組DNA作為模板。將限制性位點(diǎn)NdeI加入到引物SWAl中。用NdeI對PCR產(chǎn)物的5’端進(jìn)行消化，而補(bǔ)平3’端。將產(chǎn)物插入到質(zhì)粒pK08-GAPpr中(圖2)。將SWA2基因的ORF置于HpGAPpr之下并與HpAOX終止子(HpAOXtr)融合。利用構(gòu)建的質(zhì)粒pK08-GAPpr_SWA2作為樽板，使用引物K43(CCGGATCCCAATTATCATTAATAATC)，K。51(CGCGGATCCAATCTTGCCTTTAAAATG)，通過PCR對含HpGAPpr+SWA2_0RF+HpA0Xtr的DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增。所得PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶BamHI進(jìn)行消化，然后插入到質(zhì)粒PGAMl的BamHI位點(diǎn)中。將該構(gòu)建質(zhì)粒命名為pGAMlSWA2(圖1)。將釀酒酵母LEU2基因(選擇性標(biāo)記物)插入到質(zhì)粒PGAM1SWA2的I^stI限制性位點(diǎn)中，并將所得構(gòu)建體命名為PORl(圖1)。用限制性核酸內(nèi)切酶I3StI消化質(zhì)粒pGLG61后從中分離在酵母中賦予對G418的抗性的氨基糖苷3-磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(ΑΡΗ)。將含該基因的pGLG61[30]的I^stI-片段與攜帶重組基因GAM1、SWA2和細(xì)菌部分基因但是沒有釀酒酵母LEU2基因的質(zhì)粒pORl的I^stI部分相連接。所得質(zhì)粒命名為PORll(圖1)。在多形漢遜酵母中表達(dá)的SWA2和GAMl重組構(gòu)建體的序列分別如圖20和圖21所7J\ο構(gòu)建編碼β-木糖苷酶的XlnD基因來自真菌黑曲霉。利用引物Ko46(TGCTCTAGAATGGCGCACTCAATGTCTCG)和Ko47(CCCGAGCTCAGCTATGCTAGCAAGCAGC)將xlnD基因的ORF與天然終止子(2.79kb)從黑曲霉菌株NRRL3的基因組DNA中分離出來。PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶McI和)(baI(這些核酸內(nèi)切酶的位點(diǎn)位于產(chǎn)物兩側(cè))進(jìn)行處理，然后置于HpGAPpr之下。將構(gòu)建體HpGAPpr+xlnD插入到質(zhì)粒pUC57的McI位點(diǎn)。所得質(zhì)粒命名為pxlnD，并在以后的構(gòu)建中用作載體(圖3)。利用PCR對無內(nèi)含子區(qū)域的編碼木聚糖內(nèi)切酶(0.67kb)的XYN2基因的ORF進(jìn)行擴(kuò)增，所用引物為TRl(TTCTCACATATGGTTGCCTTTTCCAGCCCTCATCTGCGC)，TR2(CTAGTTGCTGACACTCTGTGAGGCAGAACCACTACCACC)，TRir(GAGCCGCCMAGTTGATGGGAGCAGAAGATCCAGTCGTC)，TRif(GACGACTGGATCTTCTGCTCCCATCAACTTTGGCGGCTC)，模板為里氏木霉NRRL11460的基因組DNA。PCR產(chǎn)物的5，端用NdeI進(jìn)行消化，而3’端被補(bǔ)平。將產(chǎn)物插入到質(zhì)粒pK08-GAPpr(圖2)中。將XYN2基因的ORF置于HpGAPpr之下，并用HpAOXtr終止。以所得質(zhì)粒pK08_GAPpr_XYN2(圖2)作為模板，利用PCR對含HpGAPpr+0RF_XYN2+HpA0Xtr的DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，引物為K43(CCGGATCCCAATTATCATTAATAATC)、Ko50(GGAAGATCTAATCTTGCCTTTAAAATG)。所得PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶BamHI和BglII進(jìn)行消化后插入到質(zhì)粒pxlnD的BamHI位點(diǎn)中。所構(gòu)建質(zhì)粒被命名為pxlnDXYN2(圖3)。將釀酒酵母的LEU2基因插入到質(zhì)粒pxlnDXYN2的I^stI位點(diǎn)中，并且最終獲得質(zhì)粒命名為p0R2(圖3)。在多形漢遜酵母中表達(dá)的XylD和XYL2重組構(gòu)建體的序列分別如圖22和圖所示ο篩詵淀粉酶活件將用攜帶α-淀粉酶和葡糖淀粉酶的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后所獲得的重組菌株接種于含2%可溶性淀粉(Sigma)作為碳源的基本培養(yǎng)基平板上，然后對重組菌體中的淀粉酶活性進(jìn)行篩選。將平板在37°C下孵育兩天，然后保持在4°C過夜。淀粉降解酶的克隆可通過菌落周圍的透明斑來檢測W，16]。篩詵木聚糖內(nèi)切酶活件將相應(yīng)的轉(zhuǎn)化體鋪板于含0.2%的4-0-甲基-D-葡萄糖醛_D_木聚糖-雷瑪唑亮藍(lán)(RBB)-木聚糖(Sigma)和2%的葡萄糖作為碳源的基本培養(yǎng)基上，然后對轉(zhuǎn)化體的木聚糖降解能力進(jìn)行篩選。將平板在37°C下孵育3-4天。木聚糖內(nèi)切酶將RBB-木聚糖剪切生成無色產(chǎn)物，在菌落的周圍形成透明斑[11，20]。篩詵β-木糖苷酶活件將相應(yīng)的轉(zhuǎn)化體鋪板于含ImM對硝基苯基-β-D-木糖苷(PNPX)和2%的葡萄糖作為碳源的基本培養(yǎng)基上，然后對轉(zhuǎn)化體的木糖苷酶活性進(jìn)行篩選。將平板在37°C下孵育1-3小時(shí)。通過菌落周圍所產(chǎn)生的黃斑對酶活性進(jìn)行檢測[19]。α-淀粉酶和葡糖淀粉酶活性分析利用適度稀釋的無細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行酶分析。利用3，5-二硝基水楊酸(DNS)法對總淀粉酶活性進(jìn)行測定。用200μ1的0.4Μ含2%可溶性淀粉的醋酸鈉緩沖液(ρΗ5.0)與50μ1等份的培養(yǎng)上清在50°C下孵育30分鐘。將混合物煮沸10分鐘以終止反應(yīng)。α-淀粉酶的1個(gè)活性單位的定義為，在同樣培養(yǎng)條件下每分鐘每毫升釋放Iymol的還原糖所需的酶的量[17，22]。在葡糖淀粉酶活性的分析中，在30°C將0.9ml煮沸淀粉溶液保持在醋酸鈉緩沖液(ρΗ5.幻中5分鐘，然后加入0.Iml的樣品，并將混合物孵育15分鐘。然后通過煮沸反應(yīng)混合物10分鐘終止反應(yīng)，并利用“Diagluc”分析試劑盒(UBT，Lviv,Ukraine)測定所生成的葡萄糖的濃度[9]。通過用總淀粉酶活性減去葡糖淀粉酶活性計(jì)算出α-淀粉酶的活性。葡糖淀粉酶的1個(gè)活性單位定義為每分鐘從底物釋放1μmol的葡萄糖所需的酶的量[28]。g-木糖苷酶和木聚糖內(nèi)切酶活性分析產(chǎn)酶培養(yǎng)物在3ml的YPD中過夜培養(yǎng)。通過離心收集細(xì)胞，并且上清液用于酶活性測定。用Bailey等報(bào)道的方法[1]在50°C時(shí)用的樺木木聚糖(Fluka)作為底物對β-1，4-木聚糖內(nèi)切酶活性進(jìn)行分析。用50mM檸檬酸鈉緩沖液(pH5.0)中的適度稀釋的無細(xì)胞培養(yǎng)物溶液作為酶源。通過二硝基水楊酸方法測定所釋放的糖的量[20]。利用濃度為5mM的生色底物PNPX對β-木糖苷酶進(jìn)行定量。以上清作為β_木糖苷酶的來源進(jìn)行活性測定分析。所有活性均以開特/ml來表示；一開特指每秒從樺木木聚糖或生色底物中產(chǎn)生Imol還原糖所需的酶的量[19]。乙醇生產(chǎn)量分析10對于乙醇生產(chǎn)量，在48°C、準(zhǔn)好氧條件下在含3%可溶性淀粉或3%來自樺木的木聚糖的液體基本培養(yǎng)基中對多形漢遜酵母轉(zhuǎn)化體進(jìn)行4天的培養(yǎng)。每M小時(shí)用“Alcotest”試劑盒測定培養(yǎng)基中的乙醇濃度[10]。DH和通氣對淀粉發(fā)酵為乙醇的效力的影響對所分離的轉(zhuǎn)化體將淀粉直接發(fā)酵成乙醇的最佳條件進(jìn)行研究。在48°C下，用盛有50mlYPD培養(yǎng)基的125ml錐形燒瓶在搖床InkubatorlOOOHeidolph(Schwabach,Germany)中對酵母菌株預(yù)培養(yǎng)48小時(shí)，振搖設(shè)置在220rpm。將該細(xì)胞以ang/ml的濃度接種于50ml含3%馬鈴薯可溶性淀粉作為唯一碳源的基本培養(yǎng)基中。對淀粉發(fā)酵過程中培養(yǎng)基的pH對乙醇生產(chǎn)量的影響進(jìn)行研究。α-淀粉酶的最佳PH為約6.0，且葡糖淀粉酶為5.2-5.5。用ρΗ5.5和6.0的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵。用IM磷酸鉀緩沖液對培養(yǎng)基的PH進(jìn)行調(diào)整。最優(yōu)乙醇生產(chǎn)量是在pH為5.5的培養(yǎng)基中(圖4Α&Β)。研究了通氣對發(fā)酵效率的影響。對120rpm至180rpm的轉(zhuǎn)速進(jìn)行檢測。當(dāng)135rpm旋轉(zhuǎn)時(shí)獲得最高乙醇生產(chǎn)量。VEdmMmmmiykmm^m^z.mm^iimmm對所分離的轉(zhuǎn)化體將樺木木聚糖發(fā)酵成乙醇的最佳條件進(jìn)行研究。在48°C下，用盛有50mlYPD培養(yǎng)基的125ml錐形燒瓶對酵母菌株預(yù)培養(yǎng)48小時(shí)，振搖設(shè)置在220rpm。然后在4000rpm下離心5分鐘除去細(xì)胞，洗滌并接種(濃度為ang/ml)于50ml含3%或9%樺木木聚糖和0.05%葡萄糖作為碳源的基本培養(yǎng)基中。對木聚糖發(fā)酵過程中培養(yǎng)基的pH對乙醇生產(chǎn)量的影響進(jìn)行研究。用pH4.5和5.8的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵。IM磷酸鉀緩沖液的溶液以在培養(yǎng)基中的0.IM終濃度對培養(yǎng)基的pH進(jìn)行調(diào)整。培養(yǎng)基pH為5.8時(shí)獲得乙醇最優(yōu)生產(chǎn)量(圖5A)。研究通氣對發(fā)酵效率的影響。對120rpm至180rpm的轉(zhuǎn)速進(jìn)行檢測。在120rpm的情況下獲得最高乙醇生產(chǎn)量(圖5B)。較高的木聚糖濃度(9%)導(dǎo)致更好的乙醇生產(chǎn)量(圖5)。Southern印跡雜交按照產(chǎn)品手冊利用非放射性的AmershamECL直接核酸標(biāo)記和檢測系統(tǒng)(GEHealthcare,USA)進(jìn)行探針DNA的標(biāo)記和雜交。定于定量的Southern斑點(diǎn)印記，將所制備的一系列稀釋的酵母基因組DNA在0.4MNaOH中變性，點(diǎn)在干燥尼龍膜上(HybondN+,AmershamPharmaciaBiotech)并用合適的DNA片段進(jìn)行標(biāo)記，然后用上述的AmershamECL檢測試劑盒進(jìn)行顯示。用HpGAPpr作為探針。凝膠電泳用Laemmli的方法進(jìn)行SDS-PAGE[19]。用銀染法和考馬斯亮藍(lán)染色法使無細(xì)胞提取物中的濃縮蛋白顯示。電泳凝膠和濃縮膠的濃度分別為12%和5%的聚丙烯酰胺。將20μ1的Laemmli溶液加入到20μ1的樣品中，然后取35μ1的混合物注入到電泳凝膠中[31]。MM多形漢遜酵母中西方許旺酵母的SWA2和GAMl基因的表達(dá)將多形漢遜酵母菌株4952Kh_leul_l作為受體，利用被SphI線性化的質(zhì)粒pORl(質(zhì)粒圖譜如圖1所示)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后細(xì)胞鋪板于補(bǔ)充了2%葡萄糖和可溶性淀粉的基本培養(yǎng)基上。在約140個(gè)轉(zhuǎn)化體中挑選出了形成最大淀粉降解透明斑的14個(gè)轉(zhuǎn)化體。通過PCR利用相應(yīng)引物顯示這些轉(zhuǎn)化體中在HpGAPpr之下的SWA2基因和GAMl基因的存在(圖6)。轉(zhuǎn)化體能夠在可溶性淀粉上生長，并且在37°C和48°C時(shí)將底物發(fā)酵生成乙醇。通過菌落周圍的透明斑的形成顯示整合體中淀粉酶的有效分泌(圖7A&B)。在48°C，pH5.5條件下，所選出的最佳整合體OKh_leul-l/p0Rl#7)在含3%可溶性淀粉的基本培養(yǎng)基中發(fā)酵48小時(shí)后產(chǎn)出3g/L以上的乙醇(圖8)。為獲得具有增加的淀粉降解活性的多形漢遜酵母菌株，我們嘗試提高SWA2和GAMl的拷貝數(shù)?；诖四康氖褂昧藬y帶顯性標(biāo)記(賦予對G418的抗性的APH基因)以及SWA2和GAMl基因的質(zhì)粒pORll。將多形漢遜酵母菌株4952Kh_leul-l作為受體，利用被SphI線性化的質(zhì)粒pORll進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化以后，細(xì)胞被鋪板于含0.2g/lG418的YPD培養(yǎng)基上。在所得約80個(gè)G418-抗性菌落中發(fā)現(xiàn)并挑選出5個(gè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體。通過PCR方法利用相應(yīng)引物，顯示這些轉(zhuǎn)化體中在HpGAPpr之下的SWA2基因和GAMl基因的存在(圖6)。通過SDS-PAGE對這些菌株所生產(chǎn)的重組酶(α-淀粉酶和葡糖淀粉酶)進(jìn)行驗(yàn)證(圖9Α&Β)。用質(zhì)粒pORll轉(zhuǎn)化后的分離物與早期從pORl質(zhì)粒中分離的最佳轉(zhuǎn)化體相比，所形成的淀粉降解透明斑更大(圖10)。Southern雜交驗(yàn)證了分離的轉(zhuǎn)化體中約存在6_8個(gè)拷貝的SWA2基因和GAMl基因(圖11)。與僅含3-4個(gè)拷貝淀粉酶基因的菌株相比，轉(zhuǎn)化體4952Etrieul-l/p0Rll表現(xiàn)出了更高的α-淀粉酶和葡糖淀粉酶活性(圖12Α&Β)。對分離的轉(zhuǎn)化體的乙醇淀粉發(fā)酵效力進(jìn)行研究。與pORl轉(zhuǎn)化后早期分離的轉(zhuǎn)化體相比，這些轉(zhuǎn)化體顯示出了增高的乙醇生產(chǎn)量(72小時(shí)培養(yǎng)后，6.5g/L)。在pH5.5，48°C，135rpm條件下，在含3%可溶性淀粉的基本YNB培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵(圖13)。利用本實(shí)驗(yàn)室早期構(gòu)建的質(zhì)粒plodeoloxPDClHp獲得具有改良的淀粉降解性質(zhì)的多形漢遜酵母菌株。在過表達(dá)丙酮酸脫羧酶基因(PDCl)后，這些菌株與對照菌株495相比其特征在于乙醇生產(chǎn)量增高[14]。含HpGAPpr驅(qū)動(dòng)的PDCl基因的質(zhì)粒ploxkoloxPDClHp經(jīng)過BamHI線性化并用于早期分離的菌株#4，(4952Eth7pORl)的轉(zhuǎn)化。用補(bǔ)充150μg/ml博萊霉素的YPD培養(yǎng)基對博萊霉素抗性轉(zhuǎn)化體進(jìn)行選擇。選出一些穩(wěn)定的整合體用于進(jìn)一步研究。對這些重組體的乙醇發(fā)酵效力進(jìn)行研究。與4’菌株相比(至多4g/L；圖14)，所有轉(zhuǎn)化體均表現(xiàn)出較高水平的乙醇生產(chǎn)量(7-8g/L)。利用菌株#6(轉(zhuǎn)化體4’/plodeoloxPDClHp，表現(xiàn)出最高水平的乙醇生產(chǎn)量)作為受體，用經(jīng)過SphI線性化的質(zhì)粒pORl進(jìn)行轉(zhuǎn)化。在無亮氨酸的基本培養(yǎng)基中選擇Leu+轉(zhuǎn)化體，并使其穩(wěn)定化。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體鋪板于補(bǔ)充2%可溶性淀粉的基本培養(yǎng)基上。與菌株#6相比形成了更大的透明斑的一些整合體被選擇用于進(jìn)一步研究(圖15)。對這些重組體的乙醇發(fā)酵效力進(jìn)行研究。與菌株#6相比時(shí)，所有轉(zhuǎn)化體均表現(xiàn)出較高水平的乙醇生產(chǎn)量(9-10g/L)。多形漢遜酵母中里氏木霉XYN2基因和黑曲霉XLND基因的表達(dá)包含用HpGAPpr(圖3)驅(qū)動(dòng)的里氏木霉XYN2基因和黑曲霉xlnD基因的質(zhì)粒p0R2被SphI線性化并用于多形漢遜酵母菌株4952Kh_leul-l的轉(zhuǎn)化。Leu+轉(zhuǎn)化體被穩(wěn)定化。通過PCR利用相應(yīng)引物對轉(zhuǎn)化體中HpGAPpr之下的XYN2和xlnD基因的存在進(jìn)行檢測(圖6)。轉(zhuǎn)化體能夠在木聚糖為唯一碳源生長(圖17，A、B1和B2)。木聚糖內(nèi)切酶和β-木糖苷酶在整合體中的有效分泌是通過在分別含0.2%RBB-木聚糖或ImMPNPX的培養(yǎng)基上形成的透明斑或黃斑來顯示的(圖18Α和18Β)。對兩種酶的活性進(jìn)行測定(圖19Α和19Β)。在37和48°C時(shí)，轉(zhuǎn)化體能夠以低效率將樺木木聚糖發(fā)酵為乙醇(約0.35g/L)。多形漢遜酵母中里氏木霉XYN2基因、黑曲霉XLND基因與西方許旺酵母SWA2基因和GAMl基因的共表汰在第一個(gè)實(shí)例中，將包含整合入多形漢遜酵母染色體的來自西方許旺酵母的α-淀粉酶基因和葡糖淀粉酶基因的轉(zhuǎn)化體4952Kh_leul-l/p0Rll用作宿主菌株。包含用HpGAPpr驅(qū)動(dòng)的里氏木霉XYN2基因和黑曲霉xlnD基因的質(zhì)粒p0R2被SphI線性化并用于轉(zhuǎn)化多形漢遜酵母菌株4952Kh_leul-l/p0Rll。按前述方法穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體。通過PCR利用相應(yīng)引物檢測XYN2基因和xlnD基因的存在。轉(zhuǎn)化體能夠以可溶性淀粉和/或可溶性木聚糖作為唯一碳源生長。基本上按前述方法驗(yàn)證所有四種酶的有效分泌。轉(zhuǎn)化體可在37°C和48V使含可溶性淀粉和樺木木聚糖的混合培養(yǎng)基發(fā)酵生成乙醇。在第二個(gè)實(shí)例中，具有已轉(zhuǎn)化到菌株中的α-淀粉酶基因和葡糖淀粉酶基因的前面所述的轉(zhuǎn)化體4’/ploxZeoloPDClHp過表達(dá)PDC基因，用作宿主菌株。又一次，包含用HpGAPpr驅(qū)動(dòng)的里氏木霉XYN2基因和黑曲霉xlnD基因的質(zhì)粒p0R2被SphI線性化并用于多形漢遜酵母宿主菌株的轉(zhuǎn)化。按照前述方法穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體。通過PCR利用相應(yīng)引物檢測XYN2和xlnD基因的存在。轉(zhuǎn)化體將能夠以可溶性淀粉和/或可溶性木聚糖作為唯一碳源生長?；旧习凑涨笆龇椒?yàn)證所有四種酶的有效分泌。與第一個(gè)實(shí)例中制備的轉(zhuǎn)化體相比，這些轉(zhuǎn)化體可在37°C和48°C使含可溶性淀粉和樺木木聚糖的混合培養(yǎng)基以更高水平發(fā)酵生成乙醇，這是由于宿主細(xì)胞中PDC酶的補(bǔ)合的(complimentary)過表達(dá)。碰由可再生植物材料進(jìn)行燃料乙醇的生產(chǎn)具有巨大的經(jīng)濟(jì)學(xué)和生態(tài)學(xué)意義。玉米纖維殼成分是來自容易大量獲得的玉米濕磨工業(yè)的副產(chǎn)物之一。該成分與其他加工副產(chǎn)物和來自乙醇發(fā)酵的釜餾物(Stillage)成分相混合和干燥來生產(chǎn)玉米麩質(zhì)飼料。玉米纖維殼由35%的半纖維素、18%的纖維素和20%的淀粉組成(蛋白質(zhì)、纖維油和木質(zhì)素也包含在該材料中)[7]。木聚糖是半纖維素的主要成分。包括木聚糖和淀粉的酶水解在內(nèi)的工業(yè)步驟是非常昂貴的。因此利用微生物將這些聚合物直接轉(zhuǎn)化成乙醇具有重要的經(jīng)濟(jì)意義。為此目的，建立能夠在高溫下同時(shí)水解淀粉和木聚糖、并將所釋放的糖發(fā)酵為乙醇的微生物，對于由玉米生產(chǎn)燃料乙醇具有重要意義。葡萄糖和木糖分別是淀粉和木聚糖水解后釋放的主要糖類。多形漢遜酵母在高溫下將葡萄糖和木聚糖發(fā)酵為乙醇。但是多形漢遜酵母不能利用淀粉質(zhì)材料和木聚糖作為唯一碳源并在其上生長。我們從西方許旺酵母中克隆了SWA2和GAMl兩種基因，它們分別編碼α-淀粉酶和葡糖淀粉酶。這些酶均為淀粉水解所需。SWA2和GAMl基因在多形漢遜酵母中被成功表達(dá)。所分離的重組菌株能夠利用淀粉為唯一碳源進(jìn)行生長。它們還能夠在48°C時(shí)使可溶性淀粉發(fā)酵為乙醇。我們顯示基因拷貝數(shù)的增加提高了重組菌株的淀粉水解能力和乙醇生產(chǎn)能力。分別編碼木聚糖內(nèi)切酶和β-木糖苷酶的里氏木霉XYN2基因和黑曲霉xlnD基因在多形漢遜酵母中被克隆和表達(dá)。至少其中的兩種酶是木聚糖水解所需。所分離的整合體能夠利用木聚糖作為唯一碳源生長，并在37°C和48°C將其發(fā)酵為乙醇。所分離的菌株將木聚糖轉(zhuǎn)化為乙醇的低效力很可能是由于漢遜酵母菌株的原始的木聚糖乙醇發(fā)酵能力較低。所構(gòu)建菌株在木聚糖發(fā)酵上進(jìn)一步提高將需要木糖的乙醇發(fā)酵提高作為前提。這些菌株然后可作為受體用于構(gòu)建有效的木聚糖降解重組體。參考文獻(xiàn)1.Bailey,Μ.J.,P.Biely,禾口K.Poutanen.1992.Interlaboratorytestingofmethodsforassayofxylanaseactivity.(用于木聚糖酶活性分析的實(shí)驗(yàn)室間檢測方法)J.Biotechnol.23:257-270.2.Banat,I.M.，P.Nigam,D.singh,P.Marchant,禾口k.P.McHale.1998.Ethanolproductionatelevatedtemperaturesandalcoholconcentrations.PartI:yeastsingeneral.(高溫下的乙醇生產(chǎn)和酒精濃度。第一部分酵母概述)WorldJMicrobiolBiotechnol.14:809-821.3.Dmytruk,0.V.，Α.Y.Voronovsky,C.A.Abbas,K.V.Dmytruk,0.P.Ishchuk,禾口Α.Α.Sibirny.2008.OverexpressionofbacterialxyloseisomeraseandyeasthostxylulokinaseimprovesxylosealcoholicfermentationinthethermotolerantyeastHansemulapolymorpha.(耐熱酵母多形漢遜酵母中細(xì)菌木糖異構(gòu)酶和酵母宿主木酮糖激酶的過表達(dá)改善了木糖的醇發(fā)酵)FEMSYeastRes.8165-173.4.Eksteen,J.M.,P.vanRensburg,R.R.CorderoOtero,禾口I.S.Pretorius.2003.StarchfermentationbyrecombinantSaccaromycescerevisiaestrainsexpressingtheα-amylaseandglucoamylasegenesfromLipomyceskononenkoaeandSaccharomycopsisfibuligera.(由表達(dá)橘林油脂酵母和扣囊復(fù)膜孢酵母來源的α-淀粉酶和葡糖淀粉酶基因的重組釀酒酵母菌株進(jìn)行的淀粉發(fā)酵)Biotechnol.Bioengineer.84639-646.5.Faber,KN,P.Haima,W.Harder,Μ.Veenhuis，禾口G.Ab.1994.Highly-efficientelectrotransformationoftheyeastHansenulapolymorpha.(多形漢遜酵母的高效電轉(zhuǎn)化。)Curr.Genet.25:305-310.6.Fujita,Y.，禾口J.Ito.2004.Synergisticsaccharification，anddirectfermentationtoethanol,ofamorphouscellulosebyuseofanengineeredyeaststraincodisplayingthreetypesofcellulolyticenzyme·(利用同時(shí)表現(xiàn)三禾中類型的纖維素分解酶的工程改造的酵母菌株對非晶型纖維素進(jìn)行協(xié)同糖化和直接乙醇發(fā)酵)Appl.Environ.Microbiol.70:1207-1212.7.Gaspar,M.，G.Kalman,禾口K.Reczey.2007.Cornfiberasarawmaterialforhemicelluloseandethanolproduction.(玉米纖維作為半纖維素和乙醇生產(chǎn)的原材料)ProcessBiochem.42:1135-1139.8.Gellissen,G.,G.Kunze,C.Gaillardin,J.Μ.Cregg,Ε.Berardi,Μ.Veenhuis,禾口I.vanderKlei.2005.NewyeastexpressionplatformsbasedonmethylotrophicHansenulapolymorphaandPichiapastorisandondimorphicArxulaadeninivoransandYarrowialipolyticaacomparison.(基于甲基營養(yǎng)型多形漢遜酵母和巴斯德畢赤酵母與基于二形性Arxulaadeninivorans和解脂耶氏酵母的新型酵母表達(dá)平臺進(jìn)行的比較)FEMSYeastRes.51079-1096.9.Gonchar,Μ.V.1998.Sensitivemethodforquantitatvedeterminationofhydrogenperoxideandoxidasesubstratesinbiologicalsamples.(對生物樣品中白勺過氧化氫和氧化酶底物進(jìn)行定量測定的靈敏方法)Ukr.Biokhim.Zh.70:157-163.10.Gonchar,M.V.，Μ·Μ·Maidan禾口A.A.Sibirny.2001.Anewoxidase-peroxidasekitforethanolassaysinalcoholicbeverages.(—禾中胃Zi酉享白勺f型氧化酶-過氧化物酶試劑盒)FoodTechnol.Biotechnol.39:37-42.11.denHaanR.,禾口W.H.vanZyl.2001.DifferentialexpressionoftheTrichodermareeseiβ-xylanaseII(xyn2)geneinthexylose-fermentingyeastPichiastipitis.(里氏木霉β-木糖苷酶II(xyM)基因在發(fā)酵木糖的酵母樹干畢赤酵母中的差異表達(dá))ApplMicrobiolBiotechnol.57:521-527.12.Haki,G.D.,禾口S.K.Rakshit.2003.Developmentsinindustriallyimportantthermostableenzymes:areview.(工業(yè)中重要的熱穩(wěn)定性酶的發(fā)展綜述)BioresourceTechnology.89:17-34.13.Ishchuk,0.P.,Α.Y.Voronovsky,0.V.Stasyk,G.Ζ.Gayda,Μ.V.Gonchar,C.Α.Abbas,禾口A.A.Sibirny.2008.Improvementofxylosehigh-temperaturefermentationinHansenulapolymorphaduetooverexpressionofthePDClgenecodingforpyruvatedecarboxylase.(多形漢遜酵母中由于編碼丙酮酸脫羧酶的PDCl基因的過表達(dá)改良了木糖的高溫發(fā)酵)FEMSYeastRes.Inpress.14.Jeffries,Τ.W.,禾口Y.S.Jin.2000.Ethanolandthermotoleranceinthebioconversionofxylosebyyeasts.(酵母的木糖生物轉(zhuǎn)化中的乙醇和耐熱性)Adv.Appl.Microbiol.47:221-268.15.Kadam,K.L.,禾口S.L.Schmidt.1997.EvaluationofCandidaacidothermophiIuminethanolproductionfromlignocellulosicbiomass.(Candidaacidothermophilum由木質(zhì)纖維素生物質(zhì)進(jìn)行乙醇生產(chǎn)的評估)Appl.Microbiol.Biotechnol.48:709-713.16.Kang,N.Y.，J.N.Park,J.Ε.Chin,H.B.Lee,S.Y.Im,禾口S.Bai.2003.ConstructionofanamylolyticindustrialstrainofSaccharomycescerevisiaecontainingtheSchwanniomycesoccidentalisα-amylasegene.(含西方i午日王酵母α-淀粉酶基因的釀酒酵母的淀粉降解工業(yè)菌株的構(gòu)建)Biotechnol.Lett.251847-1851.17.Kilic,D.,禾口B.Ozbek.2004.α-Amylaseinactivationbytemperatureduringstarchhydrolysis.(淀粉水解期間的溫度導(dǎo)致的α-淀粉酶失活)ProcessBiochem.39:1139-1144.18.Kulkarni,N.,A.Shendye,禾口Μ·Rao.1999.Molecularandbiotechnologicalaspectsofxylanases.(木聚糖酶的分子和生物技術(shù)方面)FEMSMicrobiol.Rev.23411-456.19.LaGrange,D.C.,I.S.Pretorius,Μ.Claeyssens,禾口W.H.vanZyl.2001.DegradationofxylantoD—xylosebyrecombinantSaccharomycescerevisiaecoexpressingtheAspergillusnigerβ-xylosidase(xlnD)andtheTrichodermareeseixylanaseII(xyn2)genes.(共表達(dá)黑曲霉β-木糖苷酶基因(xlnD)和里氏木霉木聚糖酶II(xyn2)基因的重組釀酒酵母將木聚糖降解為D-木糖)Appl.Environ.Microbiol.67:5512-5519.20.LaGrange,D.C.,I.S.Pretorius,禾口W.H.vanZyl.1996.ExpressionofaTrichodermareeseiβ-xylanasegene(XYN2)inSaccharomycescerevisiae.(里氏木霄β-木聚糖酶基因(ΧΥΝ2)在釀酒酵母中的表達(dá))Appl.Environ.Microbiol.62:1036-1044.21.Laemmli,U.K.1970.CleavageofstructuralproteinsduringtheassemblyoftheheadofbacteriophageT4.CT4噬菌體的頭部組裝期間結(jié)構(gòu)蛋白的裂解)Nature.227:680-685.22.Liu,Ζ.,G.Zhang,禾口S.Liu.2004.ConstructinganamylolyticbrewingyeastSaccharomycespastorianussuitableforacceleratedbrewing.(適合于力口速釀造的淀粉降解釀酒酵母巴斯德酵母的構(gòu)建)J.Biosci.Bioeng.98:414-419.23.Marin,D.,A.Jimenez,禾口Μ·FernandezLobato.2001.ConstructionofanefficientamylolyticindustrialyeaststraincontainingDNAexclusivelyderivedfromyeast.(僅含酵母來源DNA的高效淀粉降解工業(yè)酵母菌株的構(gòu)建)FEMSMicrobiol.Lett.201:249-253.24.Mosier,N.,禾口C.Wyman.2005.Featuresofpromisingtechnologiesforpretreatmentoflignocellulosicbiomass.(預(yù)處理木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的有前景的技術(shù)的特征)Bioresour.Technol.96:673-686.25.Piontek,M.,J.Hagedorn,C.P.Hollenberg,G.Gellissen,禾口A.W.M.Strasser.1998.TwonovelgeneexpressionsystemsbasedontheyeastsSchwanniomycesoccidentalisandPichiastipitis.(基于西方許旺酵母和畢赤酵母的兩種新穎的基因表達(dá)系統(tǒng))Appl.Microbiol.Biotechnol.50:331-338.26.Ryabova，0·Β·，O.M.Chmil禾口A.A.Sibirny.2003.XyloseandcellobiosefermentationtoethanolbythethermotolerantmethylotrophicyeastHansenulapolymorpha.(木糖和纖維二糖由耐熱甲基營養(yǎng)型酵母多形漢遜酵母發(fā)酵為乙醇)FEMSYeastRes.4:157-164.27.Sambrook,J.，Ε·F.Fritsh，禾口Τ·Maniatis.MolecularCloning:ALaboratoryManual.(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊)ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor，NewYork.1989.28.Shigechi，H.，Y.Fujita，J.Koh,M.Uedac,H.Fukuda,禾口LKondo.2004.Energy-savingdirectethanolproductionfromlow-temperature-cookedcornstarchusingacell-surfaceengineeredyeaststrainco-displayingglucoamylaseandα-amylase.(利用共表現(xiàn)葡糖淀粉酶和α-淀粉酶的具有工程改造的細(xì)胞表面的酵母菌株由低溫蒸煮的玉米淀粉進(jìn)行節(jié)能的直接乙醇生產(chǎn))Biochem.Eng.J.18:149-153.29.Shigechi,H.，J.Koh,Y.Fujita,Τ.Matsumoto,Τ.Bito,Μ.Ueda,Ε.Satoh,H.Fukuda,禾口A.Kondo.2004.Directproductionofethanolfromrawcornstarchviafermentationbyuseofanovelsurface-engineeredyeaststraincodisplayingglucoamylaseandα-amylase.(利用共表現(xiàn)葡糖淀粉酶和α-淀粉酶的具有新穎的工程改造的表面的酵母菌株由原料玉米淀粉經(jīng)發(fā)酵進(jìn)行直接的乙醇生產(chǎn))Appl.Environ.Microbiol.70:5037-5040.30.Sohn,J.H.，Ε.S.Choi,H.Α.Kang,J.S.Rhee,Μ.0.Agaphonov,Μ.D.Ter-Avanesyan,禾口S.K.Rhee.1999.Adominantselectionsystemdesignedforcopynumber-controlledgeneintegrationinHansenulapolymorphaDL-1.(用于多形漢遜酵母DL-I中拷貝數(shù)受控的基因的整合所設(shè)計(jì)的顯性選擇系統(tǒng))ApplMicrobiolBiotechnol.51:800-807.31.Torronen，Α.，LR.Mach,R.Massner,R.Gonzales,N.Kalkkinen，A.Harkki，禾口C.P.Kubicek.1992.ThetwomajorxylanasesfromTrichodermareeseicharacterizationofbothenzymesandgenes.(:自Il^:7^白勺胃禾中1*!!:和基因的表征)Biothechnology.10:1461-1465.32.Ulgen,K.0.,andB.Saygih.2002.BioconversionofstarchintoethanolbyarecombinantSaccharomycescerevisiaestrainYPG-AB.(由重組酉良酒酵母菌株YPG-AB進(jìn)行的淀粉生成乙醇的生物轉(zhuǎn)化)ProcessBiochem.37:1157-1168.33.deVries，R.P.禾口J.Visser.2001.Asperillusenzymesinvolvedindegradationofplantcellwallpolysaccharides.(植物細(xì)胞壁多糖降解所涉及的黑曲霉的酶類)Microbiol.Mol.Biol.Rev.65:497-522.34.Wang,Τ.Τ.，L.L.Lin,禾口IH.Hsu.1989.CloningandexpressionofaSchwanniomycesoccidentalisα-amylasegeneinSaccharomycescerevisiae.(釀酒酵母中的西方許旺酵母α-淀粉酶基因的克隆和表達(dá)。)Appl.Environment.Microbiol.55:3167-3172.35.Zaldivar，J.，J.Nielsen，禾口LOlsson.2001.Fuelethanolproductionfromlignocellulose:achallengeformetabolicengineeringandprocessintegration.(由纖維木質(zhì)素生產(chǎn)燃料乙醇對于代謝工程和工藝整合的挑戰(zhàn))ApplMicrobiolBiotechnol.56:17-權(quán)利要求1.一種多形漢遜酵母(H.polymorpha)菌株，所述多形漢遜酵母菌株包含編碼α-淀粉酶的至少一種基因和編碼葡糖淀粉酶的至少一種基因，所述基因與在所述多形漢遜酵母菌株中表達(dá)所述基因的至少一種啟動(dòng)子可操作地連接，并且所述酶以充足的量自所述多形漢遜酵母菌株輸出到培養(yǎng)基中，從而允許所述多形漢遜酵母菌株在只含可溶性淀粉作為碳源的培養(yǎng)基中生長。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多形漢遜酵母菌株，其中編碼所述α-淀粉酶和葡糖淀粉酶中至少其一的基因被整合入所述多形漢遜酵母的染色體中。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多形漢遜酵母菌株，其中編碼所述α-淀粉酶和葡糖淀粉酶的所述基因中的每一種均被整合入所述多形漢遜酵母的染色體中。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多形漢遜酵母菌株，其中編碼所述α-淀粉酶或葡糖淀粉酶的所述基因中的至少一種是從西方許旺酵母Gchwanniomycesoccidentalis)菌株獲得。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多形漢遜酵母菌株，其中編碼α-淀粉酶或所述葡糖淀粉酶的所述至少一種基因還包括與所述基因可操作地連接以終止所表達(dá)的基因的轉(zhuǎn)錄的終止子。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多形漢遜酵母菌株，其中所述啟動(dòng)子包括從多形漢遜酵母獲得的HpGAP啟動(dòng)子。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多形漢遜酵母菌株，所述多形漢遜酵母菌株還包括編碼丙酮酸脫羧酶的基因，所述編碼丙酮酸脫羧酶的基因與在所述多形漢遜酵母菌株中表達(dá)所述丙酮酸脫羧酶的至少一種啟動(dòng)子可操作地連接。8.—種制造乙醇的方法，所述方法包括使權(quán)利要求1所述的多形漢遜酵母菌株在促使所述多形漢遜酵母制造乙醇的條件下生長在含可溶性淀粉的培養(yǎng)基中。9.一種多形漢遜酵母菌株，所述多形漢遜酵母菌株包含編碼木聚糖內(nèi)切酶的至少一種基因和編碼木糖苷酶的至少一種基因，所述基因與在所述多形漢遜酵母菌株中表達(dá)所述基因的至少一種啟動(dòng)子可操作地連接，并且所述酶以充足的量自所述多形漢遜酵母菌株輸出到培養(yǎng)基中，從而允許所述多形漢遜酵母菌株在只含可溶性木聚糖作為碳源的培養(yǎng)基中生長。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的多形漢遜酵母菌株，其中編碼所述木聚糖內(nèi)切酶和β-木糖苷酶中至少其一的基因被整合入所述多形漢遜酵母的染色體中。11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的多形漢遜酵母菌株，其中編碼所述木聚糖內(nèi)切酶和β-木糖苷酶的所述基因中的每一種均被整合入所述多形漢遜酵母的染色體中。12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的多形漢遜酵母菌株，其中編碼所述木聚糖內(nèi)切酶或β-木糖苷酶的所述基因中的至少一種是從選自由黑曲霉(Aspergillusniger)和里氏木霉(Trichodermareseei)所組成的組的菌株獲得。13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的多形漢遜酵母菌株，編碼所述木聚糖內(nèi)切酶或所述β-木糖苷酶的所述至少一種基因還包括與所述基因可操作地連接以終止所表達(dá)的基因的轉(zhuǎn)錄的終止子。14.根據(jù)權(quán)利要求9所述的多形漢遜酵母菌株，其中所述啟動(dòng)子包括從多形漢遜酵母獲得的HpGAP啟動(dòng)子。15.根據(jù)權(quán)利要求9所述的多形漢遜酵母菌株，所述多形漢遜酵母菌株還包括編碼丙酮酸脫羧酶的基因，所述編碼丙酮酸脫羧酶的基因與在所述多形漢遜酵母菌株中表達(dá)所述丙酮酸脫羧酶的至少一種啟動(dòng)子可操作地連接。16.一種制造乙醇的方法，所述方法包括使權(quán)利要求9所述的多形漢遜酵母菌株在促使所述多形漢遜酵母制造乙醇的條件下生長在含可溶性木聚糖的培養(yǎng)基中。17.一種多形漢遜酵母菌株，所述多形漢遜酵母菌株包含編碼α-淀粉酶的至少一種基因、編碼葡糖淀粉酶的至少一種基因、編碼木聚糖內(nèi)切酶的至少一種基因和編碼木糖苷酶的至少一種基因，每個(gè)基因都與在所述多形漢遜酵母菌株中表達(dá)所述基因的至少一種啟動(dòng)子可操作地連接，并且所述酶以充足的量自所述多形漢遜酵母菌株中輸出到培養(yǎng)基中，從而允許所述多形漢遜酵母菌株在只含可溶性淀粉或可溶性木聚糖作為碳源、或含兩者的單獨(dú)組合作為碳源的培養(yǎng)基中生長。18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的多形漢遜酵母菌株，所述多形漢遜酵母菌株還包括編碼丙酮酸脫羧酶的基因，所述編碼丙酮酸脫羧酶的基因與在所述多形漢遜酵母菌株中表達(dá)所述丙酮酸脫羧酶的至少一種啟動(dòng)子可操作地連接。19.一種制造乙醇的方法，所述方法包括使權(quán)利要求17所述的多形漢遜酵母菌株在促使所述多形漢遜酵母制造乙醇的條件下生長在含可溶性淀粉的培養(yǎng)基中。20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多形漢遜酵母菌株，其中所述α-淀粉酶基因和葡糖淀粉酶的基因中的每一種都與從多形漢遜酵母獲得的HpGAP啟動(dòng)子可操作地連接。21.—種重組核酸，所述重組核酸包含編碼α-淀粉酶的基因和編碼葡糖淀粉酶的基因中的至少一種，所述基因與從多形漢遜酵母獲得的HpGAP啟動(dòng)子可操作地連接。22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的重組核酸，其中滿足以下至少一項(xiàng)a.所述α-淀粉酶由根據(jù)SEQID.NO1的核苷酸序列編碼；b.所述α-淀粉酶具有根據(jù)SEQID.NO2的氨基酸序列；c.所述葡糖淀粉酶由根據(jù)SEQID.NO3的核苷酸序列編碼；以及d.所述葡糖淀粉酶具有根據(jù)SEQID.NO4的氨基酸序列。23.一種重組核酸，所述重組核酸包含編碼木聚糖內(nèi)切酶的基因和編碼β-木糖苷酶的基因中的至少一種，所述基因與從多形漢遜酵母獲得的HpGAP啟動(dòng)子可操作地連接。24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的重組核酸，其中滿足以下至少一項(xiàng)e.所述β-木糖苷酶由根據(jù)SEQID.NO5的核苷酸序列編碼；f.所述β-木糖苷酶具有根據(jù)SEQID.NO6的氨基酸序列；g.所述木聚糖內(nèi)切酶由根據(jù)SEQID.NO7的核苷酸序列編碼；以及h.所述木聚糖內(nèi)切酶具有根據(jù)SEQID.NO8的氨基酸序列。25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的重組核酸，其中編碼所述β-木糖苷酶和木聚糖內(nèi)切酶的所述基因還與內(nèi)源性連接于所述基因的終止子核苷酸序列可操作地連接。26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的重組核酸，其中內(nèi)源性連接于所述基因的所述終止子核苷酸序列是根據(jù)SEQIDNO9和SEQIDNO10中的至少一項(xiàng)。全文摘要在多形漢遜酵母中克隆和表達(dá)了來自酵母西方許旺酵母的分別編碼α-淀粉酶和葡糖淀粉酶的基因SWA2和GAM1。通過將SWA2基因和GAM1基因與多形漢遜酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(HpGAP)的強(qiáng)組成型啟動(dòng)子可操作地連接后整合入多形漢遜酵母的染色體中而實(shí)現(xiàn)該表達(dá)。所得轉(zhuǎn)化體獲得在包含可溶性淀粉作為唯一碳源的基本培養(yǎng)基上生長的能力，并可在高溫發(fā)酵下由淀粉生產(chǎn)乙醇，高達(dá)10g/L。編碼木聚糖內(nèi)切酶的XYN2基因是從真菌里氏木霉獲得，并且編碼β-木糖苷酶的xlnD基因是從真菌黑曲霉獲得。在HpGAP啟動(dòng)子的控制下通過將這些基因整合入多形漢遜酵母染色體中還實(shí)現(xiàn)這些基因的共表達(dá)。所得轉(zhuǎn)化體能夠在補(bǔ)充樺木木聚糖作為唯一碳源的基本培養(yǎng)基上生長。木聚糖降解酶的成功表達(dá)得到能夠在48℃將樺木木聚糖發(fā)酵為乙醇的受體菌株。另外上述基因在過表達(dá)丙酮酸脫羧酶基因的多形漢遜酵母菌株中的共表達(dá)進(jìn)一步提高乙醇生產(chǎn)量。文檔編號C12R1/01GK102112596SQ200980126030公開日2011年6月29日申請日期2009年5月6日優(yōu)先權(quán)日2008年5月6日發(fā)明者安德烈·Y·沃羅諾夫斯基,安德烈·希博尼,查爾斯·阿巴斯申請人:阿徹丹尼爾斯米德蘭德公司